王國芬 李超萍 時(shí)濤 吳會(huì)杰 蔡吉苗 李博勛 陸翠梅 黃貴

關(guān)鍵詞：斯里蘭卡木薯花葉病毒；分子特征；侵染性克?。恢虏⌒?/p>

木薯是熱帶地區(qū)薯芋類作物，為世界第六大糧食作物，是世界熱區(qū)10余億人口的主要糧食。全球有100多個(gè)國家種植木薯，2021年木薯總收獲面積超過3000萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)3.06億t[1]；我國木薯種植主要集中在廣西、廣東、云南、海南、福建和江西等華南及西南地區(qū)，以生產(chǎn)淀粉、變性淀粉和乙醇等為主。但我國的木薯原料生產(chǎn)仍然供不應(yīng)求，每年向東南亞進(jìn)口的木薯淀粉及木薯干片占世界木薯貿(mào)易量的70%以上[2]。

由雙生病毒引起的木薯花葉病毒病（cassavamosaicdisease，CMD）是世界木薯種植業(yè)中危害最嚴(yán)重的病害之一，病原屬雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金黃色花葉病毒屬（Begomovirus）木薯花葉雙生病毒（Cassavamosaicgeminiviruses，CMGs），共有9個(gè)種多個(gè)重組變種[3]。雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)為環(huán)狀單鏈DNA（ssDNA），根據(jù)其數(shù)量分為單組份和雙組份病毒。單組份雙生病毒只包含1條長度為2.6～2.8kb的環(huán)狀ssDNA，雙組份則包含2條長度為2.5～2.8kb的環(huán)狀ssDNA，即DNA-A和DNA-B，木薯花葉雙生病毒CMGs大部分都是雙組份病毒[4]。雙組份雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，DNA-A編碼外殼蛋白（coatprotein，CP）、運(yùn)動(dòng)蛋白（movementprotein，MP）、復(fù)制相關(guān)蛋白（replication-associatedprotein，Rep）、轉(zhuǎn)錄激活子（transcriptionalactivator，TrAP）、復(fù)制增強(qiáng)子（replicationenhancer，REn），以及C4蛋白；DNA-B編碼核穿梭蛋白（nuclearshuttlingprotein，NSP）和MP。雙組份雙生病毒以DNA-A中是否含有AV2編碼的運(yùn)動(dòng)蛋白（movementprotein，MP）區(qū)分“舊世界”和“新世界”病毒[5]。

木薯花葉雙生病毒（CMGs）最早在非洲中西部發(fā)生危害，現(xiàn)在廣泛分布于非洲大陸、馬達(dá)加斯加半島、西亞半島、印度洋諸島及東南亞[6]，2018年，我國海南、云南、廣東、廣西、福建和貴州等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)木薯花葉病毒病[7-8]，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)由斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）引起[9]。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)由其他雙生病毒，如煙草曲莖病毒（TbCSV）、中國勝紅薊黃脈病毒（AYVCNV）及其衛(wèi)星分子在云南紅河地區(qū)引起木薯葉片皺縮、畸形等癥狀[10]。WANG等[11]報(bào)道了福建分離物HN7的基因組序列，經(jīng)過分析不同來源SLCMV分離物全基因組序列，發(fā)現(xiàn)AC1序列及其編碼的氨基酸序列有部分差異。但由于國內(nèi)病毒分離物較少，尚未就國內(nèi)分離物和東南亞分離物在基因結(jié)構(gòu)及其致病性差異做深入分析。本研究對來自海南、貴州的SLCMV分離物進(jìn)行全基因組測序，并通過侵染性克隆的構(gòu)建，比較SLCMV不同致病力分離物對普通煙草的致病能力差異，為進(jìn)一步分析不同來源的SLCMV分離物之間的序列結(jié)構(gòu)特征及其致病性提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試樣品2020—2021年，分別在海南?？凇①僦莺唾F州興義的木薯種植基地采集具有皺縮、褪綠等表現(xiàn)疑似感染木薯花葉病毒病的木薯葉片樣品136個(gè)，無癥狀健康葉片樣品10個(gè)，經(jīng)檢測鑒定陽性樣品序列高度相似，因此分別從?？诘貐^(qū)的樣品中選取3個(gè)、儋州和貴州興義各選取1個(gè)代表性樣品進(jìn)行全基因組序列及結(jié)構(gòu)分析。

