萬瑞融 王希斌

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣西南寧市 530021

免疫療法是惡性腫瘤繼手術(shù)、放療和化療之外的第四種治療新方法,其中把T淋巴細胞作為腫瘤殺傷的效應(yīng)細胞稱之為過繼療法,是腫瘤免疫治療的良好策略之一[1]。但是傳統(tǒng)的T細胞過繼治療肝癌方法,難以獲得滿意的募集效應(yīng)細胞至腫瘤部位效應(yīng),同時缺乏靶向識別腫瘤細胞和正常細胞的能力,因此需要尋找新的策略來提高T細胞過繼治療的效果。

雙特異性抗體(Bispecific antibody,BsAb)是指能夠同時靶向兩個抗原或者一個抗原的兩個不同表位的基因工程抗體。由于其特異性和雙功能性,現(xiàn)已在腫瘤治療及自身免疫病等領(lǐng)域中引起廣泛關(guān)注[2]。適配體是一類分子量小、易于修飾合成、低毒低免疫原性、組織滲透性強等優(yōu)點的靶向識別分子,也已在生物醫(yī)藥領(lǐng)域開展了廣泛研究[3]。本項目設(shè)想通過CTLA-4納米抗體阻斷T細胞活化過程中的負性共刺激分子而進一步誘導(dǎo)T細胞的殺傷腫瘤效應(yīng),同時聯(lián)合適配體的腫瘤細胞靶向識別能力,構(gòu)建一種新型的BsAb,希望其能將更高效能的T細胞靶向募集至腫瘤部位,從而發(fā)揮腫瘤的特異性殺傷作用。因此,本研究利用前期工作已經(jīng)篩選出的CTLA-4特異性納米抗體Nb16[4],結(jié)合能特異性結(jié)合肝癌細胞HepG2的TLS11a適配體,制備一種新型的BsAb,有望為腫瘤的免疫治療提供一條有潛在臨床應(yīng)用價值的新策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料 1-棕櫚?；?2-硬脂酰基(POPC)、雙十八烷基溴化銨(DDAB)、膽固醇(Chol)、二硬脂?；字Ｒ掖及贰垡叶?000 (DSPE-PEG2000)、磷脂聚乙二醇馬來酰亞胺[DSPE-PEG(2000)-MAL],購自美國Avanti polar lipids公司。修飾巰基的適配體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列為:5’-ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTC-ATGGACGTGCTGTTTTTTTTTT-SH-3’。

1.2 實驗儀器 高速離心機(Thermo,德國),冷凍干燥機(Martin Christ,德國),小型噴霧干燥器,Nano-S 型激光粒度分析儀(Malvern,英國),透射電子顯微鏡(日立,日本),流式細胞儀(Beckman,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 雙靶向脂質(zhì)體的制備。(1)采用薄層水化法制備空載脂質(zhì)體(Lipo):將POPC、Chol、DSPE-PEG2000、DDAB和DSPE-PEG(2000)-MAL按質(zhì)量摩爾比52∶40∶5∶3∶0.3比例溶解到圓底燒瓶的氯仿溶液中,然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(設(shè)定溫度為60℃)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10min便可得到脂質(zhì)薄膜狀固體。連同圓底燒瓶將所得脂質(zhì)薄膜放置于真空干燥儀中干燥過夜,除去殘留有機溶劑。然后將瓶底的脂質(zhì)薄膜用1ml 300mmol/L的枸櫞酸緩沖液 (pH=4.0) 進行水化,隨后置于50℃的水浴中超聲20min,再使用液氮和60℃水浴循環(huán)凍融5次。將所得產(chǎn)物裝入脂質(zhì)體擠推器,依次通過200nm、100nm的聚碳酸酯膜各20次,最后便可得到直徑約100nm的空白脂質(zhì)體。(2)制備適配體和納米抗體共修飾的雙靶向脂質(zhì)體:納米抗體、適配體、脂質(zhì)體按照質(zhì)量摩爾比1∶1∶10的比例混合到PBS溶液中,混勻,然后4℃條件下震蕩孵育 24h,最后使用HEPES透析后即可獲得Nb16-Lipo-TLS11a。(3)制備熒光脂質(zhì)體:在全程避光條件下,將納米抗體、適配體、脂質(zhì)體、FITC熒光染料按質(zhì)量摩爾比1∶1∶10∶1混合到PBS溶液中,然后按照制備Nb16-Lipo-TLS11a一樣的步驟進行,便可得到帶熒光的F-Nb16-Lipo-TLS11a。(4)為了驗證雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向性能,我們還制備了單一修飾的熒光脂質(zhì)體,包括只修飾適配體脂質(zhì)體(Lipo-TLS11a)和只修飾納米抗體的脂質(zhì)體(Nb16-Lipo),即在上述空白脂質(zhì)體中分別只加入適配體或納米抗體溶液混勻,余步驟同前。

