馬 科,程源航,蘇澤宇

(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 煙草科學(xué)與工程學(xué)院,河南 鄭州 450008)

隨著人們回歸自然和食療觀念的興起,糖尿病專屬特醫(yī)食品、功能食品、藥膳等的開發(fā)和利用得到了人們的認(rèn)可和重視[1-5].利用這些新型食品輔助藥物治療,改善糖尿病與并發(fā)癥、減少病人對(duì)藥物的依賴,被認(rèn)為是一種更安全可靠的糖尿病治療新方式.

靈菊七(Gynuramedica.Y.K.Yang)是我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)并鑒定的菊三七屬新種[6],民間取其莖葉食用,對(duì)糖尿病顯示獨(dú)特療效.自被發(fā)現(xiàn)鑒定以來僅有我國學(xué)者對(duì)靈菊七降糖作用進(jìn)行研究.劉瑩等[7-8]首次報(bào)道了靈菊七降糖和急性毒研究,證明其有較好降糖功效,且無毒性、安全性高.相關(guān)學(xué)者通過動(dòng)物模型(包括鏈脲佐菌素誘導(dǎo)、高糖高脂飲食誘導(dǎo)、腎上腺素誘導(dǎo)、遺傳性等糖尿病模型)、細(xì)胞模型(MIN6 胰島細(xì)胞)驗(yàn)證了靈菊七水提物具有確切的降糖作用.并且通過安全性研究證明,與同屬其他植物相比,其無毒性,安全性高,具有巨大的抗糖尿病藥食產(chǎn)品開發(fā)潛力[9-13].

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性成分是2種重要的降糖活性成分[14-16],目前還沒有該植物中關(guān)于這兩類降糖活性成分的研究報(bào)道.為了闡明靈菊七降糖活性成分,本文從提取溶劑、加熱方式、提取時(shí)間、提取溫度、料液比5個(gè)方面對(duì)靈菊七活性蛋白提取工藝進(jìn)行研究,并檢測(cè)不同方法獲得的提取物對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用.通過以上研究,期望為靈菊七降糖藥食產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈菊七莖葉樣品：鄭州萬田生物科技公司提供,經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為菊科植物靈菊七(Gynuramedica.Y.K.Yang)的干燥莖葉;DNS試劑、蛋白檢測(cè)試劑盒、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶：生工生物工程(上海)有限公司;石油醚、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、吐溫20、吐溫80、十二烷基磺酸鈉(SDS)、可溶性淀粉、阿卡波糖、蕓豆蛋白提取物、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、二甲基亞砜：上海麥克林生化科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

DF-101S 水浴鍋：鞏義于華儀器公司;紅外輻射式烘箱：上海一恒科學(xué)儀器公司;超聲波提取器BCT-10L：上海利聞科學(xué)儀器有限公司;超聲波恒溫水浴提取器SCQ-HD300A：上海聲彥超聲波儀器有限公司;家用型微波爐：中國美的科技有限公司;紫外分光光度計(jì)UV-1800PC：梅特勒托利多科技(中國)有限公司;RE-100-S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德拉布科技有限公司;冷凍干燥機(jī)BILON-FD80AD：上海比朗儀器制造有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 靈菊七樣品前處理

取 200 g 干燥的靈菊七根莖,粉碎過0.077 mm篩,加入20倍體積的I類石油醚,50 ℃ 下浸提 2 h,過濾后的到除去油脂的靈菊七殘?jiān)?將殘?jiān)?40 ℃ 烘箱內(nèi)干燥除去石油醚.得到干燥的靈菊七樣品備用.

1.3.2 靈菊七蛋白提取工藝研究

1) 提取溶劑

選取磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、水、3%吐溫20、3%吐溫80、5%SDS作為提取溶劑,提取條件為料液比30∶1、提取溫度 60 ℃、提取時(shí)間 3 h.根據(jù)蛋白提取率來判斷出最適的提取溶劑.

2) 提取方式

紅外輻射加熱法 將樣品置于紅外輻射式烘箱,在溫度 50 ℃ 下提取 30 min.

微波加熱法 將樣品置于微波爐中,在設(shè)置為中溫檔下提取 5 min.

恒溫水浴加熱法 將樣品置于水浴鍋中,在 50 ℃ 條件下水浴提取 30 min.