1.1.2載體及植物材料載體pCAMBIA1300（p1300），具有kan和Rif抗性，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所吳會(huì)杰副研究員饋贈(zèng)。pGEM-TEasy載體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。野生型普通煙（N.tabacum）種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，于白天氣溫28℃，夜間23℃，相對濕度75%和光周期L∶D=14h∶10h的人工氣候室中種植，生長2～4周后進(jìn)行接種試驗(yàn)。

1.1.3試劑農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，上海唯地科技有限公司；TaqDNA及LA聚合酶、AlkalinePhosphatase去磷酸化酶、HindⅢ、PstⅠ和BamHⅠ等內(nèi)切酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTPs、DNALadderMaker，天根生化科技（北京）有限公司；T4DNA連接酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物及參考序列SLCMV-Colombo的DNA-A（AJ314737）及DNA-B（AJ314738）全基因序列合成由華大基因股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)及合成通過特異性引物SL12/13擴(kuò)增樣品目標(biāo)序列，目標(biāo)序列測序后，設(shè)計(jì)背靠背測序引物對SLCMV全基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序，并進(jìn)一步設(shè)計(jì)SLCMV的侵染性克隆所需引物（表1）。

1.2.2病毒的檢測、克隆及全基因組測序采用改良CTAB一步法提取病樣基因組DNA[9]。分別對SLCMVDNA-A/B進(jìn)行擴(kuò)增，將獲得的序列進(jìn)行測序，拼接后獲得SLCMVDNA-A/B的基因組全長序列，應(yīng)用Lasergene-MegAlign、Lasergene-EditSeq和MEGA7.0軟件對基因組分子特征和序列及氨基酸相似性進(jìn)行分析。

1.2.3構(gòu)建SLCMV侵染性克隆質(zhì)粒以編號為SLCMV-DG1922分離物DNA為模板，分別用0.6A-HindⅢ-F/A-PstI-R和0.6B-HindⅢ-F/B-BamHI-R擴(kuò)增DG1922DNA-0.6A/0.6B目的片段，用相應(yīng)的HindⅢ、PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后分別與pCAMBIA1300（p1300）載體連接，轉(zhuǎn)化E.coil；陽性轉(zhuǎn)化子用相應(yīng)的引物檢測，并提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證；分別用1A-PstⅠ-F/A-PstⅠ-R1和B-BamHⅠ-F/B-BamHⅠ-R擴(kuò)增DG1922DNA-A/B目的片段，與經(jīng)過酶切及磷酸化處理后的DG1922-0.6A/0.6B連接，轉(zhuǎn)化E.coil，檢測DG1922-1.6A/1.6B陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。分別獲得SLCMV-DG1922pCAMBIA1300-1.6A（DG1922-A）及SLCMV-DG1922pCAMBIA1300-1.6B（DG1922-B）的侵染性克隆質(zhì)粒。為比較不同分離物的致病性，同步進(jìn)行SLCMV-ColombopCAMBIA1300-1.6A（Col-A）和SLCMV-ColombopCAMBIA1300-1.6B（Col-B）的構(gòu)建試驗(yàn)。

