劉靜，蔡延渠，李夢陽，謝朋飛*，王俊杰，張遠(yuǎn)芳，劉思妤

（1.郴州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖南 郴州 423000；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006；3.湘南學(xué)院，湖南 郴州 423000）

楓楊（Pterocarya stenopteraC.DC）為胡桃科楓楊屬植物，在我國各地均有分布。其皮、葉、果實(shí)、根等均可入藥，文獻(xiàn)報(bào)道，楓楊中含有萘醌類、甾醇類、多糖類、萜類、鞣質(zhì)類等化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗病毒、殺滅釘螺等作用[1?4]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，天然植物多糖具有多種良好的生物活性，如抗肝損傷、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等[5?6]，尤其是在增強(qiáng)免疫、抗疲勞方面，如已報(bào)道的黃芪多糖[7?8]、石斛多糖[9?10]等，更是越來越多地開發(fā)應(yīng)用于藥品、保健品、食品等產(chǎn)業(yè)，然而楓楊葉多糖在這方面的活性研究尚未有相關(guān)研究報(bào)道。課題組前期已篩選出楓楊葉多糖最優(yōu)提取工藝，同時(shí)展開抗氧化活性等研究［11］；本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步純化楓楊葉多糖，擬通過小鼠增強(qiáng)免疫力和抗疲勞的藥理模型，對楓楊葉多糖的增強(qiáng)免疫功能及抗疲勞作用進(jìn)行研究與評價(jià)，以期為楓楊葉多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

UV-1700 雙光束紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；KDC-140HR 高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；LB940 多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；CP-225D 電子天平（0.01 mg，德國賽多利斯公司）；JJ1000Y 電子天平（美國雙杰集團(tuán)有限公司）。

1.2 試藥

楓楊葉樣品采自湖南郴州，經(jīng)湘南學(xué)院王俊杰教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊（Pterocarya stenopteraC. DC）的葉。D-無水葡萄糖對照品（99.9%，中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201707）；2，4-二硝基氟苯（DNFB，上海西亞試劑有限公司產(chǎn)品，批號C10362633）；環(huán)磷酰胺（上海源葉生物科技有限公司，批號X16M10Y83260）；印度墨水（上海源葉生物科技有限公司，批號L15M10G830 70）；超氧化物歧化酶（SOD，批號：20190602）、丙二醛（MDA，批號：20190503）試劑盒：（南京建成生物工程研究所）；其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半；由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0002。實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件：室溫20～25 ℃，日溫差≤3 ℃，濕度40%～70%。本研究經(jīng)湘南學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)（2022 DWLL066）。

2 方法

2.1 楓楊葉多糖的制備

將楓楊葉干燥、粉碎，稱取一定量粗粉，加入40倍量60%（φ）乙醇加熱提取2 次、3.5 h/次[11]，藥液75 ℃減壓濃縮至適宜濃度，再加入無水乙醇至含醇體積分?jǐn)?shù)為85%，冰箱4 ℃靜置12 h，棄去上清液，取沉淀物進(jìn)行冷凍干燥，所得物質(zhì)為楓楊葉多糖；采用苯酚-硫酸法[12]測得多糖得率為（3.93±0.74）%，多糖含量為（74.86±3.78）%（n=3）。

2.2 楓楊葉多糖調(diào)節(jié)免疫功能的研究

參考文獻(xiàn)［13-14］中所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法等進(jìn)行方案設(shè)計(jì)及操作。

2.2.1 楓楊葉多糖對小鼠免疫器官的影響 將小鼠隨機(jī)分成空白對照組、模型組、楓楊葉多糖高劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（50 mg/kg）、低劑量組（25 mg/kg），每組10 只?？瞻讓φ战M、模型組按20 mL/kg 灌胃給予生理鹽水，楓楊葉多糖組分別灌胃給予不同劑量藥物，1 次/d，連續(xù)30 d。從第31 天開始，除空白對照組外，其余各組小鼠每天按0.2 mL/10 g腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)5 d。末次給藥1 h 后，脫頸處死小鼠，精密稱定胸腺和脾臟質(zhì)量（mg），根據(jù)公式計(jì)算臟器系數(shù)。

2.2.2 楓楊葉多糖對小鼠碳廓清能力的影響 分組及給藥同“2.2.1”項(xiàng)下操作。從第31天開始，除空白對照組外，其余各組小鼠按0.2 mL/10 g 進(jìn)行腹腔注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)5 d。在第35 天給藥1 h 后，尾部靜脈注射稀釋的印度墨水（5 mL/kg），于注射后2 min 和8 min 進(jìn)行眼眶取血20 μL，加入裝有2 mL的0.1%碳酸氫鈉溶液中，混勻；在酶標(biāo)儀600 nm 波長處測定吸光度值A(chǔ)1（2 min 樣品）和A2（8 min 樣品），以0.1%碳酸氫鈉溶液作為空白對照。同時(shí)脫頸處死小鼠，精密稱定胸腺和脾臟質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α值。