1.3.2 雙靶向脂質(zhì)體的表征。使用Zetasizer粒度電位儀測量和分析脂質(zhì)體的粒徑和電位;通過透射電子顯微鏡觀察并拍攝脂質(zhì)體的形態(tài)特點。

1.3.3 雙靶向脂質(zhì)體體外靶向活性檢測。流式細胞儀實驗。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法從健康供體的全血中分離出人外周血單核細胞(PBMCs)(已提供知情同意書)。將PBMCs懸浮于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中1h。去除未貼壁細胞,然后用尼龍羊毛纖維分離T細胞。所有流式細胞實驗均在4℃下進行。使用植物血凝素PHA( 10μg/ml)刺激T細胞,然后將3×105刺激的T細胞在30min內(nèi)用PBS/2% BSA溶液振蕩飽和,以避免非特異性結(jié)合。在PBS/2% BSA中加入熒光雙靶向脂質(zhì)體F-Nb16-Lipo-TLS11a(設(shè)置另外一組加入只修飾適配體的脂質(zhì)體Lipo-TLS11),孵育30min。PBS洗滌3次后,流式細胞儀檢測結(jié)合情況。

檢測雙靶向脂質(zhì)體與肝癌細胞HepG2和人正常肝細胞HL-7702的結(jié)合:取對數(shù)生長期的HepG2細胞,同時設(shè)置不能與適配體TLS11a結(jié)合的HL-7702細胞作為對照,分別取3×105細胞于50μl PBS溶液中重懸,然后加入40μl PBS溶液、10μl胎牛血清和熒光雙靶向脂質(zhì)體F-Nb16-Lipo-TLS11a混勻(設(shè)置另外一組加入只修飾納米抗體的脂質(zhì)體Nb16-Lipo),混勻,于4℃、避光條件下孵育30min,最后使用PBS 洗滌細胞并離心5min,重復(fù)洗滌3次,最后重懸細胞進行流式細胞術(shù)檢測。以上流式細胞術(shù)所獲得數(shù)據(jù)均采用Flow Jo軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 雙靶向脂質(zhì)體的表征 通過TEM觀察可以看到(見圖1a),雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a具有圓球形或橢圓球形形態(tài),大小均質(zhì),而且分散性良好。空載脂質(zhì)體Lipo的平均水化粒徑是94.57nm,在逐步修飾納米抗體和適配體后,平均粒徑分別增大至99.67nm與103.43nm(見圖1b)。電位檢測顯示(見圖1c),無修飾的空載脂質(zhì)體的平均電位為18.76mV,由于適配體核酸序列和納米抗體蛋白表面為負電荷,因此在修飾雙靶向分子后,靶向脂質(zhì)體電位發(fā)生了負向偏移。經(jīng)過檢測,雙靶向脂質(zhì)體表面平均電位為9.14mV,這說明適配體修飾成功。

