邢宇凡，白淑錦，金日天，3，翁武銀，3，丁能水，張志剛，楊 燊，3*

（1 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021 2 廈門銀祥集團(tuán)有限公司 肉食品安全生產(chǎn)技術(shù)國家重點實驗室 福建廈門361100 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 大連工業(yè)大學(xué) 遼寧大連116034 4 福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司 福建省生豬營養(yǎng)與飼料重點實驗室 福建漳州 363000）

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽細(xì)菌，主要存在于魚、蝦、貝類等水產(chǎn)動物以及腌菜、咸肉和咸鴨蛋等高鹽食品中[1]。它是一種常見的食源性病原體，可引發(fā)腹瀉、嘔吐、頭痛、腹部痙攣等病癥[2]。此外，它還可以形成保護(hù)宿主的生物膜，從而對抗生素產(chǎn)生耐藥性[1，3]。發(fā)掘更安全、有效的抑菌劑至關(guān)重要。

抗菌肽是一種具有廣泛抑菌活性的陽離子多肽，可對病原體進(jìn)行多靶點破壞，如通過靜電作用破壞細(xì)胞膜，作用于核酸，從而影響DNA、RNA 以及蛋白質(zhì)的合成等[4]，且不易產(chǎn)生耐藥性，被認(rèn)為是抗生素的一種良好替代品[5-6]。副干酪乳桿菌作為乳酸菌的一種，具有抗腫瘤、抗炎、改善和調(diào)節(jié)腸道菌群等生物活性[7]。其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的細(xì)菌素，能有效抑制食源性致病菌，可應(yīng)用于熱敏性食品的冷鏈運輸保鮮[8-9]。如從副干酪乳桿菌FX-6中分離出細(xì)菌素F1，其對細(xì)菌和真菌均具有較好的抑菌活性，可以通過增加細(xì)菌膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏，干擾細(xì)胞中基因組DNA，從而完成殺菌作用[10]。

本研究采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定副干酪乳桿菌發(fā)酵液小分子多肽序列，通過生物信息學(xué)篩選出可能具有抑菌活性的氨基酸序列，合成后研究其對副溶血性弧菌的抑菌活性及機理，以期為副溶血性弧菌的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）由福建省微生物與酶工程重點實驗室提供，MRS 培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂，廈門蘭博利德生物技術(shù)有限公司；TIANamp Bacteria DNA Kit 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302），北京天根生化科技有限公司。

核酸染料10×DNA 上樣緩沖液，北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），廈門泰京生物技術(shù)有限公司；鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，上海麥克林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷，上?？蒲派锛夹g(shù)有限公司；Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·2H2O、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、MgSO4、乳糖、CaCl2、冰醋酸、乙二胺四乙酸、NaOH、戊二醛溶液，西隴化工股份有限公司。

M9 培養(yǎng)基：200 mL M9 鹽溶液（5×）（64 g Na2HPO4·7H2O+15 g KH2PO4+2.5 g NaCl+5.0 g NH4Cl，用去離子水定容至1 000 mL），2 mL 1 mol/L MgSO4，20 mL 乳糖（20%），0.1 mL 1 mol/L CaCl2，用去離子水定容至1 000 mL。

50×TAE：24.2 g Tris，5.71 mL 冰醋酸，10 mL 0.5 mol/L EDTA，用NaOH 調(diào)至pH=8.0，加水定容至100 mL。

0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）：61 mL 0.01 mol/L Na2HPO4·7H2O+39 mL 0.01 mol/L NaH2PO4·2H2O。

1.2 儀器與設(shè)備

湘儀H1650-W 高速臺式離心機，湖南湘儀離心機有限公司；H-7650 透射電鏡，日本日立有限公司；Nanodrop 1000 超微量分光光度計，美國Nanodrop 公司；C400 凝膠成像系統(tǒng)，美國Azure Biosystems 有限公司；Synergy HIMF 多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；Nano Acquity UPLC system、Thermo Scientific Q-Exactive，美國Waters公司；Chirascan V100 圓二色譜儀，美國Applied Photophysice Ltd 公司。

