馮鐸，徐菲，吳曉琴，鄒天輝，劉堯，王寰昱

華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院甲乳外科，廣東深圳518052

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，全球每年新發(fā)病例達(dá)230萬例［1］。由于治療的耐受性差、合并其他基礎(chǔ)疾病及機(jī)體功能退化等因素，老年乳腺癌患者預(yù)后較差［2］。改良根治術(shù)是治療乳腺癌最常用的術(shù)式，但術(shù)后有10%～30%的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。深入研究影響老年乳腺癌患者的預(yù)后因素對早期干預(yù)具有重要意義。N6-甲基腺苷RNA結(jié)合蛋白1（YTHDF1）具有RNA結(jié)合活性和N6甲基腺苷（m6A）修飾活性，參與信使RNA 的穩(wěn)定性及翻譯起始的調(diào)節(jié)［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF1 能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞無氧糖酵解，促進(jìn)卵巢癌［5］、宮頸癌［6］等惡性腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移，是潛在的腫瘤預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物。E2F 轉(zhuǎn)錄因子8（E2F8）屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育及血管生成等多種生物學(xué)過程［7］。研究表明，在黑色素瘤、肝癌等惡性腫瘤中E2F8表達(dá)上調(diào)，其能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞由G1到S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤過度增殖及患者不良預(yù)后［8］。目前老年乳腺癌中YTHDF1、E2F8 的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究觀察老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白表達(dá)變化，探討二者與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年1 月—2018 年2 月就診于本院的146 例老年乳腺癌患者，年齡60～81（68.59 ± 5.25）歲；病理類型：浸潤性癌99 例，非浸潤性癌47例；腫瘤最大徑：≤2 cm 94例，＞2 cm 52例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37 例；TNM 分期：Ⅰ期88 例，Ⅱ期58 例；組織學(xué)分級：Ⅰ級40 例，Ⅱ級52 例，Ⅲ級54例；雌激素受體（ER）陽性67 例；孕激素受體（PR）陽性65例；人表皮生長因子受體2（HER-2）陽性35例。納入標(biāo)準(zhǔn)：老年女性，年齡＞60 歲；均接受乳腺癌改良根治術(shù)治療，術(shù)后病理檢查明確診斷為乳腺癌；單側(cè)乳腺癌；首次診治，既往無手術(shù)及放化療治療；病歷及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性乳腺癌；多中心病灶或雙側(cè)乳腺癌；合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；合并其他惡性腫瘤；合并嚴(yán)重肝腎等臟器衰竭；合并精神障礙性疾病、不能或不愿接受術(shù)后規(guī)范化治療及不能配合隨訪的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 YTHDF1、E2F8蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化染色法。術(shù)中取癌組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣＞2 cm，經(jīng)病理檢查明確為正常乳腺組織），以石蠟包埋，5 μm 厚切片，脫蠟和水化，檸檬酸緩沖液中抗原修復(fù)，100 ℃ 3 min，山羊血清封閉后一抗（兔抗人YTHDF1、E2F8 多克隆抗體，購自美國Invitrogen 公司）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h 后顯色液顯色，蘇木精染色后脫水透明化，中性樹膠封片。免疫組化染色相關(guān)試劑均購自北京博奧森生物科技有限公司，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。由兩位病理醫(yī)生進(jìn)行免疫組化染色評定。染色面積評分：腫瘤染色面積≤10%計(jì)0 分，11%～25%計(jì)1 分，26%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，＞75%計(jì)4 分。染色強(qiáng)度評分：未染色計(jì)0分，淡黃色染色計(jì)1分，棕黃色染色計(jì)2 分，深棕褐色染色計(jì)3 分。以上兩項(xiàng)評分乘積≥4為陽性。

1.3 術(shù)后治療 術(shù)后參考2009 年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南［9］，中低危乳腺癌患者予多西他賽、環(huán)磷酰胺聯(lián)合化療方案，化療4周期，化療期間聯(lián)合曲妥珠單抗治療；高?；颊呒鱼K類藥物?；颊呔邮?0 Gy 劑量的全乳及患側(cè)胸壁放療，瘤床增加10 Gy 放射劑量，總療程3～4 周，分次劑量2 Gy。ER、PR 陽性乳腺癌患者，術(shù)后予以芳香化酶抑制劑依西美坦或來曲唑治療。