圖1 雙靶向脂質(zhì)體的表征

2.2 流式細胞儀分析雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向能力 為了分析雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a結(jié)合PHA刺激的人T細胞的能力,進行了流式細胞術(shù)試驗。結(jié)果表明,只修飾適配體的脂質(zhì)體Lipo-TLS11a不能結(jié)合活化的T細胞,而雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a能識別活化的T細胞 (見圖2a),說明雙靶向脂質(zhì)體修飾納米抗體后擁有了靶向結(jié)合T細胞上的CTLA-4位點的能力。同時,雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a也能識別表達肝癌HepG2細胞 (見圖2b),卻無法靶向結(jié)合HL-7702細胞(見圖2c),說明雙靶向脂質(zhì)體通過修飾適配體后,具備了特異性識別腫瘤細胞的能力。

圖2 流式細胞儀檢測雙靶向脂質(zhì)體的體外靶向能力

3 討論

細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4 (Cytotoxic Tlymphocyte-associated Antigen-4,CTLA-4) 受體是第一個用作臨床靶標的免疫檢查點[5],也是T 細胞表面最具代表性的免疫抑制點分子。目前,人們利用CTLA-4抗體阻斷T細胞活化過程中CTLA-4對T細胞活化后的抑制,從而促進機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,使獲得滿意的抗腫瘤效應(yīng)成為可能。然而傳統(tǒng)抗體在實際應(yīng)用中仍存在問題亟待解決,如抗體分子量大,在瘤內(nèi)的穿透性欠佳等,因此有必要建立更加高效、穿透力強的新型抗體用于腫瘤治療?？贵w人源化、高效化及小型化均已成為當前抗體藥物研究的主要趨勢[6]。納米抗體(Nanobody,Nb)是目前可以得到的穩(wěn)定的可結(jié)合抗原的最小單位[7]。納米抗體是一種小型的基因工程抗體,由于它具備良好穩(wěn)定性、強組織穿透力及較弱的免疫原性,使其在腫瘤免疫治療等方面展現(xiàn)巨大的應(yīng)用潛力[8]。本課題組前期已篩選出了CTLA-4特異性的納米抗體Nb16,實驗證明其與CTLA-4抗原有較好的結(jié)合力與活性[4],具有巨大的應(yīng)用潛力。

阻斷CTLA-4對T細胞活化后的抑制還不夠,如何將腫瘤殺傷效應(yīng)T細胞富集至腫瘤部位也是目前研究的熱點方向。適配體能夠通過三維結(jié)構(gòu)以高親和力特異性結(jié)合在靶標上,能夠為主動靶向腫瘤細胞提供理想的靶向分子,被廣泛應(yīng)用于藥物靶向治療及腫瘤檢測等領(lǐng)域[9-10]。因此,本研究首次將納米抗體和適配體聯(lián)合,結(jié)合納米技術(shù),以脂質(zhì)體為連接介質(zhì),將這兩種具有不同靶向效能的小分子連接,從而構(gòu)建一種具有BsAb功能的雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a。本實驗結(jié)果初步證明了Nb16-Lipo-TLS11a構(gòu)建成功,并且其具有同時靶向結(jié)合PHA活化的T細胞和腫瘤細胞HepG2的能力。但是,Nb16-Lipo-TLS11a是否能將活化T細胞定向募集至腫瘤細胞,實現(xiàn)對腫瘤的高效且特異性殺傷,還有待本課題組在后續(xù)實驗中進一步驗證。

總之,本研究制備了一種CTLA-4納米抗體與腫瘤適配體共修飾的雙靶向脂質(zhì)體Nb16-Lipo-TLS11a。理論上,這種脂質(zhì)體能通過Nb16阻斷T淋巴細胞活化過程中的負性共刺激分子而進一步誘導(dǎo)T細胞的殺傷腫瘤效應(yīng),同時基于適配體對腫瘤細胞的靶向識別能力,可以將腫瘤殺傷T淋巴細胞靶向募集至腫瘤部位進行特異性殺傷。而且,通過替換靶向不同靶標的適配體,可以實現(xiàn)對各種腫瘤的靶向治療,為腫瘤的免疫治療提供了新思路。