超聲提取法 將樣品置于超聲波恒溫水浴,功率 100 W、室溫條件下超聲 30 min.

超聲輔助水浴加熱法 將樣品置于超聲波恒溫水浴,在設(shè)置功率 100 W、50 ℃ 條件下超聲水浴 30 min.其它條件與1)一致.

表1 3因素4水平的 BoxBehnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)(BBD)

1.3.3 靈菊七蛋白提取單因素

料液比 選取10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 5種料液比.其它條件與1)一致.

提取溫度 選取50、60、70、80和 90 ℃ 5個(gè)梯度.其它條件與1)一致.

提取時(shí)間 選取3、4、5、6和 7 h 5個(gè)梯度.其它條件與1)一致.

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以提取時(shí)間、提取溫度作為連續(xù)因子,提取方式作為類別因子,采用3因素4水平的BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(BBD)(表 1),對(duì)提取溫度(30、40、60、80 ℃);提取時(shí)間(1、3、5 h)和加熱方式(1水浴、2超聲水浴)進(jìn)行優(yōu)化.

1.3.5 靈菊七蛋白質(zhì)測(cè)定方法

1) 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,準(zhǔn)確稱取 1 mg 牛血清蛋白溶于 50 mL 蒸餾水中,即 10 mg/mL 原液,將原液梯度稀釋為1、2、3、4、5 mg/mL.測(cè)定方法參照BCA蛋白試劑盒檢測(cè),取適量的A液和B液按照50∶1體積比充分混勻,配置適量BCA工作液,取 20 μL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白和 200 μL BCA工作液混勻后,在 37 ℃ 條件下溫水浴 1 h 后于波長(zhǎng) 595 nm 下檢測(cè)吸光度.通過Origin繪制蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2) 樣品測(cè)定 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[19]報(bào)道,提取結(jié)束后,對(duì)提取液抽濾,取 20 μL 上清液,加入 200 μL BCA工作液,在 37 ℃ 條件下溫水浴 1 h 后于波長(zhǎng) 595 nm 下檢測(cè)吸光度,考慮到靈菊七浸提液顏色較重,以不加顯色劑的浸提液為空白對(duì)照組排除干擾.將樣品組吸光度減去空白對(duì)照組吸光度后,帶入到上述蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出蛋白濃度.

1.3.6 靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率測(cè)定方法

將 0.5 g 可溶性淀粉溶解到 100 mL 去離子水中,配置成 0.5 g/mL 溶液,并在 100 ℃ 條件下讓淀粉充分溶解,待到溶液澄清后,室溫冷卻降溫待用;取 0.05 gα-淀粉酶加入到 50 mL 磷酸鹽緩沖溶液中,充分溶解,配置成 0.05 g/50 mL 酶溶液,將 50 μL 酶液與 50 μL 分離組分在 40 ℃ 條件下相互作用 1 h,取 100 μL 混合液加入到 1 mL 淀粉溶液中,混勻后于 40 ℃ 恒溫反應(yīng) 15 min,取 100 μL 反應(yīng)液加入 200 μL 的DNS試劑,反應(yīng)液于沸水浴中加熱 5 min 后取出,并于冰水浴中迅速冷卻,取出 100 μL 加入 900 μL 水稀釋,于波長(zhǎng) 540 nm 處測(cè)定吸光度.按下式計(jì)算：

(1)

式中,A樣品為樣品反應(yīng)液吸光度;A空白為以磷酸鹽緩沖液代替酶的吸光度;A對(duì)照為以磷酸鹽緩沖液代替樣品的吸光度.

1.3.7 靈菊七浸提液對(duì)α-糖苷酶抑制率測(cè)定方法

將 10 mg 對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷溶于 100 μL 二甲基亞砜中,取 10 μL 上述溶液溶解在 990 μL 磷酸緩沖鹽溶液(0.1 mol/L,pH 6.8)中.取α-糖苷酶稀釋為0.4單位/mL.取 80 μL 酶液和靈菊七浸提液混合在 37 ℃ 條件下預(yù)培養(yǎng) 15 min,添加 40 μL 底物開始酶促反應(yīng),進(jìn)一步溫育 30 min.通過加入 1 mL 0.1 mol/L 的碳酸鈉中止酶活,在 405 nm 下測(cè)定吸光度.