1.2.4SLCMV侵染性克隆致病力評價(jià)將經(jīng)雙酶切和測序篩選確認(rèn)的侵染性克隆DG1922-A/B和Col-A/B陽性質(zhì)粒，通過凍融法（冰浴5min，液氮5min，37℃水浴5min，4℃冰水浴5min）分別轉(zhuǎn)入100μLGV3101（pSoup）農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR篩選驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。然后接種于含有卡那霉素（100μg/mL）和利福平（25μg/mL）的LB培養(yǎng)基內(nèi)，28℃搖床過夜培養(yǎng)，4000r/min離心10min收集沉淀，棄上清，沉淀用農(nóng)桿菌懸浮緩沖液（10mmol/LMES、10mmol/LMgCl2、150μmol/LAs）重懸，利用紫外分光光度計(jì)將菌液OD600調(diào)至1.0。28℃培養(yǎng)箱靜置4h，用浸潤法接種5～6葉期的普通煙（N.tabacum），接種量為200μL/葉，每株接種3片葉。定期觀察記錄煙草癥狀的變化，以接種不帶質(zhì)粒的空載宿主緩沖液及清水處理為對照。每處理接種植株6株，試驗(yàn)重復(fù)3次。參照1.2.2方法，提取各處理的病毒DNA，并進(jìn)行分子檢測。

2結(jié)果與分析

2.1樣品采集及檢測

2020—2021年，在海南?？凇①僦莺唾F州興義的木薯種植基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分木薯種質(zhì)葉片呈現(xiàn)明顯的花葉斑駁、葉片卷曲等疑似感染SLCMV癥狀。共采集有癥狀葉片樣品136個(gè)，無癥狀樣品10個(gè)，經(jīng)核酸抽提PCR檢測后，結(jié)果顯示部分有癥狀的樣品可檢測到大小為1kb左右的特異性條帶。無癥狀樣品則無目的條帶（圖1）。

2.2我國SLCMV基因組序列相似性分析

將檢測陽性樣品分離物編號，并用自行設(shè)計(jì)的環(huán)狀DNA背靠背測序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序、拼接，獲得DNA-A和DNA-B雙鏈全基因組序列并上傳GenBank獲得序列登錄號（表2）。序列相似性比對結(jié)果表明5個(gè)代表性分離物之間DNA-A序列的相似性為99.5%～99.8%，DNA-B序列的相似性性為99.6%～100%；WANG等[11]報(bào)道的SLCMV-HN7福建分離物DNA-A和DNA-B的序列相似性為99.6%～99.9%和99.6%～100%；斯里蘭卡早期報(bào)道[12]的SLCMVColombo分離物之間的相似性較低，僅為93.2%～93.4%和96.4%～96.5%。

以SLCMV-DG1922分離物為代表，與不同地區(qū)SLCMV分離物及其他10個(gè)木薯雙生花葉病毒進(jìn)行基因和氨基酸序列比對，分析其序列相似性。結(jié)果表明，DG1922雙組份的DNA序列與柬埔寨、泰國和越南的SLCMV分離物在全基因組、非編碼區(qū)及各基因編碼區(qū)序列的相似性在97.0%～100.0%之間，與印度和斯里蘭卡早期的SLCMV分離物的相似性較低為86.5%～98.6%；SLCMVDG1922的DNA-B組份與印度木薯花葉病毒株系（ICMV）的編碼區(qū)序列相似性較高，為95.0%～97.6%。除了ICMV，DG1922的兩個(gè)組份與其他9個(gè)非洲木薯花葉病毒序列之間的相似性均低于80.0%（表3）。