1.3 方法

1.3.1 副干酪乳桿菌發(fā)酵液的質(zhì)譜分析 -20 ℃保存的副干酪乳桿菌按照1%的接種量接種于20 mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)2 d 后煮沸10 min 置于離心管中，3 000 r/min 離心5 min進(jìn)行固液分離，上清液用超濾膜截留分子質(zhì)量為3 000 u 以下的多肽，于-20 ℃保存。利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對多肽的氨基酸序列進(jìn)行鑒定，色譜采用長度25 cm，內(nèi)徑75 μm 的分析色譜柱，流動相A 為0.1%的甲醇水溶液，流動相B為乙腈，進(jìn)樣5 μL 在超高效液相色譜進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件如表1 所示。采用翹氣速率：40 mL/min，輔助氣速率：10 mL/min，噴霧電壓：3.0 kV，毛細(xì)管溫度：300 ℃，S-lens：50%的條件下用高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。其中一級掃描分辨率為70 000，掃描范圍為350～1 600 m/z；二級掃描分辨率為17 500，動態(tài)消除10.0 s。最后將質(zhì)譜結(jié)果用搜庫軟件（MAXQUANT v1.6.5.0）搜乳酸菌庫，蛋白質(zhì)對比后得到副干酪乳桿菌肽段序列。

表1 液相色譜的梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution procedure of liquid chromatography

1.3.2 抗菌肽的篩選 得到的肽段序列利用在線軟件APD3（https：//aps.unmc.edu/）計算多肽的電荷數(shù)和疏水率，使用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測多肽的三維結(jié)構(gòu)，隨后用軟件Pymol 2.0 對抗菌肽的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行編輯。多肽由北京中科亞光生物科技有限公司采用固相法合成，使用Agela C18 柱進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）純化，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/ESI）測定多肽的純度和分子質(zhì)量。

1.3.3 最低殺菌質(zhì)量濃度的測定（MBC）副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種于20 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)8 h 后，用無菌的0.01 mol/L PBS（pH 7.2）分別將其稀釋至4.82～4.96 lg CFU/mL。將肽分別稀釋至1 000，500，250，125，62.5 μg/mL 后，取等量的肽與菌液混和于37 ℃孵育2 h 后，取20 μL 均勻涂布于平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計數(shù)。設(shè)置等量的PBS 與菌液混合作為對照組，試驗重復(fù)3 次取平均值。

1.3.4 時間-殺菌曲線分析 培養(yǎng)至對數(shù)期的副溶血性弧菌用0.01 mol/L PBS（pH 7.2）稀釋至4.82～4.96 lg CFU/mL，將等量多肽和菌液混合至最終質(zhì)量濃度為125 μg/mL（1×MBC）。在0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h 分別取20 μL 菌懸液，在營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基中均勻涂布，37 ℃培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計數(shù)。以等量的PBS 和菌液混合為對照，試驗重復(fù)3 次取平均值。

1.3.5 膜通透性的測定 通過測量副溶血性弧菌細(xì)胞質(zhì)β-半乳糖苷酶產(chǎn)生的鄰硝基苯酚水平，來確定細(xì)菌的膜通透性變化。首先，在LB 培養(yǎng)基中將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)期，再將菌液離心（10 000 r/min，1 min）后重懸至20 mL M9 培養(yǎng)基中，搖床（200 r/min）培養(yǎng)直到OD600nm＞0.4。最后，在96 孔板中加入菌液100 μL，0.5 mg/mL 鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）10 μL 以及不同質(zhì)量濃度的 肽100 μL（0，0.5×MBC，1×MBC，2×MBC，4×MBC），每隔1 h 用酶標(biāo)儀測量其在波長420 nm下的吸光度。

1.3.6 透射電鏡 將副溶血性弧菌培養(yǎng)至對數(shù)期，取菌液5 mL 和1 mg/mL 的肽1 mL 于已滅菌的試管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h 后，將混合液在離心機中離心（10 000 r/min，1 min），倒掉上清液。用PBS 沖洗沉淀3 次，加入1 mL 2.5%的戊二醛溶液，4 ℃固定12 h 后用酒精脫水，并用白色樹脂滲透。最后，樣品包埋后70 ℃焙燒24 h，在銅網(wǎng)格上制備70 nm 薄玻片，并用檸檬酸鉛和醋酸鈾酰染色，通過透射電鏡觀察細(xì)菌的超微結(jié)構(gòu)。

