李逸龍,郭藝彬,王琛,段美濤,張志強(qiáng)

(廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系,福建 廈門(mén) 361023)

目前,應(yīng)用于臨床的癌癥治療方式主要有手術(shù)、化療、放療[1]。其中化療藥物氟尿嘧啶及其衍生物(如替加氟,TF)相對(duì)于其他化療藥物心臟毒性較小,腎毒性和骨髓抑制較弱[2]。然而,氟尿嘧啶類(lèi)藥物給藥劑量較大,存在一定副作用。對(duì)氟尿嘧啶藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可以提高其抗腫瘤活性并減少副作用,進(jìn)而改善其臨床應(yīng)用[3-4]。

光動(dòng)力療法是一種新興的抗腫瘤療法,由于其非侵入性、靶向治療特性和低毒或無(wú)毒性而備受關(guān)注[5],化療藥物與光敏劑共同負(fù)載的遞藥系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)化療與光動(dòng)力治療聯(lián)合抗腫瘤效果。光動(dòng)力治療不僅可輔助化療,增強(qiáng)靶向特異性,二者協(xié)同作用還可清除殘余腫瘤細(xì)胞并抑制損傷血管的再生,能夠有效增強(qiáng)抗腫瘤效果并降低副作用[6]。但是化療藥物與光敏劑共同負(fù)載的遞藥系統(tǒng)存在一定局限性,化療藥物的突釋往往導(dǎo)致化療失敗或副作用增強(qiáng),光敏劑的突釋導(dǎo)致光毒性和光動(dòng)力治療無(wú)效[7]。國(guó)內(nèi)外研究表明通過(guò)化學(xué)鍵將化療藥物與光敏劑連接不僅可以提高藥物半衰期以增加藥效,還可實(shí)現(xiàn)藥物緩釋、按需藥物釋放、降低副作用等優(yōu)勢(shì)[8]。

焦脫鎂葉綠酸A(PPA)為第二代光敏劑,常用作光動(dòng)力治療的光敏材料。相較于第一代光敏劑,其激發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng),組織穿透性更強(qiáng),因此熒光成像效果與活性氧產(chǎn)生量都有所提高。將TF與焦PPA化學(xué)鍵合,對(duì)于PPA在增加其體內(nèi)作用時(shí)間的基礎(chǔ)上,可避免因聚集引起的熒光淬滅效果;對(duì)于TF不僅可實(shí)現(xiàn)通過(guò)激光照射控制藥物釋放,還可延長(zhǎng)其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,避免提前釋藥引起的毒副作用[9]。

兩親性聚合物自組裝形成的聚合物膠束具有內(nèi)部疏水和外部親水的核-殼結(jié)構(gòu),可同時(shí)負(fù)載親水性藥物和疏水性藥物,是抗腫瘤藥物的良載體[10]。其中聚合物材料泊洛沙姆、DSPE-PEG等中PEG結(jié)構(gòu)可增加藥物遞送系統(tǒng)在體內(nèi)的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間,常用來(lái)延長(zhǎng)所負(fù)載藥物的體內(nèi)半衰期[11];聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)不僅具有兩親性結(jié)構(gòu),不但能形成膠束負(fù)載藥物,還可有效抑制p糖蛋白外排作用,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤多藥耐藥的抑制效果[12]。雖然TF相較于其他種類(lèi)抗腫瘤藥物副作用較弱,但是仍然具有較明顯的骨髓抑制、胃腸道反應(yīng),基于化療藥物和光敏劑化學(xué)結(jié)合特點(diǎn)和聚合物膠束遞藥系統(tǒng)用于抗腫瘤藥物遞送的優(yōu)勢(shì),本研究通過(guò)Eschweiler-Clarke反應(yīng)、酸酐開(kāi)環(huán)反應(yīng)及兩步酯化合成TF-PPA前藥,并將其制備成膠束用于腫瘤化療聯(lián)合光動(dòng)力治療,實(shí)現(xiàn)降低副作用的同時(shí)增強(qiáng)抗腫瘤效果。目前已有化療藥物與光敏劑化學(xué)結(jié)合的相關(guān)研究,但是針對(duì)替加氟化學(xué)修飾研究較少,且尚無(wú)替加氟與光敏劑結(jié)合的其它研究,本研究為改善氟尿嘧啶類(lèi)化療藥物療效及降低其毒作用提供了有效解決手段與研究思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器C-MAG HS7 digital加熱磁力攪拌器(德國(guó)IKA集團(tuán));R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);LCMS-8050三重四極桿質(zhì)譜儀、LC-20AP制備液相色譜儀、LC-16高效液相色譜儀(日本島津公司);Nano ZS90激光粒度儀(英國(guó)馬爾文帕納科公司);HT7700EXALEN透射電子顯微鏡(日本日立公司);Infinite M1000 PRO酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司)。