2.3我國SLCMV基因組結(jié)構(gòu)特征

基因組結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，我國的幾個(gè)SLCMV分離物都屬于典型的“舊世界”雙組份菜豆花葉病毒（Oldworldbipartitebegomoviruses），具有雙組份單鏈DNA（ssDNA）。DNA-A組份全長2757～2758bp，DNA-B組份全長2737～2738bp。共編碼8個(gè)開放閱讀框（ORFs），病毒DNA-A正義鏈AV1編碼外殼蛋白（CP），AV2編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP），互補(bǔ)鏈AC1編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）、AC2編碼轉(zhuǎn)錄激活子（TrAP）、AC3編碼復(fù)制增強(qiáng)子（REn）和AC4蛋白；DNA-B正義鏈BV1編碼核穿梭蛋白（NSP）、互補(bǔ)鏈BC1編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）。雙組份的DNA-A和DNA-B的LIR中存在一段約200bp的保守序列，為基因間隔區(qū)（IR）/共同序列（CR）都含有AATTGGAGACA重復(fù)序列、TATABox和TAATATT↓AC莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖2A）。序列差異顯示，我國SLCMV分離物與其他SLCMV的主要結(jié)構(gòu)性差異顯示在基因間隔區(qū)（IR）、AV1、AV2及AC3四個(gè)區(qū)域，與SLCMV-Colombo和SLCMV-Erode的基因序列相似性低于95.0%，而DNA-B則和其他不同來源的SLCMV分離物一樣與ICMV保持了較高的同源性，序列同源性均高于95.0%（表3）。

進(jìn)一步分析不同來源SLCMVDNA-A上編碼復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）的AC1基因，發(fā)現(xiàn)本研究的幾個(gè)SLCMV分離物DG1922、GZ1924、Comb、HN2123、HN2124以及WANG等[11]報(bào)道的SLCMV-HN7，在AC1基因序列的3末端都有一致的C→T點(diǎn)突變，從而使其編碼的氨基酸末端的提前終止（CAA→TAA），導(dǎo)致Rep蛋白羧基端缺失了7個(gè)氨基酸。包括SLCMV-Colombo和SLCMV-Erode在內(nèi)的多個(gè)東南亞SLCMV分離物在該位點(diǎn)都保守地存在QGPTQGS七個(gè)氨基酸序列（圖2B）。

2.4侵染性克隆在煙草上的致病性

為驗(yàn)證SLCMV-DG1922和SLCMV-Colombo致病性上的差異，試驗(yàn)對構(gòu)建的侵染性克隆DG1922-A/B和Col-A/B進(jìn)行煙草接種，分別對2個(gè)分離物的A/B組份進(jìn)行重組和交叉重組接種，Mock為接種農(nóng)桿菌懸浮緩沖液空白對照。結(jié)果如圖3所示。第一，接種7d后，所有接種的煙草葉片都表現(xiàn)出葉片向下卷曲，接種點(diǎn)附近葉片組織黃化褪綠現(xiàn)象。第二，Col-A/B致病性強(qiáng)，接種17d和27d后，以Col-A為主的重組體植株癥狀典型，接種Col-A/B和Col-A/DG1922-B的植株新抽葉片均為葉片向下卷曲，葉背出現(xiàn)耳突，扭曲變形和植株矮化。第三，DG1922-A/B致病性弱，接種17d和27d后，以DG1922-A組份為主的重組體癥狀不典型，致病性弱，接種DG1922-A/B和DG1922-A/Col-B的植株新抽葉片無明顯癥狀，植株生長正常。第四，感病癥狀越典型，植株生長越矮，強(qiáng)致病株系的DNA-A影響癥狀產(chǎn)生，而DNA-B則可能協(xié)同DNA-A組份影響株高，各重組體接種對株高影響大小順序?yàn)镃ol-A/DG1922-B>Col-A/B>DG1922-A/Col-B>DG1922-A/B。值得一提的是，接種Col-A/B和DG1922-A/Col-B的植株，雖然癥狀表現(xiàn)為明顯的典型和不典型，但是平均株高分別為21.75cm和22.98cm，差異不顯著，接種DG1922-A/B對煙草的癥狀和株高的影響均不明顯。分別取接種后的葉片進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，僅顯示癥狀的2個(gè)接種植株（Col-A/B和Col-A/DG1922-B）能檢測到目標(biāo)病毒的DNA，對照及其他組份的接種體植株均未檢測到目標(biāo)病毒。