1.4 隨訪及預(yù)后評價 患者出院后，以門診復(fù)診和電話回訪的方式對其進(jìn)行隨訪，每3～6 個月隨訪1次，共隨訪5 年。隨訪至2023 年2 月1 日，記錄患者隨訪期間腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及死亡的時間。無進(jìn)展生存期定義為患者自出院至腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；用Spearman秩相關(guān)分析乳腺癌組織YTHDF1 與E2F8 表達(dá)的相關(guān)性；用Kaplan-Meier 法分析YTHDF1、E2F8 蛋白表達(dá)與患者無進(jìn)展生存預(yù)后的關(guān)系；Cox 回歸分析老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織YTHDF1、E2F8 蛋白表達(dá)比較 乳腺癌組織YTHDF1、E2F8 棕黃色陽性染色主要定位于細(xì)胞核。乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白陽性表達(dá)率分別為79.45%（116/146）、74.66%（109/146），癌旁組織中YTHDF1、E2F8蛋白陽性表達(dá)率分別為11.64%（17/146）、8.22%（12/146）。乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8 蛋白陽性表達(dá)率高于癌旁組織（P均＜0.05）。

2.2 乳腺癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.706，P＜0.05）。

2.3 YTHDF1、E2F8蛋白表達(dá)與老年乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 TNM 分期Ⅱ期、腫瘤最大徑＞2 cm、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1、E2F8蛋白陽性表達(dá)率高于TNM分期Ⅰ期、腫瘤最大徑≤2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（P均＜0.05）。見表1。

表1 YTHDF1、E2F8蛋白表達(dá)與老年乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.4 YTHDF1、E2F8蛋白表達(dá)與老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的關(guān)系 隨訪6～60（52.74 ± 7.18）個月，32例患者發(fā)生腫瘤進(jìn)展。YTHDF1蛋白陽性、陰性患者5 年無進(jìn)展生存率分別為73.68%（84/114）、93.75%（30/32）；E2F8蛋白表達(dá)陽性、陰性患者5年無進(jìn)展生存率分別為71.70%（76/106）、95.00%（38/40）。YTHDF1、E2F8 蛋白表達(dá)陽性患者5 年無進(jìn)展生存率低于其蛋白表達(dá)陰性患者（P均＜0.05）。

2.5 老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的影響因素 以老年乳腺癌患者隨訪中是否發(fā)生進(jìn)展為因變量（1=進(jìn)展，0=無進(jìn)展，t=時間），以各臨床病理特征及YTHDF1、E2F8 蛋白表達(dá)為自變量，單因素及多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，TNM 分期Ⅱ期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、YTHDF1 蛋白陽性表達(dá)、E2F8 蛋白陽性表達(dá)是老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P均＜0.05）。見表2、3。

表2 影響老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的單因素Cox回歸分析

表3 影響老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

近年來隨著人口老齡化及人口預(yù)期壽命的延長，老年乳腺癌的發(fā)病也呈逐漸升高的趨勢。據(jù)美國監(jiān)測流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)，65 歲以上的乳腺癌患者占所有乳腺癌患者的40%［10］。目前早期老年乳腺癌主要采取改良根治術(shù)為主的綜合治療，但由于老年患者病史復(fù)雜、治療耐受性等因素，部分患者術(shù)后會發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療效果不佳。因此，深入研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制，尋找能夠評估老年乳腺癌預(yù)后的標(biāo)志物，具有重要意義。

