劉琳玉 趙平娟 符艷 劉志昕 任艷利 張秀春

關(guān)鍵詞：斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）；AC4蛋白；聚腺苷酸特異性核糖核酸酶（PARN）；酵母雙雜交（Y2H）；熒光雙分子互補(bǔ)（BiFC）

木薯花葉病毒（Cassavamosaicgeminivirus，CMVs）引發(fā)的木薯花葉?。╟assavamosaicdisease，CMD）嚴(yán)重危害木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展和糧食安全[1]。2018年在我國(guó)海南、福建首次報(bào)道CMD，隨后在其他種植區(qū)也有報(bào)道[2]。斯里蘭卡木薯花葉病毒（SriLankancassavamosaicvirus，SLCMV）是首先在斯里蘭卡發(fā)現(xiàn)的引發(fā)木薯花葉病的一個(gè)株系，在分類上屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金黃花葉病毒屬（Begomovirus）[3-4]。SLCMV是典型的雙組分雙生病毒，其基因組由DNA-A和DNA-B兩個(gè)環(huán)狀組分組成。DNA-A組分正義鏈上編碼AV1（CP）和AV2兩個(gè)蛋白，反義鏈編碼4個(gè)蛋白，分別為AC1、AC2、AC3和AC4；DNA-B組分則編碼BV1和BC1[3，5]。據(jù)報(bào)道，SLCMVAC4蛋白可抑制寄主PTGS提高病毒致病性，是病毒致病因子[6]。

無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNAdecay，NMD）是真核細(xì)胞mRNA降解的主要途徑之一，通過(guò)識(shí)別由于出現(xiàn)提前終止密碼子（prematureterminationcodons，PTCs）而產(chǎn)生的在3′端有長(zhǎng)非編碼區(qū)域的mRNA（也稱為longnon-codingRNAs，lncRNAs），并利用核糖核酸酶迅速進(jìn)行降解[7-8]。越來(lái)越多的研究顯示，NMD不僅是真核生物重要的mRNA數(shù)量、質(zhì)量調(diào)控機(jī)制，還與轉(zhuǎn)錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）同樣能降解病毒RNA，是真核生物普遍存在的抗病毒防御機(jī)制。NMD途徑降解RNA包括PTCs識(shí)別、脫腺苷酸、脫帽和最后的核酸外切酶降解4個(gè)連續(xù)過(guò)程，UPF1（up-frameshiftprotein1）、PARN[poly（A）-specificribonuclease]、DCP2（decapping2）和XRN4（exoribonuclease4）分別是上述4個(gè)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白[9-11]。在真核生物中，去腺苷酸化是mRNA降解的首要限速步驟。PARN不僅在降解mRNApoly（A）尾中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還參與非編碼RNA的加工成熟、DNA損傷以及腫瘤等疾病發(fā)生過(guò)程[12-13]。病毒是專性寄生生物，必須逃避或耐受寄主細(xì)胞的降解才能成功感染寄主[14]。病毒如何調(diào)控NMD的抗病毒防御功能的分子機(jī)制研究已取得一些進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)沉默upf1后摩擦接種煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV），病毒RNAs與蛋白的表達(dá)量均有增加，結(jié)果表明TMV的致病性可能與upf1有關(guān)[15]。蘿卜花葉病毒（Turnipmosaicvirus，TuMV）中2個(gè)沉默抑制子VPg、HC-Pro分別與DCP2、XRN4相互作用并降低NMD的抗病毒防御功能，增強(qiáng)致病性[16]。GARCIA等[17]發(fā)現(xiàn)NMD能夠靶標(biāo)馬鈴薯X病毒（PotatovirusX，PVX）并限制其復(fù)制，研究結(jié)果顯示PVX中2個(gè)含長(zhǎng)的3′UTR亞基因組均會(huì)被NMD降解，并且在煙草中過(guò)量表達(dá)upf1能夠抑制另一正鏈RNA病毒——蕪菁皺縮病毒（Turnipcrinklevirus，TCV）的復(fù)制，說(shuō)明抑制RNA病毒復(fù)制可能是NMD的普遍功能。