1.3.7 凝膠阻滯分析 用細(xì)菌基因組DNA 試劑盒提取副溶血性弧菌的基因組DNA，所得DNA采用超微量分光光度計測定濃度，并用260 nm 和280 nm 光密度比（OD260nm/OD280nm≥1.90）測定提取的DNA 的純度，然后將DNA 定量至20 ng/μL。在微量離心管中加入10 μL 上述DNA，并加入不同濃度的抗菌肽，使肽/DNA 分別為100/1，50/1，25/1，12.5/1，6.25/1，3.125/1，0，混勻后置于37 ℃孵育1.5 h。每個樣品取8 μL 加入1 μL 的10×DNA 上樣緩沖液，在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像儀在波長320 nm 的紫外燈下曝光60 s成像來檢測DNA 的遷移情況。

1.3.8 圓二色譜 用圓二色譜儀（Circular dichroism spectrum，CD）測定抗菌肽二級結(jié)構(gòu)及副溶血性弧菌DNA 對其結(jié)構(gòu)的影響。將肽分別溶解在25 mmol/L 十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液和0.01 mol/L PBS 中，使肽的最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，然后將其置于直徑為1 mm 的石英比色皿中進(jìn)行CD 掃描，掃描范圍為180～280 nm，狹縫為2 mm，掃描速度為10 nm/min，每個樣品連續(xù)掃描3 次，結(jié)果取平均值。然后在抗菌肽中加入副溶血性弧菌基因組DNA，孵育2 h 后，再用相同的方法檢測肽的二級結(jié)構(gòu)，觀察DNA 對肽二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 22.0 分析軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行分析，采用單因素分析法（ANOVA）檢驗其差異顯著性，P ＜0.05 表明差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 副干酪乳桿菌發(fā)酵液中潛在抗菌序列的篩選與鑒定

從副干酪乳桿菌發(fā)酵液中共鑒定出6 個潛在的抗菌序列（表2），利用在線數(shù)據(jù)庫APD3 計算了它們的帶電荷數(shù)、疏水性。它們的平均氨基酸數(shù)為12，分子質(zhì)量范圍是1 036～1 587 u，疏水率范圍是25%～60%，凈電荷數(shù)從-2 到+3。

表2 副干酪乳桿菌發(fā)酵液中抗菌肽的預(yù)測Table 2 Prediction of antimicrobial peptides in fermentation broth of Lactobacillus paracasei

抗菌肽的正電荷有助于其通過靜電作用與富含陰離子的磷脂膜表面初始結(jié)合，從而改變細(xì)菌細(xì)胞膜上的電位，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和蛋白質(zhì)等大分子的滲透使其死亡，一般凈電荷范圍在+2 到+9之間[4]。同時，抗菌肽中的疏水殘基與親水殘基可以形成兩親結(jié)構(gòu)，進(jìn)而插入細(xì)菌細(xì)胞膜中的疏水區(qū)域，破壞生物膜使細(xì)胞死亡[4，11]。此外，其抑菌效果還與肽的長度、分子質(zhì)量和空間結(jié)構(gòu)的螺旋性等理化性質(zhì)有關(guān)[12]，抗菌肽通常由10～50 個氨基酸組成，較短的抗菌肽可能會通過膠束作用降解膜，而較長的抗菌肽可能會在較長的范圍內(nèi)彎曲，從而穩(wěn)定地跨越膜[13-14]。在二級結(jié)構(gòu)方面，α-螺旋是抗菌肽最常見的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)有利于在細(xì)菌表面誘導(dǎo)形成跨膜孔洞，從而幫助抗菌肽穿透細(xì)菌細(xì)胞膜或讓脂質(zhì)體和細(xì)胞中的大分子泄漏[15]。在已鑒定的6 個抗菌肽中，Yt9z（RQQAENLAKFAKKG）由14 個氨基酸組成，其總電荷為+3，疏水氨基酸百分比為36%，其分子質(zhì)量為1 588 u，且三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其具有α-螺旋結(jié)構(gòu)（見圖1 和圖2）。

圖1 抗菌肽Yt9z 質(zhì)譜分析圖Fig.1 Mass spectrometry analysis of antimicrobial peptide Yt9z

