周學敏 呂姝臻 張國芳 崔竹梅* 畢 賽*

（1青島大學附屬醫(yī)院， 青島 266061）

（2青島大學化學化工學院， 青島 266071）

microRNA（miRNA）作為一種高度保守的非編碼單鏈RNA［1］，在多種惡性腫瘤中高表達，并在基因調(diào)控、細胞增殖分化、凋亡和癌變過程中發(fā)揮重要作用［2-3］。目前，已發(fā)展多種miRNA 的檢測方法，如Northern印跡法［4］、微陣列法［5］和實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)［6］等，但這些方法多數(shù)存在靈敏度低、耗時長、易受環(huán)境影響和設(shè)備要求高等缺點［7-9］。近年來，隨著生物傳感技術(shù)的快速發(fā)展，已建立多種新的miRNA 的檢測方法，如電致化學發(fā)光生物傳感器［10］、光電化學生物傳感器［11］和熒光生物傳感器［12］等，具有成本低、靈敏度高等優(yōu)點。其中，熒光生物傳感器由于其重復(fù)性好、響應(yīng)速度快和設(shè)備簡單等優(yōu)點而受到關(guān)注。然而，傳統(tǒng)的熒光生物傳感器多采用有機染料、量子點和貴金屬納米簇等熒光材料作為信號源，存在發(fā)光穩(wěn)定性差、光漂白閾值低等問題［9，13-14］。此外，大多數(shù)熒光生物傳感器以及熒光材料多采用紫外-可見光作為激發(fā)光源。然而，紫外-可見光具有較高的能量，會對生物樣品造成光損傷，且穿透力較差，從而限制了其在生物傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用［15］。

上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Upconversion nanoparticles， UCNPs）作為一種特殊的納米發(fā)光材料，可在低能量的近紅外光（Near-infrared， NIR）激發(fā)下，發(fā)射出能量更高的紫外及可見光，具有反斯托克斯發(fā)光特性［16-17］。由于UCNPs的激發(fā)光為近紅外光（通常為808 nm或980 nm），其不僅能夠有效避免紫外及可見光激發(fā)引起的光損傷，還能夠降低自發(fā)熒光背景的干擾［18］。因此，UCNPs 在熒光生物傳感領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，Liu 等［19］利用UCNPs獨特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建了一種熒光生物傳感器用于次氯酸鹽的高靈敏檢測。Rong 等［20］基于內(nèi)濾效應(yīng)和UCNPs 構(gòu)建熒光生物傳感器應(yīng)用于食品中糠醛的檢測，具有較高的靈敏性與特異性。

核酸等溫擴增技術(shù)憑借其分析效率高、反應(yīng)速度快和特異性好等優(yōu)點已用于構(gòu)建多種熒光生物傳感器［21］。核酸等溫擴增技術(shù)主要包括酶輔助擴增法和無酶擴增法兩大類，其中酶輔助擴增法依賴于酶的活性，反應(yīng)條件受到嚴格限制，并且存在成本高和儲存困難等缺點，從而限制了其應(yīng)用［22-24］。相比于酶輔助擴增法，無酶的toehold 區(qū)域介導(dǎo)的鏈取代反應(yīng)（Toehold-mediated strand displacement， TMSD）具有穩(wěn)定性高、簡單、反應(yīng)迅速和成本低等優(yōu)點。TMSD 反應(yīng)是通過互補的單鏈toehold 區(qū)域介導(dǎo)三鏈遷移，將短雙鏈DNA 置換為熱力學更穩(wěn)定的長雙鏈DNA。催化發(fā)夾組裝技術(shù)（Catalytic hairpin reaction，CHA）是一種典型的TMSD 反應(yīng)，通過可編程的雜交反應(yīng)實現(xiàn)靶標的等溫循環(huán)利用，進而實現(xiàn)信號放大［24］。近年來，將CHA信號擴增技術(shù)與新型納米材料相結(jié)合，已開發(fā)出多種生物分析與疾病診斷新策略，用于體內(nèi)外生物標志物的檢測［25-26］。

