＊李西建 營雙亦 李飄 史菁穎 劉寧 何玉靜,2*

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）藥學(xué)院 山東 250117 2.先進(jìn)藥物遞釋系統(tǒng)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 250117）

引言

腫瘤是當(dāng)前威脅人類健康的主要疾病之一，其臨床治療面臨著許多困難[1-3]。目前腫瘤治療的常規(guī)療法是化療，但會引起嚴(yán)重的副作用，并且許多藥物在腫瘤治療中只起一定作用，在單獨(dú)使用時(shí)往往療效較差。本文所設(shè)計(jì)的納米藥物遞送系統(tǒng)有許多獨(dú)特優(yōu)勢，包括高載藥量、增加難溶性藥物溶解度、提高腫瘤靶向性等，使化療藥物發(fā)揮更好的抗腫瘤效果[4-6]。

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種蒽環(huán)類化療藥物，廣泛應(yīng)用于實(shí)體腫瘤的治療，該藥物進(jìn)入細(xì)胞核與DNA嵌合，導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡[7]。單寧酸（tannic acid，TA）具有良好的生物相容性、高載藥性能且副作用很低[8]。DOX能與三價(jià)鐵離子如FeCl3形成配合物降低DOX的心臟毒性[9]。同時(shí)，F(xiàn)eCl3也可與TA配位，其配合物可在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)藥物的pH響應(yīng)性釋放，從而降低毒副作用。因此，我們利用小分子材料TA、FeCl3和DOX配位自組裝制備簡便、綠色、高效的納米顆粒。

1.試驗(yàn)部分

(1)試驗(yàn)試劑

鹽酸阿霉素（分析純，AR），購于上海阿拉丁生化科技有限公司；單寧酸（分析純，AR），購于上海阿拉丁生化科技有限公司；六水合三氯化鐵（分析純，AR），購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4T1細(xì)胞，購于中科院上海細(xì)胞庫。

(2)試驗(yàn)儀器

UV-8000紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；BT25S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UPT-1-10T實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，上海杲森儀器設(shè)備有限公司；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；BCD-239WTGM美的冰箱，合肥美的冰箱有限公司；SW-CJ-IF雙人雙面超凈臺，AIRTECH；5804R離心機(jī)，Eppendorf；Nano-S90粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Reference移液槍，Eppendorf；EP管，上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；一次性無菌注射器，常州悅康醫(yī)療儀器有限公司；0.22μm孔徑濾膜，津隆公司；細(xì)胞培養(yǎng)板，Theremo Fisher Scient。

(3)納米顆粒的制備

稱取DOX 6.82mg、TA 19.28mg、FeCl343.51mg，分別置于50mL的EP管中，依次加入1.1759mL和1.1333mL、16.0970mL去離子水配制成10mM的母液。另取EP管加入3mL去離子水，置于水浴鍋中加熱至42℃，在超聲處理?xiàng)l件下緩慢依次加入TA、FeCl3、DOX母液各60μL，該過程應(yīng)邊加母液邊振搖，最終得到TA-Fe-DOX納米顆粒。

(4)阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取9.58mg DOX于10mL EP管中，加1.652mL蒸餾水配制成10mM的溶液，取1.6mL母液再加158.4mL蒸餾水配制成100μM的溶液，從100μM的溶液中分別精密量取7.5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL置于50mL容量瓶中，定容至刻度線，搖勻，得到濃度為15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在480nm波長處分別測定吸光度，以濃度c為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，將濃度c與吸光度A作線性回歸，得線性回歸方程：y=0.0119x+0.0216，R2=0.9999。

(5)處方篩選

①處方篩選一

本輪篩選以3種母液加入順序?yàn)楹Y選對象，制成納米顆粒的丁達(dá)爾現(xiàn)象為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，母液加入順序如圖1所示。

用激光筆照射EP管，觀察丁達(dá)爾效應(yīng)，丁達(dá)爾效應(yīng)最明顯的加入順序?yàn)閱螌幩?、三氯化鐵、阿霉素，因此選擇該順序制備納米顆粒。

②處方篩選二

本輪篩選變量是納米顆粒中DOX的含量，以制備得納米顆粒的穩(wěn)定性及DOX的包封率為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。納米顆粒中三種藥物TA、FeCl3、DOX的摩爾比例分別為①1:1:1②1:1:2③1:1:3④1:1:4⑤1:1:5⑥1:1:6⑦1:1:7⑧1:1:8。

本輪篩選率先進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。將制備的各組納米顆粒進(jìn)行為期一周的粒徑檢測，以粒徑為穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示①②③組穩(wěn)定性極差，故不進(jìn)行后續(xù)包封率檢測，④⑤⑥⑦⑧組進(jìn)行包封率檢測。

包封率檢測中，以間接測量法測定包封率，即納米顆粒中DOX投藥總量減去游離DOX量。各組DOX投藥總量的檢測步驟：④⑤組各取400μL于EP管中，并加入800μL的1mol/L鹽酸破壞納米顆粒，15min后再加水至3mL，得檢測液；⑥⑦⑧組重復(fù)上述步驟，但加水分別至3.2mL、3.4mL、4mL，得到檢測液。將檢測液在480nm波長下用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度。