圖2 抗菌肽Yt9z 的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 3D structure prediction of antimicrobial peptide Yt9z

2.2 肽Yt9z 對副溶血性弧菌的抑菌活性

2.2.1 最低殺菌濃度（MBC）為探究多肽Yt9z的抑菌活性，測定了其對金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和副溶血性弧菌的最低殺菌濃度。當(dāng)抗菌肽Yt9z 質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時，金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌仍然不能被完全抑制，說明其對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌無抑菌作用。而在抗菌肽Yt9z 質(zhì)量濃度為125 μg/mL 時，仍對副溶血性弧菌有很好的殺菌效果，低于這個質(zhì)量濃度時，副溶血性弧菌的數(shù)量隨著抗菌肽Yt9z 質(zhì)量濃度的減小而增加，如圖3 所示。因此，抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌的MBC 為125 μg/mL。

圖3 抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌的最低殺菌濃度Fig.3 Minimum bactericidal concentration（MBC）of antimicrobial peptide Yt9z against V.parahaemolyticus

由此可以看出，抗菌肽Yt9z 對革蘭氏陰性菌（副溶血性弧菌）的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌），這可能是由于革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁中存在更厚的肽聚糖層使抗菌肽難以穿透其細(xì)胞壁[16-17]。而抗菌肽可以直接結(jié)合革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖（LPS）從而破壞細(xì)胞膜[18]。乳酸鏈球菌可以產(chǎn)生一系列小分子抗菌多肽，其中大多數(shù)針對革蘭氏陽性菌，尤其是孢子形成菌，如乳酸鏈球菌素（Nisin）等[19]。因此，抗菌肽Yt9z 的發(fā)現(xiàn)可與Nisin 形成互補，進(jìn)一步完善乳酸鏈球菌抗菌肽的抗菌譜。

2.2.2 時間-殺菌曲線 從圖4 可以看出沒有加入抗菌肽的副溶血性弧菌在3 h 內(nèi)只有少量的衰亡，而加入抗菌肽Yt9z 后的副溶血性弧菌生長迅速被抑制，3 h 細(xì)菌被完全殺死，這表明抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌有較高的殺菌效率。

圖4 抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌的時間-殺滅曲線Fig.4 Time-kill curve of antimicrobial peptide Yt9z against V.parahaemolyticus

已有一些研究從乳酸菌中分離出具有抑菌活性的物質(zhì)，例如，從乳酸桿菌FGC-12 中分離出的細(xì)菌素對副溶血性弧菌的MBC 為6.0 mg/mL，且12 h 才能殺死大部分細(xì)菌[20]。相比之下，抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌的MBC 更低且殺滅時間更短，說明其抑菌活性更強，殺菌效率更高。

2.3 抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌的抑菌機制研究

2.3.1 細(xì)胞膜通透性 通過測定產(chǎn)生的鄰硝基苯酚的含量，來驗證經(jīng)抗菌肽Yt9z 處理后副溶血性弧菌細(xì)胞膜通透性的變化。當(dāng)膜通透性增加時，鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)被細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶降解，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物鄰硝基苯酚，其OD420nm值可以反映出膜透性增加的程度[21]。由圖5 可知，對照組的副溶血性弧菌在2～5 h 內(nèi)，膜通透有輕微的下降，而后膜通透性略微上升。相比于對照組，經(jīng)過抗菌肽Yt9z 處理的副溶血性弧菌細(xì)胞膜通透性，隨著肽的作用時間延長而逐漸升高，且肽的濃度越高，細(xì)胞膜通透性越大，表明該菌細(xì)胞膜通透性與抗菌肽Yt9z 具有明顯的時間-濃度依賴性。

圖5 抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌內(nèi)膜通透性的影響Fig.5 Effect of antimicrobial peptide Yt9z on inner membrane permeability of V.parahaemolyticus

