譚敏穎，戴川景，盧學敏，王毅剛，關 磊，程 勇,

（1.浙江理工大學生命科學與醫(yī)藥學院，浙江杭州 310018；2.浙江天草生物科技股份有限公司，浙江湖州 313399）

骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種出現在關節(jié)結構中非常普遍的骨組織慢性[1]和退行性疾病，表現為關節(jié)組織的代謝異常，骨關節(jié)的磨損、撕裂[2]和滑膜液炎癥因子的增加[3]。近年來發(fā)現髖關節(jié)和膝關節(jié)OA 是導致殘疾的主要原因，人們普遍認為OA會日益增加人們生活的負擔，這會導致醫(yī)療系統(tǒng)的壓力不斷增加。在全球范圍內影響約5 億人口且女性發(fā)病率高于男性[4]。它可以導致關節(jié)功能障礙、疼痛、僵硬，限制正常的組織功能，嚴重降低人們的生活質量[5]。關節(jié)炎的發(fā)生是多種潛在因素共同的作用結果[6]，其中人口老齡化[7-8]、肥胖（BMI≥30 kg/m2）[8]，或者骨組織異常負荷受損[9]、肌肉無力和關節(jié)松弛，頻繁下蹲等都可能是骨關節(jié)炎發(fā)生的重要風險因素。巨噬細胞是維持組織穩(wěn)態(tài)的關鍵媒介[10]，在OA 關節(jié)中巨噬細胞受到球蛋白誘導后，會產生許多促炎細胞因子和生長因子，如白介素6（Interleukin-6，IL-6）[3]、單核化學吸引蛋白。促炎細胞因子會上調細胞外合成基質（Extracellular cartilage matrix，ECM）金屬蛋白酶和蛋白聚合酶（MMP-3 和MMP-13，以及ADAMTS-4 和ADAMTS-5）來抑制細胞基質合成，從而破壞關節(jié)組織[3]。

目前對于骨關節(jié)炎的治療大致可分為藥理學、非藥理學和手術干預。骨關節(jié)炎臨床經濟學會（European Society for Clinical and Economic Aspects of Osteoporosis,Osteoarthritis and Musculoskeletal Diseases，ESCEO）建議使用低劑量、短期的乙酰氨基酚、藥用級氨基葡萄糖和硫酸軟骨素用于緩解OA 帶來的疼痛[11]。天然化合物硫酸軟骨素和葡萄糖胺已經被多個研究證明具有抑制OA 的效果[12-13]，并證明它有利于人類關節(jié)中蛋白聚糖合成，改善細胞外軟骨基質的代謝紊亂[14]。其他常見的藥理學手段包括使用非甾體抗炎藥（NSAIDs）、撲熱息痛（對乙酰氨基酚）[15]等，這些藥物在治療OA 中被頻繁使用，并且其作用效果在臨床中得到了驗證[16]。但是非甾體抗炎藥具有強烈的毒性，可導致胃出血，腎臟血流減少等風險[17]，而除了非甾體類藥物以外，還有內皮質類固醇注射[16]和關節(jié)內透明質酸的方式可以幫助患者減輕疼痛[18]。有研究表明，隨著注射時間的增加，類固醇的效果會減小，而且可能會對軟骨產生有害影響。此外，有研究者使用間充質干細胞在動物模型中治療OA[19]，但目前還沒有在臨床進行驗證和治療。目前，對于OA 的臨床治療面臨著艱巨的挑戰(zhàn)。

在這些治療藥物中大部分副作用強，服用后會產生胃出血潰瘍等毒副作用。銀耳多糖作為一種具有藥用價值的食物，副作用小，是一種具有潛力的抗炎藥材。銀耳是一種真菌，通常被用來入藥或者直接食用。其中的有效生物活性成分是銀耳多糖，包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、酸性低聚糖和酸性雜多糖等[20]。研究者對銀耳多糖的藥用價值在不斷挖掘，發(fā)現銀耳多糖具有免疫調節(jié)[21]、抗氧化、降血糖、降血脂和抗腫瘤的作用，而且具有低副作用。銀耳提取物可以抑制LPS 刺激引起的炎癥反應[22]、雙環(huán)素硫酸鈉引起的結腸炎[23]、成纖維細胞損傷[24]等諸多炎癥反應，并且可以促進抗炎因子白介素-2（Interleukin-2，IL-2）的增加[25]，說明銀耳多糖是一種有效的炎癥抑制劑。但是對于在關節(jié)炎方面，銀耳多糖的藥用價值仍不明確。

