王 瀟, 徐德均, 朱斌健, 徐俊延, 敖國(guó)紅, 張長(zhǎng)禹, 韓開(kāi)宇

(1. 貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司畢節(jié)卷煙廠, 畢節(jié) 551700; 2. 貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所, 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550025; 3. 貴州翰髙煙葉病蟲(chóng)害防治中心, 貴陽(yáng) 550009)

溫度是影響昆蟲(chóng)生存、行為、生物學(xué)、生理學(xué)和種群動(dòng)態(tài)的最重要的環(huán)境因素之一(Paimetal., 2016; Sarkar and Barik 2017; Abarca and Spahn, 2021)。極端溫度脅迫(熱和冷)可能導(dǎo)致昆蟲(chóng)發(fā)育歷期延長(zhǎng)、壽命縮短和繁殖力降低等(Rwomushanaetal., 2008; Ross-Gillespieetal., 2018; Pumhanetal., 2020)。為了抵消由于環(huán)境高溫或低溫暴露而造成的損害,昆蟲(chóng)已經(jīng)進(jìn)化出各種行為和生理適應(yīng)(Storey, 1997; Wang and Kang, 2005)。增強(qiáng)抗氧化酶活性被廣泛認(rèn)為是提高昆蟲(chóng)對(duì)溫度脅迫耐受性的重要的策略之一(Zhangetal., 2015; Kangetal., 2017)。

溫度脅迫可導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平升高,從而對(duì)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷(Lopez-Martinezetal., 2008; Yangetal., 2021)。為了避免ROS損傷,昆蟲(chóng)生活過(guò)程中進(jìn)化出各種抗氧化酶參與氧化損傷反應(yīng)(Yangetal., 2010; Chenetal., 2018)。在昆蟲(chóng)中,抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)(Felton and Summers, 1995; 李貝貝等, 2021)。SOD作為昆蟲(chóng)抵御氧化應(yīng)激的第一道防線,是目前唯一發(fā)現(xiàn)可以特定功能清除昆蟲(chóng)體內(nèi)多余氧自由基的抗氧化酶,主要通過(guò)催化歧化反應(yīng)將ROS生成O2和H2O2,保護(hù)氧代謝組織細(xì)胞免受超氧化物自由基的氧化損傷(Mengetal., 2009; Wangetal., 2018; 王云, 2022)。例如,荒漠甲蟲(chóng)小胸鱉甲Microderapunctipennis在極端溫度脅迫下,其體內(nèi)SOD1,SOD2和SOD3的表達(dá)量顯著升高,表明3種SOD基因響應(yīng)極端溫度脅迫中發(fā)揮了重要的作用(Xikeranmuetal., 2019);廣聚螢葉甲Ophraellacommuna卵和幼蟲(chóng)在高溫42 ℃脅迫下,其體內(nèi)SOD酶活性均顯著升高(Chenetal., 2018);煙粉虱Bemisiatabaci成蟲(chóng)在低溫4 ℃脅迫1 h,其體內(nèi)SOD酶活性顯著升高(Lietal., 2011)。

嗜卷書(shū)虱Liposcelisbostrychophila隸屬于嚙蟲(chóng)目(Psocoptera)書(shū)虱科(Liposcelididae)書(shū)虱屬Liposcelis,是一種重要的世界性儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)(Nayaketal., 2014)。近年來(lái), 嗜卷書(shū)虱對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)系統(tǒng)中的熱處理產(chǎn)生了較高的耐受性(Wangetal., 2000; Miaoetal., 2020)。例如,嗜卷書(shū)虱卵期對(duì)溫度的耐受性最強(qiáng),需在46 ℃持續(xù)>35 h才可以殺死卵(Beckettetal., 2003)。然而,目前關(guān)于嗜卷書(shū)虱對(duì)極端溫度耐受性的分子機(jī)制尚不完全清楚。盡管Miao等(2020)研究發(fā)現(xiàn),嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)體內(nèi)SOD酶活性在高溫42.5 ℃脅迫2 h顯著升高,但未從mRNA水平開(kāi)展相關(guān)研究。因此,本研究通過(guò)克隆嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD并分析其序列特征,檢測(cè)這3個(gè)基因在高低溫脅迫下的表達(dá)變化,揭示SOD基因在響應(yīng)溫度脅迫中的作用,為探究嗜卷書(shū)虱響應(yīng)極端溫度脅迫的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ),并為科學(xué)制定這種害蟲(chóng)熱處理應(yīng)用的防治策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