1.2 試藥替加氟、丁二酸酐(SA)、甲醛、泊洛沙姆F68、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;焦脫鎂葉綠酸A(PPA)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;CCK-8試劑、小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司;其他試劑購(gòu)自廈門(mén)市綠茵試劑玻儀有限公司。

2 方法

2.1 替加氟-焦脫鎂葉綠酸A復(fù)合物的合成及表征通過(guò)Eschweiler-Clarke反應(yīng)將TF與甲醛連接,生成含有末端-OH結(jié)構(gòu)的TF-OH,再通過(guò)酯化反應(yīng),分別連接丁二酸酐(SA)和乙二醇(EG),生成末端含有-COOH的TF-SA和末端含有-OH的TF-SA-OH,最后,再通過(guò)酯化反應(yīng)使TF-SA-OH與PPA連接,形成含有光敏劑PPA和化療藥物TF的TF-PPA前藥。合成路徑如圖1所示。

圖1 TF-PPA合成路線

2.1.1 TF-SA的合成精密稱(chēng)取TF 2.0 g,置于厚壁耐壓瓶,加入甲醛溶液10 mL,于60 ℃油浴下反應(yīng)12 h。反應(yīng)完成后,加入甲醇旋蒸除水,每次加入50 mL直至水被完全除盡,即得羥基化替加氟衍生物TF-OH。精密稱(chēng)取TF-OH 5.40 g,以適量四氫呋喃(THF)溶解,精密稱(chēng)取丁二酸酐(SA)12.50 g,以THF溶解后滴加至TF-OH溶液中,量取三乙胺(TEA)17.50 mL,滴加至上述反應(yīng)液中,于室溫下攪拌反應(yīng)24 h,并以薄層色譜法(TLC)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)完成后,旋蒸除去溶劑,剩余物以10 mL 二氯甲烷(DCM)復(fù)溶后,以硅膠色譜柱層析分離,流動(dòng)相為甲醇∶ DCM = 1∶50 (V/V),收集目標(biāo)產(chǎn)物,合并之后旋蒸除去溶劑,得替加氟丁二酸衍生物TF-SA 3.48 g,產(chǎn)率37.24%。TF-SA的核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):12.23(s,1H,COOH),8.02(d,1H,C=CH),5.96(ddd,1H,CH),5.78(q,2H,CH2),4.27(q,1H,CH2),3.82(q,1H,CH2′),2.52(t,2H,CH2),2.46(t,2H,CH2),2.25(m,1H,CH2),2.04(m,1H,CH2′),1.93(m,2H,CH2)。

2.1.2 TF-SA-OH的合成精密稱(chēng)取TF-SA 400.0 mg,加入15 mL THF溶解。另取EDC·HCl 697.0 mg、DMAP 148.1 mg,以5 mL THF溶解后滴加至TF-SA溶液中,室溫下活化30 min后,量取乙二醇(EG)5.0 mL,加入至反應(yīng)溶液中,于30 ℃下反應(yīng)24 h,TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度。反應(yīng)完成后,旋蒸除去溶劑,以10 mL DCM復(fù)溶,以硅膠色譜柱層析分離,流動(dòng)相比例為甲醇∶DCM=1∶50(V/V),合并目標(biāo)產(chǎn)物有機(jī)相,旋蒸除去溶劑,得TF-SA-OH 298.9 mg,產(chǎn)率為65.93%。TF-SA-OH核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6):8.02(d,1H,C=CH),5.95(ddd,1H,CH),5.78(q,2H,CH2),4.78(t,1H,OH),4.26(q,1H,CH2),4.01(t,2H,CH2),3.82(q,1H,CH2′),3.55(q,2H,CH2),2.57(dt,4H,CH2and CH2),2.26(m,1H,CH2),2.05(m,1H,CH2′),1.93(m,2H,CH2)。

