徐 昕 李 燁 王 敏 傅章程 齊國敏 盧春華

（福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 福州 350116）

MicroRNAs是一類長度約為20個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，具備多種生物學(xué)功能，在細胞的損傷和凋亡過程中發(fā)揮著重要作用［1］。 其中，microRNA-21（miR-21）已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中的表達水平高于正常組織，這意味著其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，這也讓miR-21成為一種代表性的腫瘤標志物，因此，基于miR-21的腫瘤檢測和響應(yīng)性的藥物釋放對于腫瘤的診斷和治療有著重要的意義［2］。 目前，已有多種microRNAs 的檢測技術(shù)被提出，如定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）［3］和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）［4］等。 然而，部分檢測方法的靈敏度低，僅適用于細胞裂解液或緩沖液，而無法反映活細胞內(nèi)microRNAs的變化。 因此，迫切需要開發(fā)一種高選擇性、高效率的策略用于腫瘤細胞內(nèi)miR-21的檢測。

DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)是由DNA單鏈通過自身折疊，使得堿基對相互靠近、發(fā)生互補配對，從而形成的一種DNA二級結(jié)構(gòu)［5-6］。 由于DNA發(fā)卡具有靈敏的堿基特異性的響應(yīng)能力，因此其常被設(shè)計成分子探針，用于單鏈核酸的檢測［7-8］。 目前，DNA 發(fā)卡已被廣泛應(yīng)用在腫瘤相關(guān)的核酸檢測中，也包括構(gòu)建基于microRNAs的生物傳感器［9-10］。

近年來，DNA 納米材料因為具有良好的生物相容性、可調(diào)節(jié)的粒子尺寸以及特異性的分子識別能力，已經(jīng)成為一種新型的腫瘤診療工具［10-11］。 而基于DNA 的無載體自組裝納米平臺，更是因為制備簡單、藥物利用率高，而在靶向腫瘤的藥物輸送和傳感中體現(xiàn)了巨大優(yōu)勢［12-14］。 DNA 具有良好的金屬離子配位性能［15］，由于核酸結(jié)構(gòu)中的堿基基團（具有富含孤對電子的氮原子）和磷酸根骨架（具有負電性）為金屬離子提供了結(jié)合位點，使得DNA 可以作為金屬離子的一種有效配體［16-17］。 因此，本研究開發(fā)了一種基于Zn2+/DNA 自組裝的無載體納米材料（ZDNPs），并將其設(shè)計用于腫瘤標志物miR-21響應(yīng)的腫瘤熒光成像和Zn2+介導(dǎo)的氧化應(yīng)激治療（圖1）。 DNA 發(fā)卡和Zn2+通過靜電作用和配位作用形成尺寸均勻的納米粒子，其中的DNA 發(fā)卡能與腫瘤細胞內(nèi)高水平表達的miR-21 發(fā)生特異性結(jié)合，從而恢復(fù)自身的熒光信號，起到腫瘤成像的作用。 同時，包載的Zn2+在腫瘤細胞內(nèi)釋放，引起細胞內(nèi)ROS 含量的上調(diào)，使腫瘤細胞發(fā)生氧化應(yīng)激從而凋亡［18-20］。 ZDNPs 的細胞和動物實驗均顯示其是一種作用效果良好、具有miR-21響應(yīng)性的腫瘤診療一體化系統(tǒng)，體現(xiàn)了其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用前景。

圖1 ZDNPs的合成示意圖以及在腫瘤中的miR-21響應(yīng)性熒光成像和氧化應(yīng)激治療Fig.1 Schematic illustration of ZDNPs synthesis process and miR-21 responsive fluorescence imaging and oxidative stress therapy of ZDNPs in tumor