本研究使用的嗜卷書(shū)虱蟲(chóng)源采自貴州畢節(jié)市卷煙廠煙葉倉(cāng)庫(kù)內(nèi),在黑暗的人工氣候箱內(nèi)用煙葉飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度(28±1) ℃和相對(duì)濕度80%±5%。取1日齡成蟲(chóng),分別置于42和4 ℃條件下處理0(CK), 1和2 h,每個(gè)處理30頭蟲(chóng),3次生物學(xué)重復(fù),試驗(yàn)期間相對(duì)濕度為80%±5%。所有樣品處理后,采用液氮速凍,并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 嗜卷書(shū)虱總RNA提取和cDNA的合成

采用Eastp?Super Total RNA Extraction Kit (Promega, 上海)提取1.1節(jié)嗜卷書(shū)虱總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。以提取的高質(zhì)量總RNA為模板,按照反轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA Synthesis Kit (CWBIO, 泰州)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA第1鏈合成。

1.3 嗜卷書(shū)虱Cu/Zn-SOD1, Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD的克隆

基于嗜卷書(shū)虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)對(duì)Cu/Zn-SOD1,Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1),以合成的cDNA為模板擴(kuò)增嗜卷書(shū)虱SOD基因中間片段。PCR反應(yīng)體系(25 μL): Premix Taq (Ex Taq Version 2.0 Plus Dye)酶(1.25 μmol/25 μL)(TaKaRa, 大連) 12.5 μL, cDNA模板(200 ng/μL) 1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 94 ℃30 s, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,用SanPrep Column PCR Product Purification Kit (Sangon Biotech, 上海)純化回收目的片段, 連接到克隆載體pMDTM19-T(TaKaRa, 大連)上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Escherichiacoli感受態(tài)細(xì)胞DH5α (TaKaRa, 大連)中,使用含Amp抗生素的LB平板進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng),挑選單一菌落做菌落PCR檢測(cè)并測(cè)序(上海生工)。

表1 引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 8. 0對(duì)克隆片段序列進(jìn)行拼接,經(jīng)NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的Blast工具進(jìn)行同源序列檢索確認(rèn)后獲得基因的全長(zhǎng)序列;利用ORF Finder(http:∥www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/gorf/)查找嗜卷書(shū)虱Cu/Zn-SOD1,Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD基因完整的開(kāi)放閱讀框;用DNAMAN推導(dǎo)編碼蛋白氨基酸序列;使用ExPASy ProtParam (http:∥www.expasy.org/tools/protparam.html)、KinasePhos和ScanProsite對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測(cè);應(yīng)用MEGA 6.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 嗜卷書(shū)虱Cu/Zn-SOD1, Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD高低溫脅迫下的表達(dá)分析

取1.1節(jié)處理的嗜卷書(shū)虱分別提取總RNA,去基因組DNA后并反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù),以β-actin和α-tub為內(nèi)參基因,采用RT-qPCR分析不同處理下嗜卷書(shū)虱Cu/Zn-SOD1,Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD的表達(dá)量變化。采用TB GreenPremix Ex Taq (TaKaRa, 大連)染料進(jìn)行RT-qPCR,引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板(100 ng/μL)1 μL, TB Green Premix Ex Taq 10 μL, ROX Reference Dye 0.4 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 6.6 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃30 s; 95 ℃5 s, 55 ℃30 s, 40個(gè)循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt法對(duì)嗜卷書(shū)虱3個(gè)SOD基因的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。采用SPSS 22.0軟件中的Tukey氏檢驗(yàn)法對(duì)高低溫脅迫下數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 嗜卷書(shū)虱Cu/Zn-SOD1, Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD基因克隆與序列