本研究擬通過銀耳多糖處理骨關節(jié)炎細胞模型—人軟骨細胞T/C-28a2 后，檢測銀耳多糖對T/C-28a2 細胞的增殖效應和細胞毒作用，以及促炎因子IL-6、相關骨保護因子（Osteoprotegerin，OPG）、促凋亡蛋白Bax、細胞外信號調節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulated kinases，ERK-MAPK）和核內轉錄因子κB（Nuclear factor-kappaB，NF-κB）的表達，進一步檢測活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的水平，以探究銀耳多糖促進人軟骨細胞T/C-28a2 的增殖、抑制骨關節(jié)炎的形成、保護軟骨組織并抵抗細胞凋亡的作用，為開發(fā)銀耳多糖作為抗炎藥物提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、活性氧（ROS）檢測試劑盒、D-氨基葡萄糖、硫酸軟骨素Sigma 公司；氨糖軟骨素鈣片 湯臣倍?。汇y耳多糖、硫酸化銀耳多糖 分析純，杭州天草生物公司；IL-6 ELISA 試劑盒 義翹神舟；胎牛血清（FBS）、胰酶消化液（0.25% Tryspin-EDTA（1×））、青-鏈霉素溶液 Gibco 公司；人軟骨細胞T/C-28a2 ATCC、DMEM高糖培養(yǎng)基 Hyclone 公司；鼠抗體、兔抗體 Santa Cruz 公司；β-actin ERK-MAPK CST 公司；OPG NF-κB BAX 華安生物公司；噻唑藍（MTT）、結晶紫 麥克林公司。

ELx800 多功能酶標分析儀 美國 Biotek 公司；4J1093 倒置熒光顯微鏡 Nikon 公司；Nu425-400e細胞生物安全柜 Nuair 公司；V6B5R3 流式細胞儀NovoCyte? Advanteon 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將軟骨細胞T/C-28a2 培養(yǎng)于DMEM 高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中補充10%的胎牛血清（FBS），以及培養(yǎng)基總體積1%的10000 unites/mL青霉素和10000 μg/mL 的鏈霉素，細胞在5%的CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT 法檢測不同藥物對軟骨細胞存活率的影響 細胞以5×103個/孔的密度接種到96 孔板中，12 h 后每孔加入100 μL 濃度為0、1、10、100 μg/mL D-氨基葡萄糖，硫酸軟骨素，銀耳多糖，硫酸化銀耳多糖和氨糖軟骨素等的完全培養(yǎng)基并單獨設置只加磷酸緩沖液的調零組分別刺激細胞。將處理后的細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。分別在藥物刺激1、3、6 d 后檢測細胞存活率。采用MTT 測定法，每孔加入20 μL 的濃度為5 mg/mL 的噻唑藍溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸盡上清，隨后加入150 μL DMSO（分析純）溶解甲臜結晶，搖床上600 r/min 振蕩10 min，在酶標儀中測定OD490的數值。再根據以下公式計算細胞存活率，公式為：

1.2.3 結晶紫染色測定不同藥物對軟骨細胞增殖的影響 取對數生長期的T/C-28a2 軟骨細胞，按1×104個細胞/孔鋪于24 孔板中。細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入含不同藥物的完全培養(yǎng)基刺激細胞：D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素鈣片、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖；每種藥物設置濃度為1 μg/mL，同時設置僅含細胞不加任何藥物的陰性對照組，每個組設3 個復孔。3 d 后去除原細胞培養(yǎng)基，后用PBS 輕柔地洗2 次，每孔加入200 μL 配制好的結晶紫溶液，室溫靜置15 min。將孔板浸入蒸餾水多次，清洗24 孔板直至水變成無色，再將24 孔板倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中烘干水分。在光源充足的條件下將24 孔板置于白色卡紙上拍攝結晶紫染色結果照片。后加入33%的乙酸溶液溶解結晶紫，600 r/min 振蕩10 min 后，使用酶標儀以490 nm 波長檢測。