2.1.3 替加氟-焦脫鎂葉綠酸A的合成精密稱(chēng)取PPA 200.0 mg,以二甲基亞砜(DMSO)1.5 mL溶解,避光備用。精密稱(chēng)取EDC·HCl 408.8 mg,DMAP 86.9 mg,以DCM溶解后加入至PPA溶液中,室溫下避光孵育30 min。精密稱(chēng)取TF-SA-OH 531.9 mg,以DCM溶解后加入至上述反應(yīng)液,室溫下避光反應(yīng)24 h,以TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度,待反應(yīng)結(jié)束后,旋蒸除去溶劑,以5 mL DCM復(fù)溶后,以硅膠色譜柱層析分離,流動(dòng)相比例為甲醇∶DCM=1∶200(V/V),收集目標(biāo)產(chǎn)物有機(jī)相,合并后旋蒸除去有機(jī)溶劑后,再以乙腈將粗產(chǎn)物溶解,使用制備液相進(jìn)行純化,流動(dòng)相比例為乙腈∶水(97∶3),流速:15 mL·min-1,制備柱:Inspire HILIC (21.2 mm × 250 mm,5 μm),波長(zhǎng):271 nm和400 nm。收集含目標(biāo)產(chǎn)物的流動(dòng)相,合并后旋蒸除去乙腈,經(jīng)凍干后得到TF-PPA粉末,產(chǎn)率15.3%。TF-PPA的核磁歸屬如下:1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ 9.71(d,1H,PPA),9.43(d,2H,PPA),8.89(s,1H,PPA),8.26-8.16(m,1H,PPA),7.94-7.84(m,1H,TF),6.38(d,1H,PPA),6.21(d,2H,PPA),5.75(s,1H,TF),5.75(s,1H,TF),5.52(q,2H,PPA),5.25-5.08(m,1H,TF),4.58(d,2H,TF),4.33(d,2H,TF),4.24-4.12(m,2H,PPA),3.69(d,2H,TF),3.60(s,3H,PPA),3.43(s,4H,TF),3.29(d,1H,PPA),3.21(d,3H,PPA),2.70-2.61(m,2H,PPA),2.40(d,2H,PPA),2.11(s,3H,TF),1.90(s,1H,TF),1.77(d,6H,TF),1.61(s,3H,PPA),0.23(s,2H,PPA)。

2.2 TF-PPA膠束的制備及測(cè)定

2.2.1 膠束的制備采用溶劑揮發(fā)法制備載藥膠束:精密稱(chēng)取DSPE-PEG 10.0 mg、維生素E琥珀酸酯 5.0 mg、泊洛沙姆 F68 15.0 mg,TF-PPA 6.0 mg,溶于3 mL無(wú)水乙醇,逐滴滴加至20 mL 60 ℃的去離子水中,避光攪拌24 h,至無(wú)水乙醇完全揮發(fā),既得TF-PPA載藥膠束溶液。

2.2.2 粒徑和ζ電位的測(cè)定以馬爾文激光粒度儀對(duì)所制備的膠束進(jìn)行粒徑和ζ電位進(jìn)行測(cè)定:吸取膠束溶液1 mL,以去離子水稀釋至濃度為1 mg·mL-1,取稀釋后的溶液1 mL,置于樣品測(cè)定池內(nèi),以馬爾文激光粒度儀進(jìn)行掃描測(cè)定。

2.2.3 形貌學(xué)表征以透射電子顯微鏡對(duì)所制備的載藥膠束進(jìn)行成像分析,具體如下:取TF-PPA載藥膠束1滴,加入磷鎢酸染液適量染色15 min后,滴于銅網(wǎng),自然晾干后,使用透射電鏡對(duì)膠束微觀形態(tài)觀測(cè)并拍攝記錄。