3討論

本研究對木薯地自然發(fā)病的木薯花葉病株進(jìn)行了PCR檢測、病毒分離物全基因組序列測定及致病性驗(yàn)證。PCR檢測樣品存在SLCMV侵染，全基因組序列分析表明，病毒分離物Comb、HN2123、HN2124、DG1922和GZ1924都含有雙組份DNA-A和DNA-B，屬于典型的“舊世界”煙粉虱傳雙生病毒。全基因組序列與中國HN7MH891840、柬埔寨CambodiaKT861468和越南VTN6LC312131三個(gè)分離物相似性均在99.7%以上，AV2和AC2編碼區(qū)氨基酸序列的相似性較低為98.3～98.5%，其余的均在99.0%以上；與斯里蘭卡、印度的部分分離物編碼區(qū)和氨基酸序列的相似性在87.0%以上；與印度木薯花葉病毒株系的相似性在86.5%～99.7%之間；與其他非洲木薯花葉病毒的相似性均在80.9%以下，具有較強(qiáng)的種系差別。聚類分析能將包括本研究的5個(gè)SLCMV與其他10個(gè)CMGs進(jìn)行嚴(yán)格的種系分類[3，9]。

本研究中的SLCMV分離物具有DNA-A和DNA-B雙組份結(jié)構(gòu)特征，編碼8個(gè)ORFs，包括AV2基因，屬于典型的“舊世界”類病毒[4]。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)（ICTV，2021）最新分類，菜豆金黃色花葉病毒屬（Begomovirus）作為雙生病毒科（Geminivirus）最大的一個(gè)屬，具有雙組份和單組份的基因組結(jié)構(gòu)特征，雙組份的begomovirses中，具有AV2編碼基因的為“舊世界”（OldWorld）類病毒，不具有AV2編碼的為“新世界”（NewWorld）類病毒[4]。DNA-A鏈編碼的6個(gè)蛋白分別為CP蛋白的AV1基因，參與病毒移動(dòng)的AV2基因，互補(bǔ)鏈上編碼Rep蛋白的AC1基因，編碼TrAP蛋白的AC2基因，編碼REn的AC3基因和參與癥狀及病毒系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)的AC4基因；DNA-B鏈編碼2個(gè)蛋白，BV1編碼核穿梭蛋白（NSP），互補(bǔ)鏈的BC1編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）[13]。

本研究較為詳細(xì)地比較了我國SLCMV與其他SLCMV的主要結(jié)構(gòu)性差異，而且證實(shí)了現(xiàn)階段引起我國木薯斯里蘭花葉病毒病的病原主要為SLCMV弱致病力株系。雙生病毒的Rep蛋白由AC1編碼，是病毒在植物中復(fù)制不可缺少的蛋白質(zhì)，Rep蛋白通過與宿主蛋白和其他病毒蛋白的相互作用，對病毒DNA復(fù)制的起始、延伸和終止進(jìn)行調(diào)控[14]。2020年WANG等[11]比較研究了SLCMV-HN7和SLCMV-Colombo對本氏煙的致病能力，并通過序列比對AC1編碼Rep基因缺失互補(bǔ)突變驗(yàn)證，推測SLCMV-HN7致病力弱是由于Rep蛋白在C末端缺失了7個(gè)氨基酸，導(dǎo)致其致病力降低。本研究對我國分離物Comb、HN2123、HN2124、DG1922和GZ1924的序列分析發(fā)現(xiàn)，所有分離物都在編碼Rep蛋白的AC1基因序列的3′端存在C→T點(diǎn)突變，使得Rep蛋白的翻譯提前終止（CAA→終止密碼子TAA），導(dǎo)致RepC末端缺失7個(gè)氨基酸。試驗(yàn)進(jìn)一步通過SLCMV-Colombo和SLCMV-DG1922侵染性克隆接種普通煙的癥狀表現(xiàn)，也得到了類似的結(jié)果，SLCMV-DG1922雙組份接種煙草17d以后，不能使新抽葉片產(chǎn)生致病癥狀，而SLCMV-ColA/B重組體和ColA/DG1922B交叉重組體則表現(xiàn)出典型的葉片向下翻卷和植株矮化的現(xiàn)象。