1.2.4 酶聯免疫吸附法測定不同藥物處理軟骨細胞后的IL-6 表達 為了定量檢測細胞因子表達水平，收集不同藥物處理的細胞上清，樣品制備方法如下：

無LPS 刺激細胞上清樣品的制備：取對數生長期的T/C-28a2 軟骨細胞，5×106個細胞/孔鋪于6 孔板中。將細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗細胞2 次，隨后分別在孔內加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL D-氨基葡萄糖、1 μg/mL 氨糖軟骨素、1 μg/mL 硫酸軟骨素、1 μg/mL 硫酸化銀耳多糖和1 μg/mL 銀耳多糖以及正常培養(yǎng)基。48 h 后，收集含不同藥物刺激細胞的上清，7000 r/min 離心10 min，收取細胞上清液并將其分裝到1.5 mL EP 管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LPS 刺激細胞上清樣品的制備：取對數生長期的T/C-28a2 軟骨細胞，5×106個細胞/孔鋪于6 孔板中。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS 清洗細胞2 次，隨后加入不含血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)24 h。除盡無血清培養(yǎng)基，用PBS 清洗2 次，分別在孔內加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL的LPS，培養(yǎng)24 h。除去含有LPS 的培養(yǎng)基，分別在孔內加入使用無血清DMEM 稀釋的1 μg/mL 的D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖及正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。收集含不同藥物刺激細胞的上清，7000 r/min 離心10 min，收取細胞上清液并將其分裝到1.5 mL EP 管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集的細胞上清稀釋10 倍并儲存于-80 ℃，使用ELISA 試劑盒測定IL-6（pg/mL）的濃度。具體為：將100 μL 一抗加入96 孔板，4 ℃孵育過夜，第二天使用pH7.5 的1×磷酸緩沖溶液沖洗3 次，每孔加入封閉液350 μL，室溫孵育 120 min。孵育結束后進行洗板，分別將 100 μL 樣品加入到相應的反應孔中，用封板膜封住反應孔并室溫孵育120 min。洗板后每孔加入250 μL 二抗孵育90 min，用磷酸緩沖溶液沖洗3 次，每孔加入 150 μL 顯色液。室溫下避光孵育 27 min，使用酶標儀測定450 nm 波長的吸光度，繪制標準曲線并得到回歸方程為Y=0.0108X+0.0792，（R2=0.9989），式中：Y 為樣品在450 nm 波長吸光值；X 為樣品IL-6 濃度（pg/mL）。

1.2.5 Western blot 檢測不同藥物處理后骨關節(jié)炎相關蛋白的表達 取對數生長期的人軟骨細胞T/C-28a2，以5×106個細胞/孔鋪于6 孔板中。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。細胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含有1 μg/mL 的D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖的完全培養(yǎng)基以及無藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 蛋白質裂解緩沖液（1×，靜置3 min），用槍頭順時針攪動提取蛋白，收到的蛋白樣品100 ℃金屬浴10 min 使蛋白變性。配10%的分離膠，每孔15 μL 上樣跑SDS-PAGE 電泳。將電泳凝膠轉印至0.45 μm PVDF 膜，350 mA 2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗脫后孵育一抗4 ℃過夜，洗脫后孵育二抗2 h，清洗之后滴加ECL 顯影液與化學發(fā)光成像儀曝光顯影，使用Image J 對蛋白條帶進行定量分析。

1.2.6 流式細胞術檢測不同藥物對ROS 釋放的影響取對數生長期的T/C-28a2 軟骨細胞，按3×106個細胞/孔鋪于12 孔板中。將細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜。去除細胞上清，用冰PBS 沖洗細胞2 次，按照活性氧（ROS）檢測試劑盒說明，將試劑盒中Master Reaction Mix 以每孔450 μL 加入12孔板中，放置于5% CO2，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，每孔加入50 μL 含有DMEM 無血清培養(yǎng)基稀釋的藥物，使其終濃度為1 μg/mL。設空白對照加入對應量PBS 處理，5% CO2，37 ℃ 孵育2 h。最后收集細胞進行流式檢測。

1.3 數據處理

每組試驗重復3～5 次，采用Graphpad Prism 9軟件繪圖，數據以平均值±標準偏差（Mean±SD）表示，并進行單因素方差分析（One-way ANOVA），使用Waller-duncan（W）進行多重比較分析。P＞0.05表示無顯著性差異，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 表示有顯著性差異，P＜0.001 表示極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 銀耳多糖促進人軟骨細胞T/C-28a2 的增殖活性