克隆測(cè)序得到3個(gè)SOD基因(LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD) cDNA序列長(zhǎng)度分別為995, 724和667 bp,GenBank登錄號(hào)分別為OQ938782, OQ938783和OQ938784。LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD的開(kāi)放閱讀框(ORF)分別長(zhǎng)465, 630和636 bp,分別編碼154, 209和211個(gè)氨基酸。編碼蛋白相對(duì)分子量分別為15.85, 22.33和23.72 kD,等電點(diǎn)分別為6.17, 7.68和6.79,分子式分別為 C679H1082N208O221S, C1007H1560N276O284S8和C1074H1599N299O300S7;N端氨基酸均為蛋氨酸(M, Met),推測(cè)的蛋白質(zhì)半衰期均為30 h;含有帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)分別為17, 15和23個(gè),帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)分別為13, 16和22個(gè);穩(wěn)定性系數(shù)分別為22.84, 36.00和27.42,即3種蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定;總平均疏水指數(shù)(grand average hydrophobicity index, GRAVY)分別為-0.318, -0.043和-0.392,表明這些蛋白均為疏水性蛋白質(zhì);脂肪族氨基酸指數(shù)分別為77.27, 88.66和72.75。亞細(xì)胞定位分析表明,LbCu/Zn-SOD1為細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核型,LbCu/Zn-SOD2為細(xì)胞質(zhì)型,LbFe/Mn-SOD為線粒體型。利用ScanProsite工具進(jìn)行的氨基酸分析表明,LbCu/Zn-SOD1具有1個(gè)Cu/Zn超氧化物歧化酶特征,即GNAGARAACGVI(第138-149位殘基);LbCu/Zn-SOD2具有2個(gè)Cu/Zn超氧化物歧化酶特征,即GFHIHQNGSVA(第95-105位殘基)和GNAGKRLACCVI (第191-202位殘基);LbFe/Mn-SOD具有1個(gè)Fe/Mn超氧化物歧化酶特征,即DVWEHAYY(第163-170位殘基)。

2.2 嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1, LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD系統(tǒng)進(jìn)化

序列相似性分析表明,嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2分別與嗜蟲(chóng)書(shū)虱LiposcelisentomophilaCu/Zn-SOD (GenBank登錄號(hào): QMS47489.1)和Cu/Zn-SOD(GenBank登錄號(hào): QMS47508.1)的氨基酸序列一致性最高,分別達(dá)到90.26%和77.42%;而LbFe/Mn-SOD在其他同源昆蟲(chóng)中未檢索到。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示,3種SOD蛋白各聚為一支,其中LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2又分別以昆蟲(chóng)目為單位聚類,該聚類結(jié)果與昆蟲(chóng)學(xué)上的傳統(tǒng)分類一致。從目以下的分類階元來(lái)看,同一目的分支下又包含一些亞分支,同一亞分支中的昆蟲(chóng)親緣關(guān)系較近,表明Cu/Zn-SOD1和Cu/Zn-SOD2的聚類結(jié)果能較好地反映昆蟲(chóng)種間的親緣關(guān)系(圖1)。

圖1 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的昆蟲(chóng)Cu/Zn-SOD1, Cu/Zn-SOD2和Fe/Mn-SOD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 高溫脅迫下嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1, LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量

在42 ℃高溫脅迫下,嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)中LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著升高(P<0.05),且都在1 h時(shí)達(dá)到最高,分別為對(duì)照的2.90和1.86倍;而LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量在42 ℃處理1 h時(shí)與對(duì)照相比顯著降低(P<0.01),在2 h時(shí)與對(duì)照相比顯著升高(P<0.001),為對(duì)照的7.09倍(圖2)。

圖2 不同時(shí)長(zhǎng)42 ℃高溫脅迫下嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)中LbCu/Zn-SOD1 (A), LbCu/Zn-SOD2(B)和LbFe/Mn-SOD(C)的相對(duì)表達(dá)量

2.4 低溫脅迫下嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1, LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量

在4 ℃低溫脅迫下,與對(duì)照相比,嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)中LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2的表達(dá)量在1 h時(shí)均無(wú)顯著差異(P>0.05),在2 h時(shí)的表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),分別為對(duì)照的2.24和1.61倍;而LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量在4 ℃處理1 h時(shí)與對(duì)照相比顯著降低(P<0.05),在2 h時(shí)與對(duì)照相比顯著升高(P<0.001),為對(duì)照的2.85倍(圖3)。