2.3 體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 體外釋藥研究按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備TF膠束,取TF膠束、TF-PPA膠束(2份),置于1 000 kDa透析袋內(nèi),并向其中加入5 mL pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。將透析袋浸入30 mL磷酸鹽緩沖液中并開(kāi)始計(jì)時(shí)。為考察激光照射條件下TF-PPA膠束產(chǎn)生的活性氧對(duì)藥物釋放的影響,使用660 nm激光器對(duì)激光照射組進(jìn)行照射(660 nm,150 mW·cm-2),激光器工作模式為連續(xù)模式,每次照射5 min,分別于1、12、36、60 h進(jìn)行激光照射。分別于1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h取1 mL釋放介質(zhì)并補(bǔ)充空白釋放介質(zhì),于12 000 r·min-1離心10 min后,取20 L上清液使用HPLC檢測(cè)。

2.3.2 體外抗腫瘤活性研究將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞以胰酶消化,離心除去培養(yǎng)基,將細(xì)胞重懸于3 mL培養(yǎng)基內(nèi),取20 μL細(xì)胞懸液,以臺(tái)盼藍(lán)染色并以細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞濃度。將計(jì)數(shù)后的細(xì)胞稀釋至2 × 104mL-1,以每孔100 μL接種于96孔板,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。將細(xì)胞分為空白組(含培養(yǎng)基,不含細(xì)胞);對(duì)照組(含細(xì)胞和培養(yǎng)基)和實(shí)驗(yàn)組(含細(xì)胞、培養(yǎng)基、藥物),除去培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入200 μL以完全培養(yǎng)基稀釋的TF膠束溶液、TF-PPA膠束溶液、TF-PPA膠束溶液+660 nm激光照射(30 mW·cm-2,100 s)(按照負(fù)載TF計(jì)濃度為0.015、0.15、0.75、1.5、15、75、150 g·mL-1),其他各組加入200 μL空白培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后向每孔加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后以酶標(biāo)儀于450 nm下測(cè)定吸光度值。并按照公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

(1)

其中Ae為實(shí)驗(yàn)組吸光度;Ab為空白組吸光度;Ac為對(duì)照組吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 TF-PPA的合成結(jié)構(gòu)確證圖2為T(mén)F-PPA的1H-NMR圖譜。如圖2所示,芳香區(qū)同時(shí)出現(xiàn)了PPA的特征峰(8.89、9.43、9.71 ppm)和TF-SA-EG的特征峰(7.90 ppm),在脂肪區(qū)同時(shí)出現(xiàn)了PPA的特征峰(3.60、4.24ppm)和TF-SA-EG的特征峰(3.69、3.43、2.11、1.90、1.77 ppm)且其積分相對(duì)應(yīng)。譜圖中同時(shí)還存在PPA的特征峰 6.21 ppm和6.38 ppm以及TF的特征峰 5.75、5.25 ppm,說(shuō)明TTP的成功合成。

圖2 TF-PPA核磁共振氫譜圖

3.2 膠束制備及測(cè)定

3.2.1 粒徑和電位由于腫瘤組織部位血管形成速度較快,血管致密性和完整性較差,存在50～400 nm孔隙,當(dāng)一定粒徑范圍內(nèi)納米粒子經(jīng)過(guò)該血管部位后,會(huì)通過(guò)血管孔隙而到達(dá)腫瘤部位,并滯留在腫瘤部位,形成高滲透和長(zhǎng)滯留(EPR)效應(yīng)。所制備的膠束粒徑為143.9 nm,可通過(guò)EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)藥物遞送系統(tǒng)的被動(dòng)靶向效果。

所制備的納米膠束ζ電位為-5.04 mV,為負(fù)電位,與血液電性一致,因此有利于保持膠束溶液在給藥后的穩(wěn)定性。

3.2.2 透射電鏡如圖3所示,所制備膠束粒徑在100～200 nm之間,粒徑較為均一,與馬爾文激光粒度儀測(cè)定結(jié)果一致,該載藥膠束溶液可通過(guò)EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的被動(dòng)靶向效果。

圖3 TF-PPA膠束透射電鏡圖

3.3 體外藥效學(xué)