分別用完全培養(yǎng)基稀釋的0（對照組）、1、10、100 μg/mL D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖刺激T/C-28a2 細胞，以及在孔板中只加入磷酸緩沖溶液（調零組），分別在第1、3、6 d 通過MTT 的方式檢測藥物對細胞增殖的影響。結果如圖1 所示，加入上述5 種藥物后，硫酸化銀耳多糖對T/C-28a2 細胞有一定的細胞毒性作用，當藥物濃度1 μg/mL 時銀耳多糖能刺激T/C-28a2 細胞增殖。在處理3 d 后，銀耳多糖和硫酸軟骨素對T/C-28a2 細胞的增殖作用更加明顯。藥物濃度1 μg/mL 與10、100 μg/mL 相比，能明顯促進細胞增殖，因此確定1 μg/mL 為實驗濃度中相對合適作為進一步研究的濃度。

圖1 不同藥物在不同濃度作用下對人軟骨細胞T/C-28a2 的增殖活性Fig.1 Effect of different drugs at different concentrations on human chondrocyte T/C-28a2 cell viability

2.2 銀耳多糖對人軟骨細胞T/C-28a2 的細胞毒性效應

由于硫酸軟骨素對軟骨細胞T/C-28a2 的增殖作用有助于修復軟骨損傷。本實驗通過結晶紫染色進一步探究1 μg/mL D-氨基葡萄糖、氨糖軟骨素、硫酸軟骨素、硫酸化銀耳多糖和銀耳多糖對軟骨細胞的增殖作用，結果表明1 μg/mL 銀耳多糖、D-氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、氨糖軟骨素均能刺激軟骨細胞T/C-28a2 的增殖（圖2）。其中，硫酸軟骨素（P＜0.001）與銀耳多糖（P＜0.05）處理人軟骨細胞，細胞增殖差異性更顯著。

圖2 銀耳多糖對人軟骨細胞T/C-28a2 的毒性效應Fig.2 Toxic effects of Tremella fuciformis polysaccharide on T/C-28a2 in human chondrocytes

2.3 銀耳多糖抑制骨關節(jié)炎的炎癥水平

據報道，硫酸軟骨素（軟骨素4,6-硫酸鹽）已經用于治療人骨關節(jié)炎（OA），并取得了較好的治療效果[26-27]。研究顯示，在沒有加入脂多糖的情況下，所有藥物的加入均使IL-6 表達水平與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）（圖3a），在LPS 處理組中，硫酸化銀耳多糖（P＜0.01）、氨糖軟骨素（P＜0.001）與硫酸軟骨素處理組之間作用有顯著性或極顯著差異，銀耳多糖和氨糖軟骨素處理組之間有顯著性差異（P＜0.01）（圖3b），這表明硫酸軟骨素的抑制炎癥的效果要高于以上幾種藥物。此外，銀耳多糖和硫酸軟骨素處理組之間IL-6 的表達沒有統(tǒng)計學差異，說明銀耳多糖和硫酸軟骨素藥效相近，而且銀耳多糖相對于其他藥物處理方式對于防止炎癥反應的發(fā)生更有效，這與已有文獻綜述植源性多糖可以緩解炎癥的發(fā)生[28]的結果一致。

圖3 銀耳多糖對炎癥標志物IL-6 含量的影響Fig.3 Effect of Tremella fuciformis polysaccharide on the content of inflammatory marker IL-6

2.4 銀耳多糖促進骨保護和抑制骨關節(jié)炎的機制分析

為進一步研究藥物在分子水平上的作用機制、對骨組織的保護作用和藥物刺激對細胞凋亡的影響，利用Western blot 技術檢驗了相關蛋白的表達水平（圖4）。結果顯示，銀耳多糖和硫酸軟骨素處理能增加骨保護因子OPG 的表達，表明銀耳多糖和硫酸軟骨素具有骨組織保護作用。進一步檢測了NF-κB 和凋亡信號Bax 蛋白的表達量，發(fā)現使用銀耳多糖和硫酸軟骨素處理后它們的表達量相對對照組減少，這說明OA 發(fā)生發(fā)展中NF-κB 信號被抑制，且這兩種藥物可以有效的抑制細胞凋亡。

圖4 銀耳多糖對OA 相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Tremella fuciformis polysaccharide on expression of OA-related proteins

