顏志鵬，杜小康，楊鴻遒，溫志剛，余騰燁，劉云，陳珺，2

（1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)生物資源與創(chuàng)新藥物研究中心，廣東 廣州 510006）

成骨細(xì)胞是主導(dǎo)骨形成的功能細(xì)胞，在骨骼發(fā)育、重塑和再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1]，其數(shù)量與功能的變化與代謝性骨病（如骨質(zhì)疏松癥）的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，是進(jìn)行藥物篩選和研發(fā)的主要靶細(xì)胞之一。楮實(shí)子（Fructus Broussonetiae,FB）收載于《中國(guó)藥典》（2020 年版）一部，為?？浦参飿?gòu)樹(shù)的干燥成熟果實(shí)，具有補(bǔ)腎清肝、明目利尿等作用，常用于腰膝酸軟、虛勞骨蒸等病癥[2]。歷代醫(yī)家認(rèn)為其“味甘，性寒，無(wú)毒”，《名醫(yī)別錄》載楮實(shí)功用大補(bǔ)益，《日華子本草》云楮實(shí)壯筋骨[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其可抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗衰老[6]，具有治療阿爾茲海默癥、肝硬化、腹腔積液等的潛力[7?8]，但尚未見(jiàn)楮實(shí)子影響成骨細(xì)胞功能的文獻(xiàn)報(bào)道。楮實(shí)子中含有楮實(shí)子油、氨基酸、黃酮類化合物、生物堿、皂苷類和多糖等成分[9]，其中黃酮類化合物包括紅色素、芹菜素、槲皮素等[10]，研究表明黃酮類化合物多具有抗成骨細(xì)胞凋亡[11]和促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化礦化[12?15]等生物活性，因此推測(cè)，楮實(shí)子提取物可能對(duì)成骨細(xì)胞功能產(chǎn)生積極影響。

本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法，將楮實(shí)子水煎劑灌胃大鼠后分取血清，作用于原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞，觀察含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及其功能的影響，為楮實(shí)子在代謝性骨病防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 月齡SPF 級(jí)雌性SD 大鼠16 只，體質(zhì)量（300 ± 20）g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002；SD 大鼠乳鼠（＜24 h），購(gòu)自珠海百事通生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理審查，批準(zhǔn)號(hào)gdpu‐lacspf2017477。

1.1.2 試劑 楮實(shí)子（康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：200604531），由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院馬鴻雁副教授鑒定為正品；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco 公司，批號(hào)：8122595）；胎牛血清（Gibco 公司，批號(hào)：42F1394K）；EDTA（Sigma 公司，批號(hào)：BCBV2141）；β-甘油磷酸鈉（Sigma 公司，批號(hào)：BCCC6949）；地塞米松（Sigma公司，批號(hào)：D1756）；維生素C（Sigma公司，批號(hào)：SLBN3883V）；I 型膠原酶（Sigma 公司，批號(hào)：17100-017）；MTT（噻唑藍(lán)，Amresco 公司，批號(hào)：475989）；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A059-2-2）；水合氯醛（麥克林，批號(hào)：C12195151）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：121820210409）；茜素紅S（北京索萊寶公司，批號(hào)：20160127）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海貝博科技有限公司，批號(hào)：062122220804）；RIPA 裂解液（強(qiáng)）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：061721210930）；β-actin鼠單克隆抗體（Abcam公司，批號(hào)：ab8226）；OSX 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab209484）；Coll-I 鼠單克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab6308）；ALP 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab95462）；OPN 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab8448）；OPG 兔單克隆抗體（Abcam 公司，批號(hào)：ab73400）；辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記二抗鼠抗（Abcam公司，批號(hào)：ab6789）；辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記二抗兔抗（Abcam公司，批號(hào)：ab6721）。

1.1.3 主要儀器 SW-CT 系列潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Galaxy S+系列二氧化碳培養(yǎng)箱（New Brunswick Scientific 公司）；TDZ5-WS 臺(tái)式多管低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）；J-D200 倒置生物顯微鏡（深圳拓天儀器設(shè)備有限公司）；沃特浦wp-up-uv-20 型實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)（四川沃特爾水處理有限公司）；Sorvall ST 16R 型4 ℃高速離心機(jī)（Thermo fisher Scientific 公司）；PowerPac HC電泳儀（Bio-Rad公司）；Tanon 4100 凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Microplate Reader 680 酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）等。