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Acculab 型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Cary Eclipse 型熒光分光光度計（美國Agilent 公司）；CHB-202 型恒溫金屬?。ê贾莶┤湛萍加邢薰荆?；Hitachi HT7700 型透射電子顯微鏡（TEM，日本日立高新技術(shù)公司）；Zetasizer Nano ZS 型 DLS 納米粒度電位分析儀（英國Malvern 公司）；SH-1000 型酶標儀（日本Corona 公司）；Nikon A1 型共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM，日本Nikon 公司）；IVIS Lumina XRMS Series III小動物成像系統(tǒng)（美國PerkinElmer儀器有限公司）。

本實驗中所有試劑均為市售分析純，未做進一步純化。 ZnCl2購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司。 本實驗所用的DNA 引物（表1）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。 Hoechst 33342、Cell Counting Kit-8（CCK-8）和活性氧檢測試劑盒（DCFH-DA）均購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。 異氟烷購自瑞沃德生命科技（深圳）有限公司。 人類正常肝臟細胞系（L02細胞）和人類乳腺癌細胞系（MCF-7細胞）購自ATCC（美國）細胞資源中心，細胞系在溫度為37 ℃，空氣濃度為95%，CO2濃度為5%的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 BALB/c 小鼠（雌性，六周齡）購自吳氏實驗動物。 小鼠組織的蘇木精和伊紅（H&E）染色切片由賽維爾生物科技（武漢）有限公司制作。 本實驗中使用的超純水（18.25 MΩ/cm）均通過美國Millipore公司的Milli-Qwater凈化系統(tǒng)獲得。

表1 實驗中所用的DNA序列Table 1 DNA sequences in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA發(fā)卡對miR?21的響應(yīng)性驗證

將Hairpin-FL 放在95 ℃的金屬浴中加熱5 min，然后自然冷卻2.5 h 至室溫完成退火，使DNA 形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 將160 nmol/L DNA 發(fā)卡與不同濃度的miR-21（0、40、80、120、160、320和800 nmol/L）進行混合，用PBS緩沖液加至總體積為100 μL。 將樣品置于37 ℃的金屬浴中恒溫反應(yīng)1.5 h后，設(shè)置激發(fā)波長為630 nm，檢測發(fā)射波長范圍為640～750 nm，測量各溶液的熒光信號，進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 ZDNPs的制備

將ZnCl2（2.5 μL，10 mmol/L）和DNA發(fā)卡（2.5 μL，100 μmol/L）進行混合，用超純水將溶液總體積加至25 μL。 溶液混勻后，放置于37 ℃的金屬浴中恒溫反應(yīng)4 h。 產(chǎn)物在11000 r/min離心，15 min，將得到的沉淀置于4 ℃條件下保存。 合成ZDNPs 后，使用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）計算ZDNPs 對Zn2+的包封率，計算公式為： 包封率Zn2+=（（總濃度Zn2+－清液濃度Zn2+）/總濃度Zn2+）×100%。

1.2.3 ZDNPs對miR?21的響應(yīng)性與選擇性驗證

將160 nmol/L 的ZDNPs 與不同濃度的miR-21（0、5、10、20、40、80、120、160、320 和800 nmol/L）進行混合，用PBS緩沖液加至總體積為100 μL。 將樣品置于37 ℃的金屬浴中恒溫反應(yīng)1.5 h后，設(shè)置激發(fā)波長為630 nm，檢測發(fā)射波長范圍為640～750 nm，測量各溶液的熒光信號，進行數(shù)據(jù)分析。

將160 nmol/L 的ZDNPs 與160 nmol/L 不同種類的microRNAs（let-7a、miR-429、miR-144、miR-155 和miR-21）進行混合，并設(shè)置PBS 空白對照組。 之后，用PBS 緩沖液將溶液加至總體積為100 μL，置于37 ℃的金屬浴中恒溫反應(yīng)1.5 h 后，設(shè)置激發(fā)波長為630 nm，檢測發(fā)射波長范圍為640～750 nm，測量各溶液的熒光信號并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 ZDNPs的細胞內(nèi)熒光成像