中國SLCMV分離物的DNA-A組份致病力弱，但是DNA-B組份可能協(xié)同強(qiáng)致病力株系的DNA-A組份起到增強(qiáng)其致病性，并對株高產(chǎn)生影響。GenBank中已經(jīng)公布的SLCMV與SLCMVColombo分離物在序列上均存在較大差異性，來自柬埔寨、越南和泰國的多個(gè)分離物中也存在Rep蛋白羧基端的差異，均對當(dāng)?shù)氐哪臼懋a(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重影響[15]。SAUNDERS等[12]研究發(fā)現(xiàn)SLCMVColombo的DNA-A組份可以單獨(dú)引起煙草產(chǎn)生癥狀，而且與SLCMVDNA/B和ICMVDNA/B的重組體和交叉重組體其致病率和致病力都顯著高于ICMV。PATIL等[16]則在用其他的SLCMV分離物接種煙草的研究中指出，SLCMVDNA-B和ICMVDNA-B在與DNA-A重組接種煙草后，能侵染煙草產(chǎn)生葉片向上翻卷和葉脈增厚的癥狀特征，是由于接種后會(huì)產(chǎn)生一些缺陷DNA（defDNA），這些defDNA可影響（增強(qiáng)或者減弱）雙生病毒對煙草的癥狀反應(yīng)。而本研究3次重復(fù)試驗(yàn)都顯示交叉組合的ColA/DG1922B表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病力和植株矮化現(xiàn)象，表明我國分離物的DNA-B組份在ColDNA-A致病能力上可能起到了一定的增強(qiáng)作用，但從癥狀上，均為出現(xiàn)葉片向上蜷曲和葉脈增厚的現(xiàn)象，在PCR檢測中也未發(fā)現(xiàn)defDNA。

SLCMV屬于雙生病毒，在田間木薯的感染經(jīng)由媒介昆蟲煙粉虱傳播，病毒與介體和寄主之間的相互影響會(huì)導(dǎo)致不同分離物在寄主上的癥狀表現(xiàn)[13]，WANG[11]、SAUNDERS[12]、PATIL[16]及本研究的接種都僅在煙草葉片上完成，無法通過浸潤法接種木薯葉片引起花葉癥狀。本研究中弱致病分離物DG1922雙組份DNA-A/B在接種煙草后的第7天，接種葉片是有癥狀的，但是在第17和27天以后，植株就恢復(fù)正常生長狀態(tài)了，且隨著老葉掉落，新抽出來的葉片上檢測不到病毒，表明弱致病分離物在病毒轉(zhuǎn)運(yùn)過程中受阻，不能成功從接種點(diǎn)運(yùn)送到其他葉片上，從而不能成功引起新抽葉片的癥狀。另一方面，基因和氨基酸序列比對結(jié)果顯示，相比AC1（97.8%）的基因及氨基酸序列相似性，SLCMV-DG1922與SLCMVColombo還有5個(gè)基因（AC2、BC1、AC3、AV1和AV2）序列的相似性較AC1低。因此SLCMV不同致病力株系在煙草上產(chǎn)生的致病性差異除了Rep蛋白羧基端的缺失外，是否可能還存在其他的影響因素，如參與病毒移動(dòng)的AV2、參與癥狀及病毒系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)的AC4基因和編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（MP）等；而作為弱致病力株系的我國多個(gè)分離物，在我國存在一定的分布（福建、海南、貴州等地），加上其癥狀不一定非常典型，增加了其調(diào)查和監(jiān)測的難度，需進(jìn)一步引起足夠重視。