SLCMV復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生大量的lncRNAs，這些lncRNAs是如何逃避或耐受被寄主NMD降解，目前還知之甚少[18]。尚不明確SLCMVAC4蛋白是否可與NMD信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白相互作用而抑制寄主NMD功能從而提高病毒致病性。本研究利用酵母雙雜交（yeasttwo-hybrid，Y2H）技術(shù)和熒光雙分子互補(bǔ)（BiFC）試驗(yàn)，對(duì)SLCMVAC4蛋白與擬南芥（Arabidopsisthaliana）NMD信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白PARN之間的相互作用進(jìn)行研究，研究結(jié)果將為闡明木薯花葉病毒是如何調(diào)控NMD的抗病毒防御功能的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

本氏煙草（Nicotianabenthamiana）種植于植物生長(zhǎng)培養(yǎng)房，光照16h，黑暗8h，培養(yǎng)溫度為20℃。酵母表達(dá)載體pGADT7、pGBKT7、pGBKT7-PARN以及BiFC載體：pGN1和pPARN-P28均為本實(shí)驗(yàn)室保存；pGADT7-T與pGBKT7-53（陽(yáng)性對(duì)照）、pGADT7-T與pGBKT7-Lam（陰性對(duì)照）共轉(zhuǎn)化的酵母菌、沉默抑制子表達(dá)載體pPTN-P19均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒小量中提取試劑盒和DNAMarker均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ等購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；高效無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)自莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA試劑盒購(gòu)自上海易匯生物科技有限公司（OMEGA）；大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5α、GV3101感受態(tài)細(xì)胞和酵母AH109菌株感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司；SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基均購(gòu)自北京泛基諾科技有限公司；LB培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；基因合成和測(cè)序由華大基因科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1酵母表達(dá)載體pGADT7-AC4的構(gòu)建參考已報(bào)道的SLACMV序列（GenBank：KT861468.1），人工合成兩端分別添加酵母獵物載體pGADT7限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)兩側(cè)序列的目的片段Y2H-AC4（表1）。利用無(wú)縫克隆試劑盒將目的片段與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后的酵母獵物載體pGADT7進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將其涂布于含氨芐青霉素（50mg/L）的LB平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37℃，倒置培養(yǎng)12h。然后，挑取3～5個(gè)單菌落，使用通用引物pGADT7-F和pGADT7-R（表2）對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系（20μL）：各0.4μL引物（10μmol/L），2μL10×EasyTaqPCRBuffer（含Mg2+），1.5μLdNTPs，0.2μLEasyTaqDNAPloymerase，15.5μLddH2O。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸40s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。選取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序、鑒定[19]。

1.2.2熒光雙分子互補(bǔ)表達(dá)載體pGN-AC4的構(gòu)建參考已報(bào)道的SLACMV序列（GenBank：KT-861468.1），人工合成兩端分別添加熒光雙分子表達(dá)載體p1300-GN1限制性核酸內(nèi)切酶MluⅠ和KpnⅠ位點(diǎn)兩側(cè)序列的目的片段BiFC-AC4（表1）。利用無(wú)縫克隆試劑盒將目的片段與經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶MluⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切后的含綠色熒光蛋白N端159個(gè)氨基酸的植物表達(dá)載體pGN1進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將其涂布于含卡那霉素（50mg/L）的LB平板上，于37℃，倒置培養(yǎng)12h。最后挑取3～5個(gè)單菌落，使用AC4特異引物AC4-1F和AC4-250R（表2）對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系（20μL）與1.2.1相同，選取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序、鑒定。