1.4 浸提液的凍干、復(fù)溶與純化

將 1 L 浸提液放 -20 ℃ 冷凍 10 h,然后將樣品置冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥,獲得凍干物.

取凍干物加入到 10 mL 超純水中溶解.依次加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%的硫酸銨,使溶液產(chǎn)生沉淀,沉淀離心并冷凍干燥,獲得凍干物.

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

本次試驗(yàn)中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率數(shù)據(jù)均重復(fù)6次,結(jié)果表示均以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式呈現(xiàn).采用Design-Expert 8.0.6、Minitab進(jìn)行數(shù)據(jù)處理;采用Origin 2021 進(jìn)行圖表繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法對(duì)靈菊七蛋白提取的影響

加熱為活性蛋白從植物細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散到胞外提供能量,促進(jìn)蛋白的浸出,增加溶出速率和浸出率,并且不同加熱方式對(duì)提取的影響不同[17].本文研究了烘箱、微波、水浴、超聲、超聲水浴5種加熱方式對(duì)提取的影響,結(jié)果如圖1A所示,超聲輔助水浴和烘箱的蛋白提取率高于其它.因?yàn)樵诔暤倪^程中超聲產(chǎn)生的空壓可以破壞植物細(xì)胞膜,利于胞內(nèi)溶質(zhì)擴(kuò)散,從而導(dǎo)致更多的活性蛋白從植物細(xì)胞中釋放出來[18];烘箱加熱法通過紅外線輻射加熱使細(xì)胞內(nèi)部的水分快速氣化導(dǎo)致細(xì)胞破裂,從而促使蛋白從細(xì)胞內(nèi)釋放出來[19],但是對(duì)溫度需求較高,容易破壞蛋白的結(jié)果而導(dǎo)致其失去活性,因此超聲輔助水浴是最適的加熱方式.

提取溶劑作為蛋白的溶出的媒介對(duì)蛋白提取影響較大,不同溶劑對(duì)蛋白的溶解能力不同,提取效果差異較大[20].本文研究了磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、水、3%吐溫20、3%吐溫80、5%SDS 5種溶劑對(duì)靈菊七蛋白的提取率的影響.結(jié)果如圖1B所示,吐溫80提取靈菊七蛋白效率最高,其次為PBS.這是由于吐溫80作為表明活性劑,使細(xì)胞表面張力增大,蛋白更易從細(xì)胞中釋放出來[21],但是吐溫80提取物顏色較深,表明含有較多雜質(zhì),且考慮到PBS對(duì)與活性蛋白有保護(hù)作用,因此選用PBS作為最適的提取溶劑.

2.2靈菊七蛋白提取單因素研究

結(jié)果如圖2A所示,隨著料液比的增大蛋白提取率逐步增大,料液比達(dá)到30∶1、40∶1、50∶1后,蛋白提取率緩慢增長(zhǎng),因此選擇30∶1的料液比對(duì)最為合適.

如圖2B所示,40～60 ℃ 時(shí)候隨著溫度的增加,蛋白提取率增加,因?yàn)闇囟仍黾訒r(shí),有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的運(yùn)動(dòng),增加其溶解度,60 ℃ 以后隨著溫度的增加蛋白提取率在降低,高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,蛋白內(nèi)部的非極性基團(tuán)暴漏到表面,減少了蛋白的溶解度,隨著溫度的升高,對(duì)于蛋白質(zhì)活性的破壞程度也在不斷提升,很可能影響靈菊七浸提液對(duì)與α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶活性的影響,因此50～60 ℃ 為最適的提取溫度.

結(jié)果如圖2C所示,在1～3 h 內(nèi)靈菊七蛋白的提取率隨著時(shí)間的增加明顯升高,3 h 后蛋白提取率增加不明顯,考慮到過長(zhǎng)時(shí)間在高溫水浴條件下對(duì)蛋白活性的影響,因此選擇 3 h 作為最適的提取時(shí)間.