根據(jù)不同細胞的miR-21 表達含量的不同，選擇MCF-7 作為miR-21 陽性細胞，L02 作為陰性細胞。將MCF-7細胞和L02細胞以5×104個/孔的密度分別接種于熒光培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，加入500 nmol/L的ZDNPs 與細胞孵育4 h。 棄去培養(yǎng)液，使用核染料Hoechst 33342 對細胞核進行染色，再次更換培養(yǎng)液，使用CLSM對細胞進行熒光成像。

1.2.5 ZDNPs對細胞的殺傷性驗證

將MCF-7細胞和L02細胞以1×104個/孔的密度分別接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。 之后，將2種細胞與不同濃度的ZDNPs（0、60、120、180、300、480、600、720和900 nmol/L）繼續(xù)孵育24 h。 使用CCK-8試劑盒測試孔板中細胞的活性，并用酶標儀測量其在450 nm處的吸收值，以對ZDNPs的細胞毒性進行評估。

1.2.6 ZDNPs在腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生Zn2+相關(guān)的ROS驗證

將600 nmol/L DNA 發(fā)卡和不同濃度的ZDNPs（0、60、300、480、600和900 nmol/L）分別與MCF-7細胞孵育4 h。 使用ROS探針DCFH-DA對細胞進行染色后，使用CLSM對細胞進行熒光成像。

1.2.7 ZDNPs對腫瘤中miR?21的活體成像

本研究所有動物實驗均經(jīng)福州大學(xué)機構(gòu)動物倫理與使用委員會批準，實驗均按照國家科技部頒布的《實驗動物護理與使用指南》（2006 年修訂）執(zhí)行。 使用雌性BALB/c 小鼠（六周齡）進行MCF-7 細胞（100 μL，1×107cell/mL）的皮下注射，建立乳腺癌移植瘤模型。腫瘤體積達到100 mm3時進行成像實驗。 使用異氟烷將小鼠麻醉后，將ZDNPs 和由隨機序列（random DNA）合成的納米粒子（Random）通過尾靜脈注射（100 μL，600 nmol/L）進入荷瘤小鼠體內(nèi)，使用小動物成像儀觀測小鼠的Cy5 熒光信號。

1.2.8 ZDNPs的活體抗腫瘤效果及安全性評估

將乳腺癌荷瘤小鼠分為5組并每2 d注射一次樣品： （a）DNA hairpin 組（100 μL，900 nmol/L）； （b）Zn2+組（100 μL，15 μmol/L）； （c）Random 組（100 μL，900 nmol/L）； （d）ZDNPs 治療組（100 μL，900 nmol/L）；（e）PBS 組（100 μL）。 腫瘤治療的實驗周期為14 d，共注射7 次，期間每2 d 測量一次小鼠的腫瘤體積。14 d后，處死并解剖小鼠，取出腫瘤，獲取腫瘤照片和切片，用來評估ZDNPs的抗腫瘤效果。

對于ZDNPs 的活體治療安全性評估，則通過治療期間每2 d 記錄一次小鼠的體重變化和治療結(jié)束后小鼠的主要器官切片進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料合成及性質(zhì)表征

2.1.1 DNA發(fā)卡對miR?21的響應(yīng)性

為了驗證設(shè)計的DNA 發(fā)卡對miR-21 具有響應(yīng)，將160 nmol/L 的DNA 發(fā)卡與不同濃度的miR-21 混合反應(yīng)，并通過檢測溶液的熒光變化進行評估。 由于DNA 發(fā)卡與miR-21 序列互補區(qū)域的堿基個數(shù)大于其自身形成發(fā)卡的堿基個數(shù)，因此，這2種結(jié)合自由能的差異使得DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)在miR-21的存在下，能夠從單鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成與miR-21 的雙鏈互補，從而使Cy5 的熒光信號得以恢復(fù)。 如圖2A 所示，隨著溶液中miR-21 濃度增加，Cy5 的熒光信號逐漸增強，同時，通過對圖2A 中熒光曲線的發(fā)射峰值進行函數(shù)擬合，得到了一條相關(guān)性較強的直線方程（圖2B），說明在40～160 nmol/L 的miR-21 濃度范圍內(nèi)，DNA發(fā)卡對miR-21具有良好的線性響應(yīng)性。