1.2 含藥血清制備與含藥（空白）培養(yǎng)基配制

含藥血清的制備：取10 g 楮實(shí)子與100 mL 蒸餾水混合，浸泡1 h 后煎煮1.5 h，濾出藥液，過(guò)濾后的藥渣再加100 mL 蒸餾水煎煮1.5 h，合并2 次濾液，濃縮制成終質(zhì)量濃度為200 mg/mL 的楮實(shí)子水煎劑。SD 大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（8 只）和藥物組（8 只），分別灌胃生理鹽水（5 mL/kg）和楮實(shí)子水煎劑（生藥含量1 g/kg），連續(xù)灌胃10 d，劑量按臨床用量換算；末次給藥前大鼠禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h，5%（φ）水合氯醛麻醉大鼠后，進(jìn)行心臟穿刺采血并分離血清，每組血清混勻、過(guò)濾除菌后分裝，置于?80 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將空白血清及含藥血清用無(wú)血清成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含終濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10?8mol/L 地塞米松和50 mg/L 維生素C 的DMEM 高糖培養(yǎng)基）配成終濃度分別為5%、10%、20%的培養(yǎng)基。

1.3 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

新生乳鼠處死后置于75%（φ）酒精中浸泡消毒10 min，無(wú)菌操作分取顱骨置于含磷酸緩沖溶液（PBS）的培養(yǎng)皿中，清除骨膜、血管和結(jié)締組織后剪成1 mm3大小的骨片，加入胰酶-EDTA 溶液消化15 min（37 ℃），棄去消化液后加入I 型膠原酶消化1 h（37 ℃），3 000 r/min 離心5 min，棄上清，再次加入I 型膠原酶37 ℃消化1 h（37 ℃），離心并棄上清后加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%（φ）CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)以酶消化法傳代培養(yǎng)，從P2代細(xì)胞開(kāi)始使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入終濃度為10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、10?8mol/L地塞米松和50 mg/L 維生素C）培養(yǎng)。取P3-P5 代成骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 成骨細(xì)胞鑒定

取P3 代成骨細(xì)胞接種于24 孔板，培養(yǎng)24 h 細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，95%乙醇固定細(xì)胞后根據(jù)AKP 染液試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行染色并在倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 成骨細(xì)胞增殖率檢測(cè)

成骨細(xì)胞以1×104個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于96孔板，設(shè)5%、10%、20%空白血清對(duì)照組，5%、10%、20%含藥血清組，每組6復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基并加入MTT 試劑100 μL，37 ℃孵育4 h 后去除上清液，加入100 μL DMSO 溶液，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。分別以同濃度空白血清組為對(duì)照計(jì)算同濃度含藥血清組成骨細(xì)胞的相對(duì)存活率；以5%空白血清組為對(duì)照組計(jì)算10%和20%空白血清組成骨細(xì)胞的相對(duì)存活率；以5%含藥血清組為對(duì)照組計(jì)算10%和20%含藥血清組成骨細(xì)胞的相對(duì)存活率。

1.6 成骨細(xì)胞AKP活性和礦化結(jié)節(jié)檢測(cè)

成骨細(xì)胞以2×104個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于24孔板，設(shè)10%空白血清對(duì)照組和10% 含藥血清組，每組5復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，吸取適量上清液，按AKP試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。連續(xù)培養(yǎng)21 d后，以茜素紅染液染色，觀察礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量、體積與著色，并通過(guò)BIOQUANT OSTEO 自動(dòng)圖像分析軟件計(jì)數(shù)各組細(xì)胞20倍鏡下5個(gè)視野的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.7 成骨細(xì)胞蛋白提取與成骨功能指標(biāo)相關(guān)基因的蛋白表達(dá)測(cè)定

成骨細(xì)胞以5×108個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種于10 cm×10 cm 培養(yǎng)皿，分組處理同“1.6”。培養(yǎng)48 h后，加入RIPA 蛋白抽提試劑提取總蛋白，按BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組蛋白濃度。各組取等量蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），再以含5%脫脂奶粉的TBST 溶液進(jìn)行封閉處理，封閉完成的膜經(jīng)TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入一抗（1∶3 000），置于4 ℃搖床輕搖過(guò)夜，第2 天室溫孵育1 h并經(jīng)TBST 洗膜3 次（每次5 min）后加入二抗（1∶5 000），4 ℃搖床輕搖1 h，TBST 洗膜3 次（每次5 min），經(jīng)曝光、顯影、定影后，以Uvipro凝膠成像系統(tǒng)掃描并采用Image J 軟件測(cè)量各蛋白條帶吸光度值，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白的吸光度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞的鑒定