(A)加熱方法對(duì)靈菊七蛋白提取的影響 (B)提取溶劑對(duì)靈菊七蛋白提取的影響圖1 提取方法對(duì)靈菊七蛋白提取率的影響

(A)不同料液比對(duì)靈菊七蛋白 (B)不同提取溫度對(duì)于靈菊七蛋白 (C)不同提取時(shí)間對(duì)靈菊七蛋白 提取率的影響 提取率的影響 提取率的影響圖2 提取條件單因素研究

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

本文選取提取時(shí)間、提取溫度作為連續(xù)因子,提取方式作為類別因子,以總蛋白提取率和浸提液分別對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率作為結(jié)果,做了3組響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).

2.3.1 總蛋白提取率

由表2可知,通過Minitab軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析,模型p值<0.001,模型極顯著,失擬項(xiàng)p值0.609>0.05,模型的失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.回歸分析結(jié)果顯示,在蛋白提取過程中的影響因素中,A2項(xiàng)極顯著,A、C項(xiàng)顯著,說明提取溫度、提取方式對(duì)靈菊七蛋白提取率有顯著影響.各因素對(duì)蛋白提取率的影響程度A>C>B, 運(yùn)用Minitab軟件進(jìn)行分析,得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

蛋白提取率C1=-15.97+0.773 9A+1.800B-0.005 900A2-0.112 0B2-0.015 66AB

蛋白提取率C2=-17.27+0.796 1A+1.469B-0.005 900A2-0.112 0B2-0.015 66AB

表2 蛋白提取率回歸分析

續(xù)表2

由圖3可以得出,提取時(shí)間和提取溫度交互面的坡面較為陡峭,等高線呈現(xiàn)橢圓形,交互作用明顯,與方差分析結(jié)果一致.圖3a和圖3b對(duì)比得出,相對(duì)與水浴提取法而言,超聲輔助熱提取法蛋白的最大提取率從10.2%提高到了10.9%,有一定地提升效果.經(jīng)Minitab軟件進(jìn)一步優(yōu)化,最終得到靈菊七蛋白的最適提取條件為：超聲輔助熱提取法、提取溫度 62 ℃、提取時(shí)間 3 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七蛋白的最大提取率可達(dá)到10.8%.

(a) (b)圖3 蛋白提取率響應(yīng)面曲線

2.3.2α-淀粉酶抑制率

由表3可知,通過Minitab軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析,模型p值<0.05,模型顯著,失擬項(xiàng)p值0.954>0.05,模型的失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.回歸分析結(jié)果顯示,在蛋白提取過程中的因素中,A2,A項(xiàng)顯著,說明提取溫度對(duì)靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率有顯著影響.各因素對(duì)蛋白提取率的影響程度A>B>C, 運(yùn)用Minitab軟件進(jìn)行分析,得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

α-淀粉酶抑制率C1=-30.4+1.664A+0.51B-0.0159 7A2+0.498B2-0.003 5AB

α-淀粉酶抑制率C2=-24.9+1.644A-1.56B-0.015 97A2+0.498B2-0.003 5AB

表3 浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率回歸分析

由圖4可以得出,提取時(shí)間和提取溫度交互等高線不是橢圓形,兩者交互作用不明顯,提取時(shí)間等高線更為陡峭,該條件對(duì)靈菊七對(duì)α-淀粉酶抑制率作用更大,與回歸分析結(jié)果一致.由圖4a和圖4b對(duì)比得出,超聲輔助熱提取法相對(duì)于熱提取法,抑制率從24.20%提升到了31.80%,提升非常明顯,經(jīng)Minitab軟件進(jìn)一步優(yōu)化,得出靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制最適提取條件：超聲輔助熱提取法、提取溫度 59 ℃、提取時(shí)間 3 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶的最大抑制率達(dá)到31.8%.

(a) (b)圖4 α-淀粉酶抑制率響應(yīng)面

2.3.3α-葡萄糖苷酶抑制率

由表4可知,通過Minitab軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行方差分析,模型p值<0.05,模型顯著,失擬項(xiàng)p值0.853>0.05,模型的失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.回歸分析結(jié)果顯示,在蛋白提取過程中的因素中,B項(xiàng)顯著,說明提取時(shí)間對(duì)靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率有顯著影響.各因素對(duì)蛋白提取率的影響程度B>A>C, 運(yùn)用Minitab軟件進(jìn)行分析,得到二次多項(xiàng)式回歸方程：