本研究通過UCNPs 與CHA 信號放大策略結(jié)合，構(gòu)建了一種NIR 激發(fā)的熒光生物傳感器，用于miRNA-21 的高靈敏檢測。信標探針H2-UCNPs 的逐步構(gòu)建過程如圖1A 所示，首先通過高溫共沉淀法合成核心NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs，并采用殼層外延生長法合成核殼NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs。接下來除去核殼UCNPs 表面的油酸適配體后通過DNA 磷酸基團與UCNPs 中鑭系元素間的配位與靜電作用合成H2-UCNPs 信標探針。CHA 的工作原理如圖1B 所示，當miRNA-21 存在時，可通過TMSD 與MBs 表面的H1 雜交形成miRNA-21/H1 復(fù)合物。被打開的發(fā)夾H1 暴露出新的toehold 區(qū)域可與連接在UCNPs 表面的發(fā)夾H2 雜交，形成H1/H2 復(fù)合物并將miRNA-21 置換下來打開新的發(fā)夾H1，從而實現(xiàn)信號放大。借助miRNA-21 的循環(huán)利用，大量UCNPs 被連接于MBs 表面，在808 nm NIR 激發(fā)下產(chǎn)生UCL miRNA-21 的濃度越高，熒光信號越強，從而實現(xiàn)miRNA-21 的熒光檢測。總之，本工作提出一種近紅外光激發(fā)的信號放大熒光生物傳感器，具有靈敏度高、操作簡單和反應(yīng)速度快等優(yōu)點，為miRNA的檢測提供了新方法和新思路。

圖1 基于UCNPs和CHA信號放大策略的熒光生物感器檢測miRNA-21示意圖Fig.1 Schematic of fluorescence biosensor based on UCNPs and CHA amplification strategy for the detection of miRNA-21

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

ME104E/02 型電子天平（上海梅特勤-托利多儀器有限公司）；TGW16 型臺式高速微量離心機（濟南普納儀器設(shè)備有限公司）；Mimi1620 型基因擴增儀（杭州朗基科學儀器有限公司）；Tanon 2500R 型凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；NanoBrook 90PlusZeta 型高靈敏Zeta 電位及粒度分析儀（美國布魯克海文儀器公司）；F-7000 型熒光分光光度計（日本日立高新技術(shù)公司）；SZCL 型電熱套（上海力辰儀器科技有限公司）；HT7700型透射電子顯微鏡（TEM，日本日立高新技術(shù)公司）；Regulus8100型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立高新技術(shù)公司）；ESCALAB Xi+型X 射線光電子能譜儀（XPS，捷克賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；JEM 2100F 型高分辨透射電子顯微鏡（HETEM，日本電子株式會社）；Smart Lab 3KW型X射線衍射儀（XRD，日本理學公司）。

氫氧化鈉（NaOH，分析純）、油酸（OA，分析純）、甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、環(huán)己烷（分析純）、鹽酸（HCl，分析純）購自國藥集團化學試劑；氯化釔（YCl3，99.99%）、氯化鐿（YbCl3，99.99%）、氯化銩（TmCl3，99.99%）、十八烯（色譜純）和氟化氫銨（NH4HF2，分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司。羧基修飾的磁珠購自天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，98%）與N-羥基丁二酰亞胺（NHS，分析純）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司。Tris+EDTA（TE）緩沖液（1×，pH=8）與2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸（MES）購自上海生工生物工程股份有限公司。MES緩沖液的配置方法為稱取2.1325 g MES溶于100 mL純水中，并調(diào)節(jié)pH值至5.5。整個實驗使用的去離子水來自Millipore水凈化系統(tǒng)（18.2 MΩ/cm）。實驗中所用DNA 鏈均由上海生工生物工程股份有限公司提供。DNA 序列如表1 所示。所有的DNA 鏈在使用前進行退火處理（將DNA 鏈加熱到95 ℃保持5 min，然后冷卻至25 ℃保持2 h，冷卻速度為0.1 ℃/s）。

表1 工作中用到的核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides used in this study