圖2 DNA發(fā)卡對不同濃度miR-21的響應(yīng)性（A）； 不同濃度的miR-21與熒光強度的線性關(guān)系（B）Fig. 2 Responsiveness of DNA hairpin to different concentrations of miR-21 （A）； Linear relationship between different concentrations of miR-21 and fluorescence intensity （B）

2.1.2 ZDNPs的合成與表征

將Zn2+和DNA 發(fā)卡進行自組裝，并對合成的產(chǎn)物ZDNPs 進行基本性質(zhì)的表征。 如圖3A 所示，ZDNPs 的TEM 數(shù)據(jù)顯示其組裝成了尺寸較為均一、分散性較好的球形顆粒，通過DLS 測得的ZDNPs 的平均粒徑為187 nm。 此外，通過ICP-MS測得ZDNPs對Zn2+的包封率為17.3%。

圖3 ZDNPs的TEM圖像和粒徑分布圖（A）及ZDNPs在PBS中的粒徑變化（B）Fig.3 TEM image and particle size distribution of ZDNPs （A） and particle size changes of ZDNPs in PBS （B）

為確保ZDNPs 能在細胞及動物實驗中有效發(fā)揮作用，考察了ZDNPs 在模擬生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，即根據(jù)ZDNPs在37 ℃、PBS的環(huán)境中的不同時間下的粒徑數(shù)據(jù)來進行評估。 如圖3B所示，在前4 h內(nèi)，ZDNPs的粒徑分布基本沒有變化，說明這段時間其在PBS中的形貌變化較小，能保持較好的穩(wěn)定性； 在孵育了6 h后，ZDNPs的粒徑逐漸變小，但總體變化不大； 而在12 h后，ZDNPs的粒徑分布發(fā)生了明顯變化，平均粒徑由初始的190 nm 變?yōu)?41 nm，說明此時ZDNPs已出現(xiàn)了部分降解。 以上實驗結(jié)果表明了ZDNPs在模擬生理環(huán)境下能維持較長時間的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

2.1.3 ZDNPs對miR?21的響應(yīng)性和選擇性

為了探究粒子組裝對DNA 發(fā)卡結(jié)構(gòu)的miR-21 響應(yīng)能力的影響，將ZDNPs 與不同濃度的miR-21 進行反應(yīng)并表征其熒光信號。 如圖4A所示，將不同濃度的miR-21與160 nmol/L ZDNPs進行孵育，并對溶液熒光進行檢測，結(jié)果顯示ZDNPs 的Cy5熒光隨著miR-21濃度的增大逐漸開始恢復(fù)，通過將圖4A 中熒光曲線的發(fā)射峰值與miR-21濃度進行函數(shù)擬合，得到一條呈正相關(guān)的線性曲線（圖4B），表明ZDNPs 與miR-21 濃度的線性響應(yīng)范圍為5～160 nmol/L，且檢測限為5 nmol/L。 以上實驗結(jié)果說明，ZDNPs 具有良好的miR-21響應(yīng)性質(zhì)，可以作為一種檢測腫瘤標志物的熒光探針。

圖4 ZDNPs對不同濃度miR-21的響應(yīng)性（A）； 不同濃度的miR-21與熒光強度的線性關(guān)系（B）Fig. 4 Responsiveness of ZDNPs to different concentrations of miR-21 （A）； Linear relationship between different concentrations of miR-21 and fluorescence intensity （B）