蛋白提取率C=-4.2+0.484A-2.15B-0.004 69A2+0.526B2

表4 浸提液對(duì)α-糖苷酶抑制率回歸分析

由圖5可以得出,提取時(shí)間和提取溫度交互等高線不是橢圓形,兩者交互作用不明顯,提取溫度等高線更為陡峭,該條件對(duì)靈菊七浸提液對(duì)α-糖苷酶抑制率作用更大,與回歸分析結(jié)果一致.經(jīng)Minitab軟件進(jìn)一步優(yōu)化,得出靈菊七浸提液對(duì)α-糖苷酶抑制最適提取條件：超聲輔助熱提取法、提取溫度 52 ℃、提取時(shí)間 5 h、料液比1∶30、提取溶劑PBS,靈菊七浸提液對(duì)α-淀粉酶的最大抑制率達(dá)到13.60%.

圖5 α-葡萄糖苷酶抑制率響應(yīng)面

2.4 提取液蛋白含量、純度檢測(cè)及其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

上述研究通過以提取時(shí)間、提取溫度作為連續(xù)因子,提取方式作為類別因子,采用3因素4水平的BoxBehnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)(BBD),獲得了26組不同提取工藝的靈菊七蛋白提取液蛋白含量,并檢測(cè)了其α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性.通過蛋白含量與其對(duì)酶的抑制活性相關(guān)性分析研究(圖5),可以發(fā)現(xiàn)靈菊七蛋白浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率隨著蛋白含量的增加而升高,即提取液蛋白含量與α-淀粉酶抑制率呈正相關(guān),而與α-葡萄糖苷酶抑制率關(guān)系不大.另外,進(jìn)一步對(duì)蛋白含量最高、抑制率最大的提取液樣品中蛋白含量和純度進(jìn)行了研究.結(jié)果表明,1 L 該提取液蛋白含量為 20.8 mg,提取液凍干物質(zhì)量為 80.3 mg,蛋白純度為25.9%.為了進(jìn)一步排除干擾,對(duì)浸提液凍干物進(jìn)行復(fù)溶,然后依次加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%的硫酸銨,其中加40%和60%硫酸銨獲得沉淀,分別離心并冷凍干燥后分別獲得16.1和 4.2 mg 凍干物.最后2種凍干物配置成 100 mg/L 的溶液并檢測(cè)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中,40%硫酸銨沉淀物的α-淀粉酶抑制率最大,可達(dá)90.2%,2種凍干物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用很微弱,僅1.8%和1.1%.綜上所述,可以推斷靈菊七PBS浸提液中含有對(duì)α-淀粉酶具有較好抑制作用的活性蛋白.通過文獻(xiàn)調(diào)研,可以發(fā)現(xiàn)已有關(guān)于靈菊七同屬植物降糖活性成分的研究主要集中在小分子天然產(chǎn)物上,對(duì)于具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白和多肽還沒有研究報(bào)道.

圖6 蛋白含量與抑制率相關(guān)性

3 結(jié)語

本文確定了靈菊七蛋白最佳提取方式為以PBS為溶劑,超聲輔助水浴加熱法提取.通過響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝條件,最佳條件下總蛋白提取率最高可達(dá)10.8%,提取物對(duì)α-淀粉酶最大抑制率為34.49%,提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶最大抑制率為13.6%,并且浸提液對(duì)α-淀粉酶抑制率隨著蛋白含量的增加而升高,結(jié)合浸提液凍干物的40%硫酸銨沉淀物對(duì)α-淀粉酶抑制率可達(dá)90.2%,可以推測(cè)提取液含有對(duì)α-淀粉酶具有較好抑制作用的活性蛋白.以上研究結(jié)果表明,靈菊七莖葉中可能含有新型α-淀粉酶抑制活性蛋白,具有開發(fā)為α-淀粉酶抑制活性藥食產(chǎn)品的巨大潛力.但是,本文僅對(duì)靈菊七粗提物和硫酸銨沉淀物進(jìn)行了研究,雖然蛋白純度高,但并沒有完全排除干擾.后續(xù)可以根據(jù)該提取條件,大批量提取靈菊七,以分離高純度活性蛋白,完全排除小分子干擾,進(jìn)一步明確靈菊七含有α-淀粉酶抑制活性蛋白,并解析蛋白結(jié)構(gòu)及構(gòu)效關(guān)系.