2.2.3 楓楊葉多糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響分組及給藥同“2.2.1”項(xiàng)下操作。第31天，在小鼠腹部剃毛約3 cm×3 cm，并涂上1% 二硝基氟苯50 μL；第35 天于小鼠右耳涂上1%二硝基氟苯10 μL，24 h 后脫頸處死小鼠，于兩耳相同部位以打孔器各打取一片直徑6 mm 的耳片，精密稱定質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算腫脹度。

2.3 楓楊葉多糖抗疲勞的研究

參考文獻(xiàn)[13，15-16]中所用實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法等進(jìn)行方案設(shè)計(jì)及操作。

2.3.1 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn) 將小鼠隨機(jī)分為空白組、楓楊葉多糖高、中、低劑量組，每組10只，空白對照組按20 mL/kg 灌胃給予生理鹽水，各藥物組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，1次/d，連續(xù)灌胃30 d；末次給藥1 h 后稱量體質(zhì)量，在小鼠尾部負(fù)重其體質(zhì)量5%的鉛絲，放入水溫（25±1）℃自制水槽中進(jìn)行游泳，記錄小鼠自游泳開始至死亡（以小鼠沉入水中后未有張口呼吸為判斷標(biāo)準(zhǔn)）的時(shí)間（min）。

2.3.2 小鼠耐缺氧試驗(yàn) 分組及給藥同“2.3.1”項(xiàng)下操作；末次給藥1 h 后將小鼠放入內(nèi)置已點(diǎn)燃蠟燭的廣口瓶中，蓋緊后以凡士林封口，記錄從蠟燭熄滅至小鼠停止呼吸的時(shí)間（min）。

2.3.3 小鼠血清SOD、MDA 含量的測定 分組及給藥同“2.3.1”項(xiàng)下操作；末次給藥1 h 后讓小鼠自由游泳30 min，摘眼球取血，血樣于冷凍離心機(jī)3 500 r/min 離心10 min，取上清液，分別按照試劑盒說明書方法測定血清中SOD和MDA含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用軟件GraphPad Prism 5 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 楓楊葉多糖調(diào)節(jié)免疫功能評價(jià)

3.1.1 楓楊葉多糖對小鼠免疫器官的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01），表明通過注射環(huán)磷酰胺能夠引起小鼠胸腺、脾臟的顯著萎縮，降低免疫功能。與模型組相比，楓楊葉多糖中、高劑量組均可顯著提高小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)（P＜0.05 或P＜0.01），明顯拮抗環(huán)磷酰胺所致免疫器官萎縮，有效提高小鼠自身免疫功能。見表1。

表1 楓楊葉多糖對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on thymus index and spleen index in mice(，n=10)

表1 楓楊葉多糖對小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響Table 1 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on thymus index and spleen index in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

?

3.1.2 楓楊葉多糖對小鼠碳廓清能力的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠的廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α顯著降低（P＜0.01），表明注射環(huán)磷酰胺能夠弱化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能。與模型組相比，中、高劑量組能夠明顯提高小鼠廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α（P＜0.05），表明楓楊葉多糖能夠增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力。見表2。

表2 楓楊葉多糖對小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on carbon clearance index and phagocytosis index in mice(，n=10)

表2 楓楊葉多糖對小鼠廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響Table 2 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on carbon clearance index and phagocytosis index in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05。

?

3.1.3 楓楊葉多糖對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠的耳腫脹度明顯降低（P＜0.01），表明注射環(huán)磷酰胺能夠顯著抑制小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能。與模型組比較，楓楊葉多糖中、高劑量均能顯著提高小鼠耳腫脹度（P＜0.05或P＜0.01），表明楓楊葉多糖能夠提高小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力。見表3。

表3 楓楊葉多糖對小鼠耳腫脹度的影響Table 3 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on ear swelling in mice(，n=10)

表3 楓楊葉多糖對小鼠耳腫脹度的影響Table 3 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on ear swelling in mice(，n=10)

與空白對照組比較：##P ＜0.01；與模型組比較：*P ＜0.05，**P ＜0.01。

?