各組游離DOX檢測步驟：各組分別取2.5mL原溶液于超濾管中，在轉(zhuǎn)速4000rpm條件下離心14min，得到含有游離DOX的下濾液，④⑤⑥組下濾液各加入1mol/L鹽酸2.4mL，再分別加水至3mL、3mL、6mL；⑦組下濾液加入800μL鹽酸，再加水至6mL；⑧組下濾液加入2mL鹽酸，再加水至6mL。將各組檢測液在波長480nm下用紫外可見分光光度計(jì)測定其吸光度。

計(jì)算原溶液DOX含量和下濾液DOX量，計(jì)算包封率。包封率公式（1）所示。

式中，W總表示納米顆粒投入總藥量；W游表示下濾液中DOX的量，即未裝載的DOX量。

分析穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)與包封率檢測的結(jié)果可得最優(yōu)處方是TA:FeCl3:DOX=1:1:5，如圖2所示。

圖2 不同比例的TA-Fe-DOX所得納米顆粒的包封率

(6)納米顆粒表征

將經(jīng)過處方篩選制備的TA-Fe載體和最優(yōu)處方TA-Fe-DOX納米顆粒進(jìn)行粒徑檢測得到粒徑分布圖，并對TA-Fe-DOX納米顆粒進(jìn)行電鏡檢測，觀察電鏡圖。根據(jù)此方案制備出的納米顆粒粒徑分布如圖3所示，空白載體的粒徑為135nm，TA-Fe-DOX納米顆粒的粒徑為190nm。

圖3 （A）TA-Fe空白載體與（B）TA-Fe-DOX納米顆粒的粒徑分布圖

電鏡圖4所示，制備的納米顆粒粒徑均勻，電鏡下呈類球形，表面光滑，直徑在50nm以內(nèi)。

圖4 TA-Fe-DOX納米顆粒的形貌圖

(7)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

最優(yōu)處方制得的納米顆粒在一天和一周的粒徑及PDI變化作為考察其穩(wěn)定性的依據(jù)。一天中粒徑和PDI檢測時(shí)間：0h、0.5h、2h、4h、8h、24h。一周中檢測時(shí)間：1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d。制備的納米顆粒在一天和一周的粒徑及PDI變化結(jié)果，如圖5所示。

圖5 TA-Fe-DOX納米顆粒在一周的粒徑變化

由上述結(jié)果可知，以1:1:5比例制備所得的TA-Fe-DOX納米顆粒粒徑在一周內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(8)體外釋放實(shí)驗(yàn)

取2mL最優(yōu)處方制得的納米顆粒于透析袋中，放入以pH為4.5、5.0和7.4的80mL的PBS磷酸鹽緩沖溶液為體外釋放介質(zhì)的100mL磨砂口帶塞錐形瓶中，在37℃恒溫空氣浴振蕩器中進(jìn)行24h體外釋放實(shí)驗(yàn)，0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h時(shí)在錐形瓶中取樣3mL并及時(shí)補(bǔ)充3mL新制對應(yīng)pH的PBS磷酸鹽水溶液使其體積保持80mL。取得的樣品液在480nm波長下用紫外可見分光光度計(jì)定量檢測藥物釋放量，繪制DOX的累積釋放曲線。體外釋放結(jié)果如圖6所示。

圖6 納米顆粒在不同釋放介質(zhì)中的釋放曲線

由圖6可見，在藥物釋放初期，納米顆粒藥物釋放速率較大；但在8h之后，藥物釋放速率逐漸降低。在不同的釋放介質(zhì)中，通過對最終累計(jì)pH釋放率的比較，可見TA-Fe-DOX納米顆粒在pH=4.5的磷酸鹽緩沖溶液PBS釋放介質(zhì)環(huán)境下釋放的藥物最多，在pH為7.4的介質(zhì)中釋放率最低。pH為4.5釋放介質(zhì)中的釋放量一直高于pH為7.4和pH為5.0介質(zhì)中的納米顆粒釋放量，所以納米顆粒在腫瘤細(xì)胞的酸性環(huán)境內(nèi)釋放速率快，而在體循環(huán)中釋放速率較慢，因此可降低對正常組織的毒性。

(9)TA-Fe-DOX納米顆粒對4T1細(xì)胞的毒性作用

①納米顆粒的制備。精密稱取25g DOX于EP管中，加入25mL去離子水，得濃度為1.724mM的DOX溶液。再精密稱取TA 14.63mg和FeCl32.3245mg，分別將TA和FeCl3用12.5mL去離子水溶解，將兩者按TA、FeCl3的順序在43℃超聲波條件下進(jìn)行混合，得到1.725mM的TAFeCl3混合液。再稱取DOX 25mg，TA 14.63mg，F(xiàn)eCl32.3245mg，分別用833μL的去離子水溶解，在43℃超聲波條件下按TA、FeCl3、DOX順序進(jìn)行混合，得濃度為1.724mM的納米顆粒制劑組。