1.2.3酵母自激活檢測(cè)參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酵母表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)化，具體如下：取100μL冰上融化的酵母AH109菌株感受態(tài)細(xì)胞，依次加入預(yù)冷的酵母獵物表達(dá)載體pGADT7-AC4、酵母誘餌表達(dá)載體pGBKT7，10μL變性后的CarrierDNA（95～100℃，5min，快速冰浴，重復(fù)1次），500μLPEG/LiAc并吸打幾次混勻，30℃水浴30min（15min時(shí)翻轉(zhuǎn)6～8次混勻）。置于42℃水浴15min（7.5min時(shí)翻轉(zhuǎn)6～8次混勻）。5000r/min離心40s，棄上清液，400μLddH2O重懸，離心30s，棄上清液。50μLddH2O重懸后，取15μL涂布于SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～96h。挑取經(jīng)PCR鑒定的單菌落進(jìn)行梯度稀釋，等體積同時(shí)點(diǎn)板于SD/-Leu/-Trp（SD-LW）和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（SD-LWHA）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)以判斷是否具有自激活活性。

1.2.4木薯花葉病毒AC4與PARN蛋白互作驗(yàn)證參照AH109ChemicallyCompetentCell產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)將誘餌質(zhì)粒pGADT7-AC4與質(zhì)粒pGBKT7-PARN共轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)48～96h，觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況。待長(zhǎng)出菌落后，使用槍頭挑取經(jīng)PCR鑒定的單菌落于25μL無(wú)菌水中，然后再將其分別稀釋10、100、1000倍，各取2μL不同濃度稀釋的菌液分別點(diǎn)板于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)3～5d，觀察并記錄木薯花葉病毒AC4與PARN是否互作[20-21]。

1.2.5熒光雙分子互補(bǔ)驗(yàn)證AC4與PARN蛋白互作采用BiFC方法，注射本氏煙草進(jìn)行蛋白互作檢測(cè)。根據(jù)GV3101ChemicallyCompetent產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)將重組質(zhì)粒pGN-AC4、pPARN-GC、pGN-P28和pPTN-P19分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，涂布于含相同抗生素（利福平、鏈霉素、卡那霉素）的LB平板中，倒置放于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3d。待LB培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中（含利福平、鏈霉素、卡那霉素），置于28℃、200r/min恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)16～20h。配制200mL緩沖液：2mL1mmol/LMgCl2、2mL1mol/L2-嗎啡乙磺酸（MES）、200μL100mmol/L乙酰丁香酮，最后用超純水定容至200mL。將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液取出以7000r/min離心15min，棄上清液，收集菌體用10mL緩沖液重懸，使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)每種菌液OD600值，將菌液濃度稀釋至OD600值為0.5。取等體積的pPARN-GC、pPTN-P19與pGN-AC4或pGN-P28的3種菌液，混勻后用無(wú)針頭注射器緩慢將其分別注入3株本氏煙草中，每株注射3片葉，注射面積約為4cm2，置于培養(yǎng)房黑暗培養(yǎng)24h后，繼續(xù)光照培養(yǎng)96h，從每株本氏煙草中各取2片葉進(jìn)行激光共聚焦熒光顯微鏡（尼康FV1000）觀察并拍照，GFP激發(fā)光為488nm[22]。

2結(jié)果與分析

2.1酵母表達(dá)載體pGADT7-AC4的構(gòu)建

使用通用引物pGADT7-F和pGADT7-R進(jìn)行鑒定，如圖1所示，泳道1～4均為pGADT7-AC4（AD-AC4）不同菌落PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，產(chǎn)物大小約為450bp，與預(yù)期大小一致，均為陽(yáng)性克隆。選取2個(gè)陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，說(shuō)明酵母表達(dá)載體pGADT7-AC4構(gòu)建成功。

2.2SLACMVAC4熒光雙分子表達(dá)載體構(gòu)建

使用AC4特異引物AC4-1F和AC4-250F進(jìn)行鑒定，如圖2所示，泳道1～4均為pGN1-AC4（pGN-AC4）菌落PCR產(chǎn)物的鑒定結(jié)果，產(chǎn)物大小約為250bp，與預(yù)期大小一致，均為陽(yáng)性克隆。選取2個(gè)陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果比對(duì)均正確，說(shuō)明雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體pGN-AC4構(gòu)建成功。