1.2 實驗方法

1.2.1 NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs的合成

采用高溫共沉淀的方法合成核殼NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs［27-28］。首先，將0.795 mmol YCl3、0.2 mmol YbCl3、0.005 mmol TmCl3、15 mL十八烯和6 mL OA加入三口燒瓶中，升溫至160 ℃，保持30 min，得到淡黃色溶液。待溶液冷卻至室溫后，將4 mmol NaOH、2.5 mmol NH4HF2和10 mL甲醇混勻后加入三口燒瓶中。將反應(yīng)體系加熱至70 ℃，保持40 min以除去甲醇，隨即升溫至290 ℃，保持90 min，得到核心NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs。將所得懸濁液離心，收集白色沉淀，用環(huán)己烷洗滌3 次后，再次分散于環(huán)己烷中，以備下一步使用。

接下來將1 mmol YCl3、30 mL十八烯和6 mL OA加入三口燒瓶中，加熱至160 ℃，反應(yīng)30 min得到淡黃色溶液。待溶液冷卻至室溫后，將上一步反應(yīng)所得的NaYF4∶Yb3+，Tm3+環(huán)己烷分散液緩慢加入三口燒瓶中，隨即將4 mmol NaOH、2.5 mmol NH4HF2和10 mL 甲醇混勻后加入，并加熱至120 ℃反應(yīng)60 min 以去除環(huán)己烷和甲醇。接下來將溶液迅速加熱至300 ℃保持90 min，得到棕褐色溶液。最后，將所得溶液離心，得到的白色沉淀用環(huán)己烷和乙醇分別洗滌3次，得到核殼NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs，分散在純水中備用。上述所有步驟均在N2氣保護下進行。

1.2.2 H2-UCNPs信標探針的制備

首先，將制備好的UCNPs 分散于10 mL HCl 溶液（1 mmol/L）中，攪拌24 h 除去OA。將除去OA 的UCNPs 以12000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心30 min，并用乙醇和純水分別洗滌分散于TE 緩沖液中。最后，將發(fā)夾H2加入去除油酸的UCNPs懸濁液中，攪拌12 h制備得到H2-UCNPs復(fù)合物，將其作為信標探針備用。

1.2.3 H1-MBs捕獲探針的構(gòu)建

將60 μL羧基修飾的MBs（1 mg/mL）用200 μL MES緩沖液（pH=5.5）通過磁性分離的方法洗滌3次，并重新分散于150 μL MES 緩沖液中。接下來加入500 μL 含有EDC（0.1 mol/L）和NHS（0.01 mol/L）的水溶液，在37 ℃下反應(yīng)30 min 以活化MBs 表面的羧基。活化后的MBs 用TE 緩沖液洗滌2 次后分散于150 μL TE 緩沖液中。取300 μL 氨基修飾的發(fā)夾H1（2 μmol/L）與活化的MBs 于37 ℃下反應(yīng)12 h 得到H1-MBs，將H1-MBs洗滌3次后分散于TE緩沖液中備用。

1.2.4 近紅外熒光生物傳感器的構(gòu)建

將20 μL 不同濃度的miRNA-21、50 μL H1-MBs 和50 μL H2-UCNPs 于離心管中混勻，在25 ℃下反應(yīng)2 h。磁分離后，將所得沉淀用純水洗滌2 次后重新溶解于120 μL 純水中，使用熒光分光光度計檢測UCL強度。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料表征

首先，對羧基修飾的MBs進行SEM 表征。如圖2A 所示，羧基修飾MBs為球形，形貌均一，平均直徑約為230 nm。接下來對合成的UCNPs 進行TEM 表征。如圖2B 所示，核心NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs 為球形，分散性好，平均粒徑約為24 nm。為了增強UCNPs 的UCL 性能，采用介導(dǎo)殼層外延生長法，以NaYF4∶Yb3+，Tm3+為種子，在其表面生長一層惰性NaYF4外殼，合成NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs。TEM 結(jié)果顯示，所合成的核殼UCNPs 為橢圓形，長徑約為38 nm，短徑約為28 nm，大小均勻，分散性好（圖2C）。進一步，利用XPS對NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs進行元素表征（圖2D）。結(jié)果表明，Na、F、Y、Yb 和Tm 這5 種元素均存在于UCNPs 的XPS 全譜中。Y3d和F1s的高分辨 XPS 譜圖如圖2E 和2F 所示。158.35和160.35 eV處的峰分別歸屬于Y3d5/2和Y3d3/2［27］； 685.2 eV處的峰歸屬于F1s［29］。通過TEM和XPS分析，證明了核殼NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs的成功制備。