原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)12～24 h 后開(kāi)始伸展貼壁，48～72 h 貼壁完全；經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細(xì)胞呈飽滿的多角形或梭形，連續(xù)培養(yǎng)7 d 后，細(xì)胞大多呈多角立方形，細(xì)胞中央可見(jiàn)輪廓清晰的圓形或卵圓形細(xì)胞核，經(jīng)AKP染色后細(xì)胞呈藍(lán)紫色（如圖1）。

圖1 成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色鑒定Figure 1 Identification of osteoblasts by alkaline phosphatase staining（40×）

2.2 楮實(shí)子對(duì)成骨細(xì)胞增殖率的影響

成骨細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果如表1 所示，楮實(shí)子各濃度含藥血清實(shí)驗(yàn)組所測(cè)得A 值均高于空白血清對(duì)照組，說(shuō)明楮實(shí)子含藥血清可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖（P＜0.01）；不同濃度空白血清組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與5%含藥血清組相比，10%和20%含藥血清組成骨細(xì)胞增殖率明顯提高（P＜0.05），但10%和20%含藥血清組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合文獻(xiàn)[16]，選擇10%含藥血清濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 成骨細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

表1 成骨細(xì)胞增殖率測(cè)定結(jié)果Table 1 Proliferation of osteoblasts(,n=6)

注：1.與同濃度空白血清組比較計(jì)算相對(duì)增殖率，與同濃度空白血清組比較：**P＜0.01；2.與5%空白血清組比較計(jì)算相對(duì)增殖率；3.與5%含藥血清組比較計(jì)算相對(duì)增殖率，與5%含藥血清組比較：#P＜0.05。

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2.3 楮實(shí)子對(duì)成骨細(xì)胞AKP 活性和礦化結(jié)節(jié)形成的影響

成骨細(xì)胞AKP 活性檢測(cè)結(jié)果如表2 所示，10%含藥血清組成骨細(xì)胞的AKP 活力明顯高于10%空白血清組（P＜0.01），說(shuō)明楮實(shí)子含藥血清能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果如圖2 所示，計(jì)數(shù)結(jié)果如表2 所示。與10%空白血清組相比，10%含藥血清組成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)體積明顯增大，數(shù)量明顯增加（P＜0.01），說(shuō)明楮實(shí)子含藥血清可以促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。

表2 成骨細(xì)胞AKP活力測(cè)定結(jié)果與礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

表2 成骨細(xì)胞AKP活力測(cè)定結(jié)果與礦化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 AKP vitality of osteoblasts and the number of miner‐alized nodules of osteoblasts(,n=6)

與同濃度10%空白血清組比較：**P＜0.01。

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圖2 成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)染色結(jié)果（A圖：1×，B圖：20×）Figure 2 Staining results of mineralized nodules in osteoblasts

2.4 成骨細(xì)胞功能指標(biāo)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

Western blot 結(jié)果如圖3 所示，10%含藥血清組成骨細(xì)胞上OSX、Coll-I、ALP、OPN 和OPG 的蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），說(shuō)明楮實(shí)子對(duì)成骨細(xì)胞的骨形成有積極作用。

圖3 成骨功能指標(biāo)基因的蛋白表達(dá)Figure 3 Expression of osteogenic function indicator proteins(,n=3)

3 討論

楮實(shí)子是?？浦参飿?gòu)樹(shù)的干燥成熟果實(shí)，收載于《中國(guó)藥典》（2020 年版）一部，常用于肝腎不足、腰膝酸軟、虛勞骨蒸等病癥[2]，古籍載其功用大補(bǔ)益、能壯筋骨等[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)楮實(shí)子對(duì)小鼠多種實(shí)體瘤均有抑制作用，并能顯著清除羥基自由基，具有較強(qiáng)的體外抗氧化作用[4?5]；楮實(shí)子也具有抗皮膚光老化的能力[6]，并能抑制Aβ沉積、改善學(xué)習(xí)記憶能力[8]，但目前尚未見(jiàn)楮實(shí)子調(diào)節(jié)骨代謝、影響成骨細(xì)胞功能的文獻(xiàn)報(bào)道。