2.3酵母自激活驗(yàn)證

將pGADT7-AC4+pGBKT7、pGADT7+pGBKT7-PARN分別共轉(zhuǎn)化酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)共轉(zhuǎn)化的酵母菌落后，從SD/-Leu/-Trp（SD-LW）營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板中挑取單菌落，溶于25μL無(wú)菌水中，按濃度梯度稀釋為10–1、10–2、10–3，梯度稀釋后等體積同時(shí)點(diǎn)板于SD/-Leu/-Trp（SD-LW）和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（SD-LWHA）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中。以同樣稀釋濃度分別共轉(zhuǎn)化pGADT7-T+pGBKT7-53、pGADT7-T+pGBKT7-Lam的酵母AH109，分別為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。結(jié)果表明pGADT7-AC4與pGBKT7、pGADT7與pGBKT7-PARN共轉(zhuǎn)化的AH109酵母菌株、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照均能在SD/-Leu/-Trp（SD-LW）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（SD-LWHA）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中只有陽(yáng)性對(duì)照能生長(zhǎng)。說(shuō)明酵母表達(dá)載體pGADT7-AC4和pGBKT7-PARN均無(wú)自激活活性（圖3）。

2.4木薯花葉病毒AC4與AtPARN蛋白互作

將經(jīng)驗(yàn)證無(wú)自激活活性的AD-AC4和pGBKT7-PARN（BD-PARN）共轉(zhuǎn)化的酵母菌落，從SD/-Leu/-Trp（SD-LW）營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板中挑取單菌落，溶于25μL無(wú)菌水中，按濃度梯度稀釋為10–1、10–2、10–3，點(diǎn)板于SD/-Leu/-Trp（SD-LW）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（SD-LWHA）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中，3d后觀察拍照，發(fā)現(xiàn)AD-AC4與BD-PARN在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（SD-LWHA）營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有相互作用（圖4）。

2.5BiFC驗(yàn)證AC4與PARN蛋白互作

在酵母雙雜交試驗(yàn)中驗(yàn)證了木薯花葉病毒AC4蛋白與PARN蛋白具有相互作用。采用BiFC方法進(jìn)一步驗(yàn)證其互作的真實(shí)性。將菌液OD600值均為0.5的pPARN-GC、pPTN-P19與pGN-AC4或pGN-P28的農(nóng)桿菌按1∶1∶1比例混勻，室溫放置2h，分別共浸潤(rùn)3株本氏煙草，每株注射3片葉片，浸潤(rùn)96h后使用激光共聚焦顯微鏡（FV1000）觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pGN-AC4+pPARN-GC農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的煙草葉片在激發(fā)光488nm均可恢復(fù)熒光，對(duì)照組pPARN-GC和pGN-P28未恢復(fù)熒光（圖5），結(jié)果表明，斯里蘭卡木薯花葉病毒AC4蛋白與擬南芥中的NMD關(guān)鍵因子PARN在本氏煙草中具有相互作用。

3討論

雙生病毒是世界上最具破壞性的植物病毒之一，對(duì)具有經(jīng)濟(jì)和生存重要性的作物造成嚴(yán)重?fù)p害[23]。由雙生病毒引起的木薯花葉病，通過(guò)煙粉虱為媒介進(jìn)行傳播[24]。2018年在我國(guó)首次報(bào)道，SLCMV編碼的AC4蛋白是一種致病因子，在SLCMV抵御寄主NMD中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，從非洲木薯花葉病毒（Africancassavamosaicvirus，ACMV）中基因敲除AC4蛋白，其致病性被消除，表明該蛋白是ACMV病毒感染所必須的蛋白[25]。病毒是專性寄生生物，必須逃避或耐受寄主細(xì)胞的降解才能成功感染[14]。