由于腫瘤細胞中存在多種microRNA 且微環(huán)境復(fù)雜，因此，為評估ZDNPs對miR-21的特異性識別能力，另選了4 種microRNA 作為對照組，PBS 作為空白組，通過與ZDNPs 共孵育后溶液中恢復(fù)的Cy5 熒光強度來考察ZDNPs 的選擇性。 如圖5 所示，除了miR-21 組外，其它4 個microRNA 組和空白組均無明顯的熒光信號產(chǎn)生，這證明了ZDNPS對miR-21具有良好的選擇性。

圖5 ZDNPs對miR-21的選擇性Fig.5 Selectivity of ZDNPs to miR-21

2.1.4 ZDNPs的細胞內(nèi)miR?21響應(yīng)性成像

為了驗證ZDNPs 在細胞內(nèi)能產(chǎn)生miR-21 響應(yīng)性的熒光信號，使用PBS 作為實驗空白組，隨機序列random DNA 與Zn2+合成的自組裝體（Random）作為對照組，ZDNPs 作為實驗組，并選擇人乳腺腫瘤細胞MCF-7作為miR-21陽性細胞組，選擇人肝細胞L02 作為miR-21 陰性細胞組，從而考察不同樣品在不同細胞內(nèi)的miR-21 響應(yīng)性熒光信號。 如圖6 所示，紅色和藍色通道分別代表Cy5 熒光和細胞核，2 種細胞與ZDNPs共孵育4 h后，MCF-7組顯示出很強的Cy5熒光信號，而L02組的Cy5信號微弱。 基于MCF-7和L02細胞中的miR-21含量差異，這種現(xiàn)象證實了ZDNPs在MCF-7細胞中發(fā)生了miR-21響應(yīng)性的熒光成像。 此外，對于Random 組，2 種細胞均未表現(xiàn)出明顯的Cy5 熒光信號，這是因為細胞內(nèi)不存在與Random組納米粒子中的DNA發(fā)卡互補的目標序列，導(dǎo)致DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)無法打開，熒光無法恢復(fù)。

圖6 ZDNPs對L02和MCF-7的miR-21響應(yīng)性成像Fig.6 MiR-21 response imaging of ZDNPs in L02 and MCF-7

2.1.5 ZDNPs對腫瘤細胞的治療效果

驗證完ZDNPs具備miR-21響應(yīng)性熒光成像后，為進一步說明ZDNPs對腫瘤細胞具有一定的選擇性殺傷效果，考察了ZDNPs 對MCF-7 細胞和L02 細胞的殺傷能力。 如圖7 所示，隨著ZDNPs 濃度的增加，MCF-7 和L02 的細胞存活率逐漸降低，并且MCF-7 的死亡率增速明顯比L02 的更快，在ZDNPs 濃度為900 nmol/L時，其死亡率達到90%，這證明了ZDNPs對于腫瘤細胞具有選擇性的殺傷能力，在一定程度上體現(xiàn)了其具有miR-21相關(guān)的響應(yīng)性治療效果。

圖7 ZDNPs對L02和MCF-7的細胞毒性實驗Fig.7 Cytotoxicity assay of ZDNPs to L02 and MCF-7

2.1.6 ZDNPs對腫瘤細胞的殺傷機理驗證

目前，已有文獻［19-20］證實了鋅離子能在多個層面上影響細胞中氧化還原的平衡，并主要通過結(jié)合還原性的硫醇類蛋白，阻止其參與氧化還原進程，從而上調(diào)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。