圖2 （A）MBs 的SEM 圖。（B）NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs 和（C）NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs 的TEM 圖。（D） NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs的XPS表征。 （E） Y3d和（F）F1s軌道的高分辨XPS圖譜。 （G）去除OA的UCNPs 和（H） H2-UCNPs 的TEM 圖。H2-UCNPs 的（I）HRTEM 和（J）EDS 表征。（K）去除OA 的 UCNPs 和H2-UCNP的Zeta電位表征。 （L） NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs（a）、NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs（b）和H2-UCNPs（c）的XRD 表征。 （M） 808 nm NIR 激發(fā)下NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs（a）、NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs（b）和H2-UCNPs（c）的UCL光譜Fig.2 （A） SEM image of MBs. TEM images of （B） NaYF4∶Yb3+，Tm3+ UCNPs and （C） NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs. （D） XPS survey spectrum of NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs. High-resolution XPS spectra of（E） Y3d and （F） F1s. TEM images of （G） OA-free UCNPs and （H） H2-UCNPs. （I） HRTEM and （J） EDS elemental mapping of H2-UCNPs. （K） Zeta potential of OA-free UCNPs and H2-UCNPs. （L） XRD spectrum of NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs （a）， NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs（b） and H2-UCNPs（c）. （M） UCL spectra of NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs （a）， NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4 UCNPs （b） and H2-UCNPs （c） under 808 nm NIR

在UCNPs的合成過程中，以疏水性O(shè)A作為穩(wěn)定劑，可有效阻止UCNPs的聚集，但同時也阻止了UCNPs與DNA的連接，因此本研究使用HCl除去UCNPs表面的OA。如圖2G所示，去除OA后的UCNPs的形貌和粒徑均未發(fā)生明顯變化，但分散性變差。進一步，利用DNA磷酸基團與UCNPs中鑭系元素（Ln3+）間的配位與靜電作用［30］，制備得到H2-UCNPs 信標探針。如圖2H 所示，UCNPs 連接發(fā)夾DNA 發(fā)夾H2 后，其分散性較去除OA 后增強。同時，對所制備的H2-UCNPs 進行HRTEM 表征（圖2I），晶格條紋寬度為0.51 nm，與NaYF4的（100）晶面參數(shù)一致。采用能量色散X 射線光譜（EDS）對H2-UCNPs 信標探針進行進一步表征。如圖2J 所示，Na、F、Y、Yb、Tm 和P 等元素均勻分布于UCNPs 中，其中P 元素來源于DNA，表明H2-UCNPs 信標探針的成功制備。接下來采用Zeta 電位分析儀對連接發(fā)夾H2前后UCNPs的電位進行測定。由于DNA帶負電，其連接到去除OA的UCNPs后，電位從28.37 mV下降至-17.6 mV（圖2K），表明H2 成功連接于UCNPs 表面。為驗證晶型變化，采用XRD 同時對NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs、NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs 和H2-UCNPs 進行表征。三者在17.12、30.70、31.70、43.36 和53.58（°）處均有相同的衍射峰，分別歸屬于NaYF4的（100）、（110）、（101）、（201）和（211）晶面（圖2L），表明H2 的修飾未對UCNPs的晶格產(chǎn)生影響。