無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（NMD）不僅是真核生物重要的mRNA數(shù)量、質(zhì)量調(diào)控機(jī)制，還是真核生物普遍存在的抗病毒防御機(jī)制[26]。因此，為初步解析SLCMV抵御NMD介導(dǎo)的抗病毒防御機(jī)制，本研究人工合成了AC4基因，并構(gòu)建了酵母表達(dá)載體pGADT7-AC4和雙分子熒光互補(bǔ)表達(dá)載體pGN-AC4，首先采用酵母雙雜交技術(shù)證明AC4蛋白與NMD信號(hào)通路的關(guān)鍵因子PARN相互作用，通過(guò)BiFC技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證AC4蛋白與PARN之間的相互作用，其在煙草中均能恢復(fù)GFP的綠色熒光，通過(guò)對(duì)酵母雙雜交和BiFC的試驗(yàn)結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)PARN與AC4蛋白具有很強(qiáng)的相互作用。從酵母到高等真核生物的各種生物中，去腺苷酸化是許多mRNAs降解的第一步，也是限速步驟[27]。REVERDATTO等[28]發(fā)現(xiàn)AtPARN對(duì)于擬南芥的胚胎發(fā)生是不可缺少的，AtPARN在多種植物脫腺苷酶中具有獨(dú)特的、非冗余的作用。3?核糖核酸外切酶——聚腺苷酸特異性核糖核酸酶[poly（A）-specificribonuclease，PARN]可以高效降解真核生物mRNA的聚腺苷酸尾。PARN不僅在降解mRNApoly（A）尾中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，還參與了非編碼RNA的加工成熟以及腫瘤等疾病過(guò)程[29-30]。有研究表明，NMD相關(guān)因子upf1、upf2和upf3X能與去帽酶DCP2、外切酶復(fù)合體（exosome）PM/Scl100和PARN等因子相互作用，并下調(diào)PARN后包含無(wú)意義密碼子的mRNA（nonsensecontainingmRNA）含量增高[31]。MARAGOZIDIS等[32]發(fā)現(xiàn)，PARN在急性淋巴細(xì)胞白血病中的mRNA和蛋白水平明顯升高，并且PARN蛋白能被磷酸化。磷酸化的PARN還能與eIF4E競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mRNA的5?-帽端，從而降解mRNA[29]。丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）編碼NMD抑制蛋白，影響EJC復(fù)合體的完整性[33]。有研究表明，花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus，CaMV）的病毒翻譯反式激活因子TAV蛋白可作為NMD的抑制子，通過(guò)與NMD相關(guān)因子VARICOSE互作抑制NMD的降解功能[34]。推測(cè)SLCMV編碼蛋白AC4不僅是RNA沉默抑制子，而且還可能通過(guò)與PARN相互作用抑制寄主NMD信號(hào)通路的抗病毒防御功能，從而提高致病性。

根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)的斯里蘭卡木薯花葉病毒AC4與AtPARN蛋白的相互作用，推測(cè)SLCMV編碼蛋白AC4可能通過(guò)與NMD相關(guān)因子PARN的相互作用來(lái)增強(qiáng)自身病毒侵染力，從而抑制其抗病毒防御功能。為證實(shí)此假說(shuō)，可以使用免疫共沉淀、蛋白定位和蛋白共定位等方法對(duì)互作蛋白基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，或采用過(guò)量表達(dá)NMD相關(guān)因子PARN的方法研究互作蛋白在SLCMV侵染過(guò)程中的生物學(xué)功能，進(jìn)一步明確SLCMV編碼蛋白AC4與寄主相互作用的分子機(jī)制。SLCMV編碼的AC4蛋白與寄主蛋白如何互作？AC4如何通過(guò)與寄主蛋白互作來(lái)發(fā)揮其抑制NMD功能？這些問(wèn)題均有待進(jìn)一步研究。