為了證明本研究中ZDNPs導(dǎo)致的細胞凋亡與DNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)無關(guān)，而是通過在腫瘤細胞內(nèi)上調(diào)了Zn2+相關(guān)的ROS而導(dǎo)致細胞發(fā)生氧化應(yīng)激型凋亡，使用DCFH-DA探針對腫瘤細胞內(nèi)的ROS進行了檢測。 在MCF-7細胞分別與PBS、DNA發(fā)卡（600 nmol/L）和不同濃度的ZDNPs孵育4 h后，其細胞內(nèi)的ROS產(chǎn)生情況如圖8所示，DNA發(fā)卡組的ROS熒光信號微弱、細胞形態(tài)正常，未觀察出與PBS空白組的差別，這說明DNA發(fā)卡并不能刺激MCF-7細胞產(chǎn)生大量ROS。 相比之下，60 nmol/L的ZDNPs即可在細胞內(nèi)上調(diào)ROS水平，并且當濃度增加至480 nmol/L時，細胞內(nèi)的ROS逐漸累積，熒光信號出現(xiàn)大幅增長，但是此時細胞尚能維持正常形態(tài)，這是因為腫瘤細胞內(nèi)存在高含量的還原性谷胱甘肽，其還有一大部分未與Zn2+結(jié)合，因此能在一定程度上還原細胞內(nèi)的氧化性物質(zhì)，緩解氧化應(yīng)激水平。 當ZDNPs 濃度增加到600 nmol/L時，大部分MCF-7細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)皺縮，細胞形態(tài)被嚴重破壞，說明此時細胞內(nèi)的氧化還原平衡被打破，細胞失去調(diào)節(jié)ROS的能力，并在氧化應(yīng)激的環(huán)境下逐漸發(fā)生凋亡。 在900 nmol/L ZDNPs的濃度下，細胞基本凋亡、內(nèi)容物流出，這也是部分凋亡細胞不再顯現(xiàn)出ROS 熒光信號的原因。 以上實驗結(jié)果證明，ZDNPs導(dǎo)致了腫瘤細胞內(nèi)ROS含量的大幅上升，并進一步使腫瘤細胞發(fā)生了氧化應(yīng)激凋亡。

圖8 ZDNPs在MCF-7細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的共聚焦熒光圖。比例尺為100 μmFig.8 Confocal fluorescence images of ROS production by ZDNPs in MCF-7 cells. Scale bar indicates 100 μm

2.2 ZDNPs在活體腫瘤成像和治療中的應(yīng)用

2.2.1 ZDNPs的腫瘤活體成像

為進一步驗證ZDNPs在活體模型中也具有miR-21響應(yīng)的熒光信號和用于腫瘤成像的潛力，將接種了MCF-7移植瘤的小鼠分成兩組并進行活體成像： （a）ZDNPs組； （b）Random組。 在對兩組小鼠分別通過尾靜脈注射ZDNPs和Random后，監(jiān)測了不同時間段小鼠體內(nèi)的Cy5熒光分布。 如圖9所示，注射2 h后，在ZDNPs組小鼠腫瘤部位觀察到了Cy5熒光信號的積累，并且在8 h后也仍然能顯示出明顯的熒光信號。而Random組的小組在整個觀察過程中均未在腫瘤部位顯示出熒光信號的富集。 這表明ZDNPs在活體腫瘤成像中依舊具備miR-21響應(yīng)性，并且能夠作為一種腫瘤標志物響應(yīng)的熒光探針用于腫瘤部位的示蹤。

圖9 ZDNPs和Random在荷瘤小鼠體內(nèi)不同時刻的熒光成像。比例尺為15 mmFig.9 Fluorescence imaging of ZDNPs and Random at different time in tumor-bearing mice.Scale bar indicates 15 mm