3.3.1 體外釋藥研究TF半衰期僅為2.6 h[13],將TF與PPA連接并負(fù)載于膠束體系后,可通過(guò)緩慢釋藥和酯鍵的斷裂釋放TF,延長(zhǎng)TF的釋放時(shí)間進(jìn)而延長(zhǎng)TF作用時(shí)間。TF-PPA膠束在未經(jīng)激光照射的釋放介質(zhì)中釋放較為緩慢,72 h內(nèi)累積釋放量為70.33%,而經(jīng)激光照射后釋放加速,72 h內(nèi)釋放82.50%。釋放介質(zhì)中加入了10 mmoL·L-1的H2O2(腫瘤微環(huán)境活性氧濃度約為10 mmoL·L-1),其產(chǎn)生的ROS促進(jìn)了TF從TF-PPA的解離,使TF-PPA即使在無(wú)激光照射條件下也可較快斷裂酯鍵進(jìn)而釋放TF。經(jīng)激光照射后,TF-PPA自身產(chǎn)生一定量的ROS,具有自我促進(jìn)ROS響應(yīng)性釋藥特點(diǎn),激光照射產(chǎn)生的ROS在前藥微環(huán)境體系內(nèi)促進(jìn)酯鍵斷裂,因此進(jìn)一步加速了藥物的釋放。

3.3.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)PPA、TF-PPA可以在激光照射下產(chǎn)生能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的ROS,從而可以加速激光照射下的藥物釋放。因此本文研究了TF-PPA膠束在激光照射和非激光照射下的細(xì)胞毒性。選擇替加氟膠束作為對(duì)照品對(duì)載藥膠束體外抗腫瘤能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

如圖4和表1所示,TF-PPA膠束對(duì)4T1細(xì)胞的毒性較替加氟膠束強(qiáng),且為濃度依賴(lài)性,當(dāng)TF濃度為150 μg·mL-1時(shí),替加氟膠束、TF-PPA膠束、TF-PPA膠束+激光照射與4T1細(xì)胞共孵育24 h后的細(xì)胞存活率分別為31.56%±2.64%、20.74%±1.39%、2.11%±0.50%。TF-PPA可在細(xì)胞內(nèi)代謝為T(mén)F、甲醛和PPA,TF和甲醛具有協(xié)同的化療作用[14],因此增加了細(xì)胞毒性。相同給藥濃度下,激光照射組TF-PPA膠束較非激光照射組膠束細(xì)胞毒性較強(qiáng),說(shuō)明激光照射促進(jìn)ROS的產(chǎn)生,產(chǎn)生的ROS與釋放的TF共同作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡,因此在激光照射下,TF-PPA可以發(fā)揮PDT和化療的協(xié)同抗腫瘤作用,從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表1 TF、TF-PPA、TF-PPA+激光照射組IC50值

圖4 TF、TF-PPA、TF-PPA+激光照射組細(xì)胞存活率

4 結(jié)論

本研究合成了替加氟和光敏劑焦脫鎂葉綠酸A的綴合物前藥,并將其制備成載藥膠束。所制備的膠束粒徑為143.9 nm,可實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)給藥后的腫瘤部位被動(dòng)靶向效果,ζ電位為-5.04 mV,可保證其在血液中保持膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。體外釋藥與抗腫瘤試驗(yàn)結(jié)果表明,TF-PPA膠束可緩慢釋藥,且激光照射可促進(jìn)TF的釋放,在激光照射下TF-PPA可發(fā)揮光動(dòng)力治療與化療協(xié)同抗腫瘤作用。激光照射下的TF-PPA具有以下優(yōu)點(diǎn):①光動(dòng)力促進(jìn)TF的釋放;②TF-OH在細(xì)胞內(nèi)的代謝產(chǎn)物具有協(xié)同化療作用;③化療和PDT協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

總之,TF-PPA膠束可通過(guò)緩慢釋藥、激光照射加速釋藥、被動(dòng)靶向至腫瘤部位等特性效提抗腫瘤活性并降低對(duì)正常組織的副作用。本研究將為化療藥物與光敏劑的偶聯(lián)以降低化療藥物毒性并增強(qiáng)抗腫瘤效果提供科研依據(jù)和參考。