抗菌肽殺滅細(xì)菌的能力通常取決于它們與細(xì)菌膜相互作用的能力，細(xì)胞膜在維持電化學(xué)梯度和電子傳遞中起著至關(guān)重要的作用，因此，大多數(shù)抗菌肽通過破壞細(xì)胞膜來殺滅細(xì)菌[22-23]。然而，其對細(xì)胞膜的滲透作用并不一定導(dǎo)致細(xì)胞膜的完全崩塌而破壞，多數(shù)情況下帶正電荷的抗菌肽能夠與革蘭氏陰性菌外膜中的脂多糖（LPS）等帶負(fù)電部分相互作用，穿透細(xì)菌的外膜并在其上產(chǎn)生孔隙，導(dǎo)致離子和代謝物泄漏、去極化和膜耦合呼吸喪失，從而加速細(xì)胞死亡[13，24]。例如，CGA-N12 在不干擾膜完整性的情況下，消散了熱帶假絲酵母的膜電位，增加了膜流動性和鉀離子的流出，誘導(dǎo)非選擇性離子通道的形成來發(fā)揮抑菌活性[25]。

2.3.2 抗菌肽Yt9z 二級結(jié)構(gòu)分析 圓二色譜是一種廣泛應(yīng)用于表征蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的方法[26]。抗菌肽的抑菌活性與其二級結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)，其中最常見的抗菌肽二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲[27]。本試驗利用圓二色譜對抗菌肽Yt9z 在PBS 和SDS 疏水環(huán)境下的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。如圖6 所示，在PBS 環(huán)境下，抗菌肽Yt9z 在波長200 nm 處出現(xiàn)負(fù)峰，在波長210 nm處出現(xiàn)正峰，這說明抗菌肽Yt9z 在PBS 環(huán)境下，其主要結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲[28]。在SDS 環(huán)境下，抗菌肽Yt9z 在波長193 nm 左右出現(xiàn)正峰，在波長208 nm 左右出現(xiàn)負(fù)峰，表明抗菌肽Yt9z 具有α-螺旋結(jié)構(gòu)[29]，且其在接觸細(xì)菌細(xì)胞膜時可能存在二級結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。

圖6 不同環(huán)境下抗菌肽Yt9z 的二級結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Secondary structure of Yt9z in different environments

SDS 是一種陰離子洗滌劑，用于模擬細(xì)菌膜的環(huán)境，抗菌肽Yt9z 在SDS 環(huán)境下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變說明抗菌肽Yt9z 在接觸細(xì)菌細(xì)胞膜時自身結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這可能是其展現(xiàn)抑菌活性的重要因素之一[30]。已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞很大程度上依賴其二級結(jié)構(gòu)，α-螺旋的兩親性有助于其疏水結(jié)構(gòu)域插入細(xì)菌膜中引起膜變形，或通過靜電相互作用附著在帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜上，從而實現(xiàn)與膜的相互作用[31]。

2.3.3 透射電鏡 用抗菌肽Yt9z 處理副溶血性弧菌，并通過透射電鏡（Transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的對照組細(xì)菌（副溶血性弧菌）具有組織均勻分布的完整細(xì)胞膜，且表面光滑平整，無內(nèi)容物流出（圖7a），而用抗菌肽Yt9z 處理后的副溶血性弧菌，仍存在完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，然而其發(fā)生了收縮和變形，且細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)明顯減少（圖7b）。這表明抗菌肽Yt9z 能夠與細(xì)胞膜相互作用，增強細(xì)胞膜的通透性進(jìn)而殺死細(xì)菌，而這一過程并未破壞細(xì)胞膜的完整性。

圖7 副溶血性弧菌在抗菌肽Yt9z 處理前、后的透射電鏡圖像Fig.7 TEM images of V.parahaemolyticus before and after antimicrobial peptide Yt9z treatment

相關(guān)研究顯示，一些多肽能夠穿透且不破壞細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)物質(zhì)相互作用，表現(xiàn)出很強的抑菌活性[32]。它們的抑菌作用包括插入細(xì)胞質(zhì)膜，形成孔隙，破壞脂質(zhì)不對稱性，從而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)的流出，或進(jìn)入細(xì)胞與胞內(nèi)物質(zhì)結(jié)合。例如，從南美角蛙皮中分離出α-螺旋抗菌肽pseudin-2，它在革蘭氏陰性菌中不能中和脂多糖（LPS），然而能與LPS 相互作用在細(xì)胞膜上形成孔洞，通過孔洞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并與RNA 緊密結(jié)合[33]。然而，抗菌肽Yt9z 的胞內(nèi)作用靶點暫不清楚，因此，要進(jìn)一步探究其胞內(nèi)作用靶點。