②細(xì)胞給藥。細(xì)胞給藥時(shí)分為三大組，即游離DOX組、TA-FeCl3混合液組、TA-Fe-DOX納米顆粒制劑組，并根據(jù)含量在三組之內(nèi)分出不同濃度，即濃度為4.31μM、8.62μM、12.93μM、17.24μM、21.55μM的稀釋液。

給藥時(shí)將培養(yǎng)好的細(xì)胞板拿出，用注射器吸干培養(yǎng)液后，按預(yù)定濃度順序在每個(gè)孔中依次加入稀釋液100μL，并在每個(gè)細(xì)胞板上設(shè)置空白對照組。將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h。

③細(xì)胞毒性檢測。采用MTT法檢測4T1細(xì)胞中TAFe、游離DOX和納米顆粒TA-Fe-DOX的體外毒性作用。以TA-Fe為陰性對照組、游離DOX為陽性對照組來評價(jià)TA-Fe-DOX納米顆粒的抗腫瘤活性。

顯色實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先使用pH7.4的磷酸鹽緩沖液將MTT溶解成5mg/mL的溶液。將給藥的96孔板從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出后，每孔加入20μL MTT溶液。加好后再將96孔板放回二氧化碳培養(yǎng)箱，等待4h。4h后取出，用一次性注射器將染色液吸出，加入150μL的二甲基亞砜，再放回二氧化碳培養(yǎng)箱，等待15min。15min后，用酶標(biāo)儀在490nm波長下進(jìn)行測定，得出吸光度，由式（2）算出細(xì)胞存活率。

式中，OD實(shí)驗(yàn)組代表實(shí)驗(yàn)組吸光度；OD對照組代表對照組吸光度。

由圖7可得，在濃度范圍4.31～21.55μM內(nèi)，空白載體組的細(xì)胞存活率均在90%以上，高達(dá)98%，說明空白載體TA-Fe在濃度低于21.55μM時(shí)，對4T1腫瘤細(xì)胞是幾乎沒有毒性作用的。

圖7 不同濃度TA-Fe-DOX納米顆粒的的細(xì)胞存活率

由此可以得出TA-Fe-DOX納米顆粒和游離DOX對腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的殺傷作用。當(dāng)游離DOX組即陽性對照組和制劑組TA-Fe-DOX的濃度為4.31μM時(shí)，他們對腫瘤細(xì)胞的毒性作用差別不大，細(xì)胞存活率比較高。但是隨著制劑組TA-Fe-DOX納米顆粒的濃度變大，4T1腫瘤細(xì)胞的相對存活率大幅下降，而陽性DOX組的細(xì)胞存活率下降緩慢。TA-Fe-DOX納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的抑制率高達(dá)88%，表明TA-Fe-DOX納米顆粒的毒性大于游離DOX，有良好的抗腫瘤作用。

2.結(jié)果與討論

以TA-Fe為載體，通過配位自組裝制備了DOX納米顆粒。TA:FeCl3:DOX三者摩爾比1:1:5制備所得納米顆粒穩(wěn)定性較好，包封率相對較高。納米顆粒呈類球形，表面光滑，顆粒大小均一，直徑約為190nm。制得的納米顆粒比游離DOX毒性作用好，有pH響應(yīng)性釋藥的優(yōu)勢，隨著給藥濃度的增加，其對4T1腫瘤細(xì)胞的毒性作用明顯強(qiáng)于游離DOX，且載體TA-Fe幾乎沒有毒性。

實(shí)驗(yàn)中以TA-Fe為載體制備DOX的納米顆粒，DOX和Fe3+可以配位，F(xiàn)e3+和TA可以配位，三者通過配位自組裝形成納米顆粒，制備簡便且綠色，沒有添加任何有機(jī)試劑。DOX對心臟、腎臟和肝臟有一定的毒性，而且能引起重度脫發(fā)。通過物理包裹可以實(shí)現(xiàn)DOX的腫瘤靶向，并在保留其抗腫瘤活性的同時(shí)降低對心臟的毒性。TA具有較高的藥物裝載能力，實(shí)現(xiàn)了藥物的弱酸性pH響應(yīng)釋放。Fe用于納米遞送系統(tǒng)后，展現(xiàn)了良好的生物組織相容性，低毒副作用、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)等一系列重要優(yōu)勢。

3.結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過簡便且綠色的配位交聯(lián)法制備了粒徑均勻、表面光滑的TA-Fe-DOX納米顆粒，經(jīng)過處方篩選實(shí)驗(yàn)得到該納米顆粒的最優(yōu)配比為1:1:5，并以TA:FeCl3:DOX加入順序制得的納米顆粒穩(wěn)定性最好，包封率最高，在一周內(nèi)穩(wěn)定性良好。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明所制得的納米顆粒無毒，在具有pH響應(yīng)性釋藥性能的同時(shí)也增強(qiáng)了DOX的抗腫瘤活性，為腫瘤治療提供新的思路和實(shí)際參考意義。