3.2 楓楊葉多糖抗疲勞作用評價(jià)

3.2.1 楓楊葉多糖對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、耐缺氧時(shí)間的影響 與空白對照組比較，楓楊葉多糖低劑量組對小鼠耐缺氧時(shí)間及負(fù)重游泳時(shí)間無顯著性影響（P＞0.05），中、高劑量組均能顯著性地延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和耐缺氧時(shí)間（P＜0.05 或P＜0.01），表明楓楊葉多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體代謝功能，改善體內(nèi)微循環(huán)。結(jié)果見表4。

表4 楓楊葉多糖對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和耐缺氧時(shí)間的影響Table 4 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on weight-bearing swimming time and hypoxia tolerance time in mice(，n=10)

與空白對照組比較：#P ＜0.05，##P ＜0.01。

?

3.2.2 楓楊葉多糖對小鼠血清SOD、MDA含量的影響 與空白對照組比較，楓楊葉多糖低、中劑量組對小鼠血清中SOD 與MDA 含量均無顯著性影響（P＞0.05）；高劑量組能夠顯著提高小鼠血清中的SOD含量，降低MDA 含量（P＜0.05）。表明楓楊葉多糖在高劑量下能夠增強(qiáng)小鼠組織的抗氧化能力，減少細(xì)胞膜脂過氧化損傷。見表5。

表5 楓楊葉多糖對小鼠血清SOD、MDA含量的影響Table 5 Effect of polysaccharide from Pterocarya stenoptera leaves on serum SOD and MDA content in mice(，n=10)

與空白對照組比較：#P ＜0.05。

?

4 討論

目前天然植物多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞功能方面的研究較多，課題組前期亦系統(tǒng)性地綜述了中藥多糖增強(qiáng)免疫、抗疲勞作用[17]。本實(shí)驗(yàn)基于文獻(xiàn)所報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法對楓楊葉多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞功能方面進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

免疫功能對于人體健康十分重要，脾臟和胸腺是重要的中樞和外周免疫器官，可起到清除病原和防止病原入侵的重要作用。本文通過環(huán)磷酰胺所致急性免疫力低下小鼠模型、碳粒廓清實(shí)驗(yàn)與二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)性評價(jià)楓楊葉多糖對小鼠免疫器官、單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，楓楊葉多糖能夠促進(jìn)小鼠胸腺及脾臟的生長，提高肝臟與脾臟巨噬細(xì)胞功能，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力，從而拮抗環(huán)磷酰胺所致的器官萎縮等癥狀，促進(jìn)免疫力低下小鼠各臟器組織的修復(fù)與健康。楓楊葉多糖具有良好的增強(qiáng)免疫功能作用，且呈劑量依賴性。在同等作用效果下，楓楊葉多糖的劑量高于黃芪多糖[7]，等同于枸杞多糖[18]，低于靈芝多糖[19]、西洋參多糖[20]等。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基可引發(fā)細(xì)胞膜損傷、核酸與DNA損傷、蛋白變性、酶失去活性等，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生與惡化[21]。SOD 是體內(nèi)最主要的自由基清除劑，MDA 為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，二者可用于評價(jià)運(yùn)動(dòng)疲勞程度[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楓楊葉多糖能夠延長小鼠負(fù)重游泳時(shí)間和耐缺氧時(shí)間，提高血清中SOD 含量，降低MDA 含量，有效起到抗疲勞作用，且其起效劑量（100 mg/mg）與龍眼多糖[23]、五味子多糖[24]、紅棗多糖[25]、黨參多糖[26]、石斛多糖[10]等傳統(tǒng)補(bǔ)益藥相當(dāng)。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，小鼠服用楓楊葉多糖后明顯改善免疫功能，促使機(jī)體內(nèi)的肝糖原等能量儲備增加、利用率提高，從而在體外表現(xiàn)為明顯延長負(fù)重游泳、耐缺氧的時(shí)間；在體內(nèi)表現(xiàn)為提高血清中SOD 含量、降低MDA 含量。增強(qiáng)免疫力、抗疲勞相輔相成，一方面，增強(qiáng)免疫力有助于提高免疫系統(tǒng)識別和清除異常細(xì)胞的能力，降低機(jī)體慢性疾病發(fā)生的概率；另一方面，免疫力低下與機(jī)體過度勞累緊密相關(guān)，特別是現(xiàn)代生活中，長期熬夜所導(dǎo)致的睡眠不足，極易引發(fā)機(jī)體疲勞，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞、免疫力降低，誘發(fā)心梗、心肌炎等各種急慢性疾病，所以，抗疲勞也是增強(qiáng)免疫力的一種方式。

綜上，楓楊葉多糖具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力及抗疲勞作用，提示可作為新型免疫佐劑和抗疲勞制劑應(yīng)用于藥品、保健品、食品等工業(yè)中，其具體的抗疲勞、免疫機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。