2.3.4 抗菌肽Yt9z 對副溶血性弧菌基因組DNA的相互作用 除了作用于細(xì)胞膜之外，抗菌肽還可以將胞內(nèi)物質(zhì)作為靶點，展現(xiàn)其抑菌活性[34]，因此，通過DNA 凝膠試驗來研究抗菌肽與副溶血性弧菌基因組DNA 之間的相互作用。在抗菌肽Yt9z/副溶血性弧菌DNA 為100/1 時，無法觀察到DNA 條帶，當(dāng)比例分別為50/1，25/1，25/2，25/4，25/8 時，條帶清晰度和亮度明顯上升；對照組DNA 的凝膠電泳圖譜則顯示出完整清晰且最明亮的條帶（圖8）?？梢钥闯隹咕腨t9z 以濃度依賴的方式與副溶血性弧菌DNA 相互作用。

圖8 凝膠阻滯分析抗菌肽Yt9z 與副溶血性弧菌DNA 的相互作用Fig.8 Gel retardation analysis of interaction between antimicrobial Yt9z and the DNA of V.parahaemolyticus

抗菌肽與細(xì)菌的DNA 相互作用是一種常見的抑菌機制，抗菌肽可以與細(xì)菌基因組DNA 結(jié)合，導(dǎo)致基因組DNA 直接損傷，或阻斷細(xì)胞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄使細(xì)胞失去生命活力[35-36]。本研究中，抗菌肽Yt9z 不僅增加了副溶血性弧菌細(xì)胞膜通透性，還能與其DNA 相互作用來實現(xiàn)抑菌作用。這與小麥胚乳蛋白中的肽PuroB 作用機制相似，它能夠與帶負(fù)電的磷脂相互作用，在不破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層完整性的同時，與細(xì)胞內(nèi)靶點（DNA）結(jié)合，從而阻斷體內(nèi)大分子合成來實現(xiàn)抑菌活性[37]。從鯰魚表皮黏液中分離出抗菌肽CF-14，通過增加腐敗希瓦氏菌的細(xì)胞膜通透性，從而穿透其細(xì)胞膜與DNA 結(jié)合完成殺菌過程[38]。

2.3.5 副溶血性弧菌DNA 對抗菌肽Yt9z 二級結(jié)構(gòu)的影響 通過圓二色譜測定抗菌肽Yt9z 與副溶血性弧菌DNA 結(jié)合后的二級結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步證實二者之間存在相互作用關(guān)系。圖9 顯示，加入DNA 后，193 nm 的正峰和208 nm 的負(fù)峰仍然存在，而抗菌肽Yt9z 的譜圖整體上移，表明抗菌肽Yt9z 與副溶血性弧菌基因組DNA 存在相互作用關(guān)系?？咕呐cDNA 結(jié)合后，能夠抑制DNA 的復(fù)制，從而阻礙蛋白質(zhì)正常合成和表達(dá)，也對相關(guān)酶造成影響。例如，LP5 能結(jié)合金黃色葡萄球菌的DNA，抑制大分子生物合成和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV 和DNA 回旋酶的功能，誘導(dǎo)SOS 反應(yīng)，從而抑制該菌生長[39]。含有色氨酸的多肽與多重耐藥銅綠假單胞菌DNA 通過溝槽結(jié)合而相互作用，干擾DNA 復(fù)制，從而影響相關(guān)基因的表達(dá)，致使細(xì)菌快速死亡[40]。

圖9 副溶血性弧菌DNA 對抗菌肽Yt9z 二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.9 Secondary structure changes of Yt9z binding to DNA in SDS

3 結(jié)論

本研究從副干酪乳桿菌發(fā)酵液中篩選出1 種對副溶血性弧菌具有強抑菌活性的抗菌肽Yt9z，其序列為RQQAENLAKFAKKG。研究顯示其最低殺菌質(zhì)量濃度為125 μg/mL，且3 h 內(nèi)能殺死全部細(xì)菌，它是通過與細(xì)胞膜作用來增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，從而穿透細(xì)胞膜與DNA 結(jié)合使其死亡。這些發(fā)現(xiàn)為抗菌肽Yt9z 作為生物防腐劑的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。