m6A修飾是真核細(xì)胞mRNA最常見的化學(xué)修飾方式。YTHDF1 是YTH 同源結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，通過其羧基末端YTH 結(jié)構(gòu)域與癌基因或抑癌基因的mRNA 結(jié)合，以m6A 修飾的方式調(diào)節(jié)基因mRNA的翻譯，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［5］。本研究中，乳腺癌組織中YTHDF1 蛋白表達(dá)上調(diào)，與既往研究［11］結(jié)果一致。乳腺癌中YTHDF1表達(dá)上調(diào)與基因擴(kuò)增有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中YTHDF1 基因拷貝數(shù)存在擴(kuò)增型突變，導(dǎo)致YTHDF1 在轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，YTHDF1抑制腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞浸潤，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［12］。尚有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中YTHDF1能夠識別結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子叉頭框M1 的mRNA，促進(jìn)其m6A 修飾及蛋白翻譯，促進(jìn)細(xì)胞周期由G0期向G1期轉(zhuǎn)換和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過度增殖、遷移［11］。這與本研究觀察到腫瘤最大徑＞2 cm、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期Ⅱ期乳腺癌組織中YTHDF1蛋白陽性表達(dá)率高一致。本研究中，YTHDF1 蛋白陽性表達(dá)的老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后較差，提示YTHDF1 是潛在的評估老年乳腺癌患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。YTHDF1 蛋白陽性表達(dá)的患者腫瘤惡性程度高，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，術(shù)中殘留肉眼難以分辨的轉(zhuǎn)移灶，增加患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險［13］。且有研究結(jié)果顯示，YTHDF1 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的DNA 復(fù)制和DNA 損傷修復(fù)，降低乳腺癌腫瘤細(xì)胞對阿霉素、順鉑及PARP抑制劑Olaparib治療的敏感性，導(dǎo)致患者不良預(yù)后［14］。

E2F8 編碼基因位于人類11 號染色體，屬于轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期到S 期的進(jìn)展，維持正常細(xì)胞增殖。近年來發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌［15］、多發(fā)性骨髓瘤［16］等惡性腫瘤中，E2F8 的過度表達(dá)能夠促進(jìn)啟動子區(qū)含有E2F元件的癌基因如周期素D1、有絲分裂相關(guān)激酶2 等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤無限增殖。本研究中，乳腺癌組織中E2F8蛋白表達(dá)上調(diào)，與腫瘤TNM 分期、最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示E2F8促進(jìn)老年乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。乳腺癌中E2F8表達(dá)升高與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。研究表明，乳腺癌腫瘤細(xì)胞中RNA 結(jié)合蛋白NONO 能夠與E2F8 mRNA 前體結(jié)合，促進(jìn)E2F8 mRNA 前體的剪接，增強(qiáng)E2F8的表達(dá)［17］。此外，腫瘤中E2F8表達(dá)上調(diào)能夠激活核因子κB 信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［18］。本研究中E2F8 蛋白陽性是影響老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素，表明檢測癌組織中E2F8的表達(dá)有助于評估患者預(yù)后。分析其原因，E2F8的表達(dá)升高能夠激活腫瘤細(xì)胞中微管相關(guān)絲氨酸/蘇氨酸激酶，促進(jìn)ER+乳腺癌細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)程，抑制順鉑誘導(dǎo)的乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤中E2F8 的表達(dá)升高能夠直接結(jié)合檢查點(diǎn)激酶1 啟動子區(qū)，激活檢查點(diǎn)激酶1 的轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞具對放射治療的抗性，導(dǎo)致患者不良預(yù)后［20］。本研究中，老年乳腺癌患者癌組織中YTHDF1與E2F8蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，表明兩者共同參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。研究表明，E2F8 是YTHDF1 的靶分子，YTHDF1 以甲基轉(zhuǎn)移酶14 依賴的方式m6A 修飾E2F8 mRNA，增強(qiáng)E2F8 mRNA 穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA 損傷修復(fù)，導(dǎo)致化療耐藥性的形成［14］。

綜上所述，老年乳腺癌組織中YTHDF1、E2F8蛋白高表達(dá)，兩者與腫瘤TNM 分期、腫瘤最大徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在乳腺癌腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮協(xié)同作用。YTHDF1、E2F8 蛋白陽性是影響老年乳腺癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素。本研究未能對YTHDF1、E2F8 在乳腺癌中的作用機(jī)制進(jìn)行研究，有待進(jìn)行深入的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)，進(jìn)一步探討兩者的臨床應(yīng)用價值。