劉宏偉等[9?10]對(duì)楮實(shí)子的化學(xué)成分進(jìn)行提取并分析，發(fā)現(xiàn)楮實(shí)子中含有多種黃酮類化合物，如紅色素、芹菜素、槲皮素及淫羊藿等。另有研究認(rèn)為黃酮類化合物多具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化礦化的能力[17]，如槲皮素能恢復(fù)經(jīng)甲基乙二醛處理后的成骨細(xì)胞的GSK-3β磷酸化以及Nrf2 蛋白表達(dá)水平并能抑制該成骨細(xì)胞凋亡[11]；淫羊藿苷則能促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖，并通過(guò)激活BMP 等信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)鈣化[12?15]。因此推測(cè)，楮實(shí)子提取物可能對(duì)成骨細(xì)胞功能產(chǎn)生積極影響。

血清藥理學(xué)是指中藥或中藥復(fù)方按一定劑量給動(dòng)物灌胃一定時(shí)間后，采集動(dòng)物的血液并分離血清，以含藥血清作為藥物直接加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中來(lái)研究藥理機(jī)制的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法[18]。中藥所含化學(xué)成分在生物體內(nèi)環(huán)境下會(huì)發(fā)生復(fù)雜的代謝或生物轉(zhuǎn)化，即中藥煎煮后得到的化合物可能只是活性成分的前體，且將中藥直接作用于細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)較大的毒性反應(yīng)[19]，采用血清藥理學(xué)方法進(jìn)行研究則能通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察中藥的藥理效應(yīng)[20]。在血清藥理學(xué)研究中，含藥血清的制備需要考慮供體動(dòng)物種屬的選擇，供體動(dòng)物是否需要造模，以及藥物的給藥方式、時(shí)間及采血時(shí)間等問(wèn)題[21]。本實(shí)驗(yàn)中，制備含藥血清的動(dòng)物與提取原代成骨細(xì)胞的動(dòng)物種屬一致，可以有效避免實(shí)驗(yàn)受到因種屬差異帶來(lái)的免疫源性等不利影響[22]；參照楮實(shí)子的臨床給藥劑量（6～12 g/d）[2]，按《中藥藥理研究方法學(xué)》中人與大鼠體表面積系數(shù)法計(jì)算大鼠實(shí)驗(yàn)劑量為0.9 ～1.8 g/kg[23]，本實(shí)驗(yàn)中以1 g/kg 劑量連續(xù)灌胃給藥10 d，以確保含藥血清濃度達(dá)到穩(wěn)定[24]。

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與同濃度空白血清組相比，楮實(shí)子含藥血清在5%、10%和20%濃度時(shí)均可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，但各濃度空白血清組組間無(wú)顯著性差異；扣除空白血清的影響后，10%和20%楮實(shí)子含藥血清組成骨細(xì)胞的增殖率明顯高于5%含藥血清組，但10%和20%楮實(shí)子含藥血清組組間無(wú)明顯差異，因此，選擇10%濃度的含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，這也與血清藥理學(xué)研究中公認(rèn)的血清添加濃度一致[16]。

骨形成過(guò)程中成骨細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)形成與成熟和基質(zhì)礦化3 個(gè)時(shí)期，期間將產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)礦化調(diào)節(jié)因子等多種生物活性物質(zhì)，并最終分化為成熟的骨細(xì)胞[25]。成骨細(xì)胞AKP活性能反映其分化能力，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量則能反映其礦化功能，本研究結(jié)果表明楮實(shí)子含藥血清能顯著提高成骨細(xì)胞的AKP 活性和礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，說(shuō)明楮實(shí)子能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和礦化。OSX、ALP、OPN 等蛋白是成骨細(xì)胞分化、礦化進(jìn)程中的標(biāo)志性蛋白，檢測(cè)其變化能反映成骨細(xì)胞的分化、礦化進(jìn)程和成骨功能[26?27]。本研究結(jié)果表明楮實(shí)子含藥血清能顯著上調(diào)OSX、Coll-I、ALP、OPN和OPG 等成骨功能標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平，說(shuō)明楮實(shí)子對(duì)成骨細(xì)胞的骨形成有積極作用。

綜上所述，楮實(shí)子能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化，并通過(guò)上調(diào)成骨調(diào)節(jié)因子促進(jìn)成骨細(xì)胞及細(xì)胞基質(zhì)的成熟，進(jìn)而增強(qiáng)成骨功能，但具體分子機(jī)制還有待后續(xù)研究深入探討。本研究結(jié)果表明楮實(shí)子具有防治代謝性骨病的潛力，為后續(xù)進(jìn)一步明確楮實(shí)子的骨保護(hù)作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。