2.5 銀耳多糖抑制軟骨細胞ROS 活性氧水平

為檢測銀耳多糖對軟骨細胞的氧化損傷和藥物安全性，進行了活性氧（ROS）釋放實驗[29]。結果表明，與無藥物處理的對照組相比，藥物處理組細胞的ROS 相對釋放量更少，特別是銀耳多糖（P＜0.01）和硫酸軟骨素（P＜0.001）處理組（圖5），這說明銀耳多糖和硫酸軟骨素可以阻礙大量ROS 產生，這可能進一步阻礙炎癥的發(fā)展。

圖5 銀耳多糖處理人軟骨細胞后ROS 的釋放Fig.5 ROS release from human chondrocytes treated with Tremella fuciformis polysaccharide

3 討論與結論

目前，骨組織在早期骨關節(jié)炎中的變化原因尚不完全清楚，當軟骨細胞被內源或外源性的因素刺激時，通常會表現為軟骨細胞的凋亡[30-31]、細胞內炎癥因子的變化[32]和ECM 降解[33]等。本研究使用銀耳多糖刺激軟骨細胞發(fā)現，銀耳多糖促進了軟骨細胞的增殖，表現出了對軟骨細胞活力的促進作用。此外，研究發(fā)現骨關節(jié)炎軟骨細胞的凋亡與細胞凋亡因子Bax 上調有關[31]，與本研究發(fā)現銀耳多糖刺激軟骨細胞Bax 表達下調一致，這表現出了銀耳多糖的抗凋亡效應。更進一步地，ERK1/2-MAPK 和JNK 途徑的激活會使細胞外基質（Extracellular cartilage matrix，ECM）的蛋白酶表達上調[31,34]，骨微裂會刺激損傷區(qū)域的骨細胞產生NF-κB 信號[35]。當NF-κB 上調時，軟骨細胞會無法補償降解的ECM，導致細胞基質平衡障礙[36]，細胞炎癥和骨組織結構退化[31,37]，從而促進炎癥的發(fā)生。此外，當受體骨保護素OPG 失活時會導致骨吸收的發(fā)生[38-39]。本研究發(fā)現骨銀耳多糖處理軟骨細胞后，保護因子OPG 表達上調，而NF-κB、ERK1/2-MAPK 表達下調，因此推測銀耳多糖對軟骨細胞具有保護作用，并對骨關節(jié)炎具有抑制作用。

先前研究發(fā)現，退化軟骨組織或軟骨損傷環(huán)境中IL-6 水平增高，在IL-6/Stat3 模型中，IL-6 主要通過Stat3 信號誘導軟骨細胞分解代謝和軟骨細胞凋亡[40]。本實驗通過在軟骨細胞中加入LPS 模擬炎癥環(huán)境，對比了炎癥產生前后加入藥物后促炎因子IL-6的變化，發(fā)現在非炎癥環(huán)境下藥物刺激軟骨細胞產生的IL-6 水平沒有顯著性差異，而加入LPS 誘導后，硫酸軟骨素和銀耳多糖組與對照組相比IL-6 產生水平顯著降低。這表明在沒有發(fā)生炎癥反應時，藥物對細胞的作用相差不明顯，當炎癥發(fā)生時，銀耳多糖可以通過下調炎癥因子表達來發(fā)揮抗炎作用，因此推測銀耳多糖具有良好的抗炎活性，有效減緩骨關節(jié)炎的炎癥反應。

在OA 治療中，銀耳多糖對軟骨再生和清除自由基具有重要意義。高水平的ROS 可能會阻礙炎癥中骨軟骨組織的自然再生過程[33]。此外，活性氧（ROS）水平可能導致廣泛的氧化應激反應，高水平的ROS 可以導致細胞損傷[41]。本研究通過檢測不同藥物刺激下活性氧的變化，發(fā)現銀耳多糖的ROS釋放量顯著降低（P＜0.05），說明銀耳多糖對軟骨細胞清除自由基具有影響，具有高抗氧化性和低細胞損傷的效用，并可能進一步抑制炎癥的發(fā)生。

綜上，本研究探討了銀耳多糖對骨關節(jié)炎的潛在影響，發(fā)現銀耳多糖具有抑制骨關節(jié)炎的效用，可以通過降低IL-6 產生的水平減少骨關節(jié)炎癥反應，OPG 的增加表明銀耳多糖可以在一定程度上保護軟骨組織，抵抗細胞凋亡。本研究發(fā)現銀耳多糖的抗炎作用及機制，為探索銀耳多糖作為抗炎藥物和OA治療提供了新的思路。