UCNPs具有優(yōu)越的發(fā)光性能，其中Yb3+作為敏化劑吸收808 nm近紅外光，Tm3+作為激發(fā)劑產(chǎn)生紫外UCL（UCLUV）和可見UCL（UCLVis）。對核心NaYF4∶Yb3+，Tm3+和核殼NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs的UCL特性進行了對比。如圖2M所示，NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs在270.0 nm和406.4 nm處產(chǎn)生UCL峰（圖2M曲線a）。包覆NaYF4外殼后，由于NaYF4∶Yb3+，Tm3+UCNPs的表面缺陷減少，NaYF4∶Yb3+，Tm3+@NaYF4UCNPs的UCL 明顯增強（圖2M 曲線b）。在UCNPs 表面連接DNA 后，由于顆粒表面的水結(jié)合狀態(tài)發(fā)生改變，H2-UCNPs 的UCL 強度略有下降［30］（圖2M 曲線c）。位于406.4 nm 處的UCL 明顯強于270.0 nm 處，因此，使用406.4 nm處的UCL作為熒光生物傳感平臺的檢測信號。

2.2 可行性分析

為了驗證本研究的可行性，采用非變性聚丙烯凝膠電泳（PAGE）對miRNA-21觸發(fā)的CHA過程進行分析。如圖3 所示，泳道1 與泳道2 中的條帶分別代表miRNA-21 和H1。當miRNA-21 與H1 孵育后，通過TMSD 反應(yīng)打開發(fā)夾H1，形成miRNA-21/H1 復(fù)合物（泳道3）。當miRNA-21 與H1 與H2 共同孵育后，泳道4 出現(xiàn)H1/H2 復(fù)合物的條帶，遷移速率較miRNA-21/H1 復(fù)合物進一步減慢，并在泳道4 的下方出現(xiàn)miRNA-21 的條帶，表明miRNA-21 的釋放以及其觸發(fā)CHA 過程的成功進行。在無miRNA-21 時，H1 與H2 不發(fā)生反應(yīng)，保持穩(wěn)定狀態(tài)（泳道5）。

圖3 非變性聚丙烯凝膠電泳表征CHA 反應(yīng)過程。泳道1： miRNA-21； 泳道2： H1； 泳道3：miRNA-21+H1； 泳道4： miRNA-21+H1+H2； 泳道5： H1+H2Fig. 3 Native PAGE for the characterization of CHA process. Lane 1： miRNA-21； lane 2： H1；lane 3： miRNA-21+H1； lane 4：miRNA-21+H1+H2； lane 5： H1+H2

2.3 實驗條件優(yōu)化

MBs 上固載H1 的數(shù)量對所構(gòu)建的熒光生物傳感器的靈敏度具有重要影響。H1 濃度過低將導(dǎo)致固定的UCNPs 減少； 而H1 飽和后，繼續(xù)增大濃度并不會增強UCL。因此，首先對H1 的濃度進行優(yōu)化，此時選定miRNA-21 的濃度為10 nmol/L。如圖4A 所示，當H1 的濃度較低時，隨著其濃度的增大熒光信號逐漸增強； 當H1 的濃度達到2 μmol/L 后，熒光強度達到平臺，繼續(xù)加大濃度對熒光強度無影響。因此，選擇2 μmol/L 作為H1 的最佳濃度。此外，CHA 的反應(yīng)時間對傳感器的靈敏度也會產(chǎn)生較大影響。如圖4B 所示，當miRNA-21 為10 nmol/L 時，隨著CHA反應(yīng)時間的延長，熒光強度增強，并在2.0 h達到最大值，之后熒光信號基本保持不變。因此，選擇2.0 h作為CHA反應(yīng)的最佳反應(yīng)時間。

圖4 （A） MBs上H1濃度優(yōu)化和（B） CHA反應(yīng)時間優(yōu)化Fig.4 （A） Optimization of H1 concentrations on MBs and （B） reaction time of CHA reaction

2.4 近紅外熒光生物傳感器檢測miRNA

在最佳實驗條件下，采用所構(gòu)建的近紅外熒光生物傳感器對不同濃度的miRNA-21 進行檢測。如圖5A 所示，隨著miRNA-21 濃度的增大，UCL 信號逐漸升高。在0.1～100 nmol/L 范圍內(nèi)，UCL 強度與miRNA-21 濃度的對數(shù)值（lgcmiRNA-21）呈線性關(guān)系，線性方程為F=918.53×lgcmiRNA-21+1050.68，R2=0.998（圖5B），檢出限為11.3 pmol/L（3S/N，S為5次空白試驗測得的標準偏差，N為線性方程的斜率）。與已報道的miRNA 檢測方法相比，本研究所構(gòu)建的近紅外熒光生物傳感具有相對較寬的檢測范圍和較低的檢出限（表2）。