圖3 不同時(shí)長(zhǎng)4 ℃低溫脅迫下嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)中LbCu/Zn-SOD1(A), LbCu/Zn-SOD2(B)和LbFe/Mn-SOD(C)的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)進(jìn)化出適應(yīng)惡劣環(huán)境條件的策略,包括極端溫度。SODs作為昆蟲(chóng)體內(nèi)普遍存在的抗氧化酶,在昆蟲(chóng)應(yīng)對(duì)各種環(huán)境脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Mengetal., 2009; Yangetal., 2010; Wangetal., 2018)。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆得到嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD,這3種基因編碼的蛋白均包含Cu/Zn或Fe/Mn超氧化物歧化酶特征,且嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2基因編碼蛋白序列均與嗜蟲(chóng)書(shū)虱已知的Cu/Zn-SOD蛋白序列同源性最高,系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中親緣關(guān)系最近(圖1),表明嗜卷書(shū)虱體內(nèi)LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2蛋白均為SOD蛋白家族成員且序列高度保守,與中華蜜蜂Apisceranacerana(劉俊峰等, 2012)和荻草谷網(wǎng)蚜Sitobionmiscanthi(劉志偉等, 2023)等昆蟲(chóng)體內(nèi)SOD蛋白的研究結(jié)果一致。此外,本研究中所鑒定的LbFe/Mn-SOD在其他同源昆蟲(chóng)中均未發(fā)現(xiàn)有該基因。由此,推測(cè)LbFe/Mn-SOD基因可能為嗜卷書(shū)虱所特有的基因,其原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)ROS的水平升高,而昆蟲(chóng)在進(jìn)化過(guò)程中已形成完整的活性氧清除機(jī)制(Lopez-Martinezetal., 2008)。SOD作為昆蟲(chóng)抵御氧化應(yīng)激的第一道防線,通過(guò)催化歧化反應(yīng)清除昆蟲(chóng)體內(nèi)多余的ROS,從而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷(Mengetal., 2009; Parketal., 2009; Wangetal., 2018)。在本研究中,嗜卷書(shū)虱成蟲(chóng)在高溫42 ℃暴露1和2 h均觀察到體內(nèi)LbCu/Zn-SOD1和LbCu/Zn-SOD2的表達(dá)量顯著升高,并在1 h時(shí)達(dá)到最大值。而LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量在高溫暴露1 h時(shí)顯著降低, 2 h時(shí)顯著升高(圖2)。這些結(jié)果表明,SOD基因的表達(dá)量升高可能是嗜卷書(shū)虱克服高溫誘導(dǎo)的超氧陰離子毒性的適應(yīng)性反應(yīng)。我們的結(jié)果與暴露于熱脅迫下的龜紋瓢蟲(chóng)Propylaeajaponica、粘蟲(chóng)Mythimnaseparata、橘小實(shí)蠅Bactroceradorsalis和黃瓜新小綏螨Neoseiuluscucumeris的研究結(jié)果(Zhangetal., 2014; Alietal., 2017; Caietal., 2019; Pumhanetal., 2020)部分一致。因此,我們推測(cè)LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD在嗜卷書(shū)虱對(duì)熱脅迫的響應(yīng)中起著重要作用。

低溫脅迫作為昆蟲(chóng)生活環(huán)境中不可避免的環(huán)境因子,同樣會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)ROS水平升高(Choietal., 2006)。昆蟲(chóng)為了能夠在低溫脅迫這種不良環(huán)境下消除過(guò)量ROS的傷害,其體內(nèi)SOD基因表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著變化(Kimetal., 2005; Gaoetal., 2013; Gaoetal., 2015)。例如,在低溫脅迫下煙粉虱、西方蜜蜂Apismellifera、亞洲蜜蜂A.cerana、美國(guó)白蛾Hyphantriacunea和中華蜜蜂等昆蟲(chóng)體內(nèi)SOD基因的表達(dá)量均顯著升高(Kimetal., 2010; Lietal., 2011; Kooetal., 2016; 夏振宇等, 2019)。在本研究中,也發(fā)現(xiàn)嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD的表達(dá)量在低溫4 ℃暴露2 h時(shí)均顯著升高(圖3),表明3個(gè)SOD基因可能在低溫脅迫條件下發(fā)揮清除ROS的作用,從而提高了嗜卷書(shū)虱低溫脅迫的耐受性。

綜上所述,本研究克隆得到了嗜卷書(shū)虱LbCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD,通過(guò)體內(nèi)表達(dá)量分析認(rèn)為L(zhǎng)bCu/Zn-SOD1,LbCu/Zn-SOD2和LbFe/Mn-SOD基因可能在嗜卷書(shū)虱響應(yīng)高低溫脅迫中起著重要作用,為后續(xù)通過(guò)RNAi或基因敲除等技術(shù)探究基因的功能提供了線索,并為明確高低溫脅迫下嗜卷書(shū)虱體內(nèi)生理生化變化機(jī)制提供了理論依據(jù)。