2.2.2 ZDNPs 的活體抗腫瘤效果

ZDNPs 已被證實具有miR-21 響應(yīng)的腫瘤細胞殺傷能力，因此，為考察ZDNPs 在活體模型中的抗腫瘤效果，將接種了MCF-7 移植瘤的小鼠分成5 組：（a）DNA hairpin 組； （b）Zn2+組； （c）Random 組；（d）ZDNPs 組； （e）PBS 組，并進行周期為14 d 的腫瘤治療實驗。 治療過程中，每2 d 測量小鼠腫瘤的體積并繪制腫瘤生長曲線（圖10），并在治療結(jié)束后將小鼠的腫瘤取出（圖11）。 從實驗結(jié)果得出，相較于其它幾組對照組，ZDNPs 組小鼠的腫瘤生長受到了明顯地抑制，治療前后腫瘤的相對體積比為1.25 左右； 而（a）、（b）、（c）和（e）組的腫瘤體積則出現(xiàn)了顯著的增大，體積比分別為4.91、4.98、3.94 和4.75，需要說明的是，Random 組在實驗過程中體現(xiàn)了一定的抑制腫瘤生長的效果，這說明納米粒子的運載有利于Zn2+進入腫瘤區(qū)域進行富集，但由于Random 組的粒子不具備miR-21 響應(yīng)性，無法在腫瘤細胞中大量釋放Zn2+，因此只起到了微弱的殺傷作用。 以上實驗結(jié)果體現(xiàn)了ZDNPs 對于活體腫瘤具有良好的生長抑制和一定的響應(yīng)性治療效果。

圖10 不同治療組小鼠的腫瘤生長曲線Fig.10 Tumor growth curves of mice in different treatment groups

圖11 不同治療組小鼠在第14天的腫瘤圖片F(xiàn)ig.11 Tumor photos of mice in different treatment groups at day 14

2.2.3 ZDNPs的生物安全性評估

為確保ZDNPs 在活體應(yīng)用中的生物安全性，記錄了治療過程中小鼠的體重變化，并在治療結(jié)束后對小鼠的主要器官進行切片和觀察。 如圖12 所示，在治療周期內(nèi)，ZDNPs 組與其它對照組的小鼠體重均保持穩(wěn)定，并無明顯的減輕現(xiàn)象，說明ZDNPs對小鼠的生命活動和健康未產(chǎn)生較大影響。

圖12 不同治療組小鼠的體重變化曲線Fig.12 Body weight curves of mice in different treatment groups

此外，對兩組小鼠的主要器官和腫瘤進行組織切片，并用H&E 進行染色，進一步考察ZDNPs 的生物安全性（圖13）。 染色結(jié)果顯示，各組小鼠的主要器官細胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)正常，均未出現(xiàn)病變情況。 此外，相較于其它幾組對照組，ZDNPs 組腫瘤切片的細胞表現(xiàn)出細胞形體增大、細胞質(zhì)空泡化、細胞核位置及大小異常等現(xiàn)象，這說明了ZDNPs 對腫瘤具有較好的殺傷效果； 同時，Random 組的腫瘤切片也出現(xiàn)了一定程度的細胞凋亡，這說明Random 組對腫瘤具有較微弱的殺傷作用。 以上結(jié)果表明，ZDNPs 在抑制腫瘤生長的同時，對活體的毒副作用很小，生物安全性較高。

圖13 不同治療組小鼠在第14天的主要器官和腫瘤切片。 比例尺為200 μmFig.13 Major organs and tumor sections of mice in different treatment groups at day 14. Scale bar indicates 200 μm

3 結(jié) 論

本工作開發(fā)的ZDNPs 自組裝納米系統(tǒng)，通過與腫瘤標志物miR-21 響應(yīng)產(chǎn)生熒光信號，從而實現(xiàn)了對腫瘤的成像和治療。 實驗首先證實了ZDNPs 對miR-21 具有良好的響應(yīng)性和選擇性，響應(yīng)的線性范圍在5～160 nmol/L； 其次，通過細胞實驗，證明了ZDNPs對腫瘤細胞具有良好的基于miR-21響應(yīng)的熒光成像效果和殺傷效果； 最后，通過構(gòu)建乳腺癌移植瘤的小鼠模型，驗證了ZDNPs良好的腫瘤熒光監(jiān)測能力和腫瘤生長抑制能力。 綜上所述，本研究為基于功能核酸的無載體自組裝納米材料在miR-21響應(yīng)型的腫瘤成像和治療中的應(yīng)用提供了參考。