表2 不同傳感體系的檢測性能比較Table 2 Comparison of performance of different sensing system

圖5 （A）采用所構(gòu)建的近紅外熒光生物傳感檢測不同濃度miRNA-21的UCL光譜。 （B） UCL強度與miRNA-21濃度對數(shù)的線性關(guān)系圖Fig. 5 （A） UCL spectra toward miRNA-21 with different concentrations using the proposed NIR fluorescence biosensor. （B） Corresponding linear relationship between UCL intensity and logarithm of miRNA-21 concentration

為驗證該熒光生物傳感器的特異性，分別對單堿基錯配miRNA-21（SM）、三堿基錯配miRNA-21（TM）和miRNA-155 等3 種干擾物進行檢測（圖6A）。在相同實驗條件下，與目標物miRNA-21 相比，干擾物未引起明顯的UCL 信號變化，表明所構(gòu)建的近紅外熒光生物傳感器對miRNA-21 的檢測具有良好的特異性。為驗證該熒光生物傳感器的儲存穩(wěn)定性，對10 nmol/L 的miRNA-21 進行檢測，并記錄分別于4 ℃保存1、3、5和7 d后的熒光信號（圖6B）。在儲存1、3、5和7 d后，檢測到的平均熒光強度分別為初始值的99.34%、99.11%、96.65%和97.56%，表明該近紅外熒光生物傳感體系具有良好的儲存穩(wěn)定性。

圖6 所構(gòu)建近紅外熒光生物傳感器的（A）特異性和（B）儲存穩(wěn)定性Fig.6 （A） Specificity and （B） storage stability of the constructed NIR fluorescence biosensor

2.5 實際樣本分析

為了驗證該近紅外熒光生物傳感器的實用性，對血清中的miRNA-21進行檢測。在稀釋100倍的健康人血清中分別加入不同濃度的miRNA-21（0、0.7、7 和70 nmol/L），并對其進行加樣回收率實驗，結(jié)果如表3 所示。血清中miRNA-21 的回收率為101.14%～103.41%，相對標準偏差均小于1.02%，表明所構(gòu)建的熒光生物傳感器可實現(xiàn)血清等復(fù)雜生理條件中miRNA-21的準確檢測，具有良好的實用性。

表3 采用所構(gòu)建的近紅外熒光傳感器檢測血清中miRNA-21Table 3 Detection of miRNA-21 in human serum by NIR-driven fluorescence biosensor

3 結(jié) 論

本研究基于UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光特性，結(jié)合CHA信號放大策略構(gòu)建了一種NIR熒光生物傳感器用于miRNA-21 的靈敏檢測。在miRNA-21 的觸發(fā)下，發(fā)夾HI 與H2 發(fā)生CHA 反應(yīng)，將UCNPs 固定于MBs表面，實現(xiàn)了信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大； 同時，反應(yīng)在恒溫無酶的條件下進行，可有效抵抗外界環(huán)境的干擾，增強傳感體系的穩(wěn)定性。MBs表面的UCNPs在NIR的激發(fā)下產(chǎn)生UCL，實現(xiàn)對miRNA-21檢測。本工作采用NIR 作為UCNPs 的激發(fā)光，可有效避免自發(fā)熒光的干擾以及對生物樣品的光損傷，且UCNPs 在檢測過程中表現(xiàn)出較高的熒光穩(wěn)定性。將CHA信號放大策略與熒光傳感方法相結(jié)合，實現(xiàn)信號放大的同時兼具響應(yīng)速度快、檢測成本低和設(shè)備簡單等優(yōu)點，在miRNA-21 的檢測中表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性，并實現(xiàn)了血清樣本中miRNA-21的準確檢測，表現(xiàn)出較高的實用性?？傊?，所構(gòu)建的NIR熒光生物傳感體系為臨床腫瘤標志物的檢測提供了新的研究思路，在腫瘤早期診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。