鐘祥,羅恒真,謝小燕

(江西科睿藥業(yè)有限公司,江西 贛州 341000)

普瑞巴林口服溶液(Lyrica)于2010年1月在FDA批準(zhǔn)上市,其適應(yīng)癥與普瑞巴林膠囊相同,可用于治療焦慮癥、癲癇、神經(jīng)痛和術(shù)后疼痛等,口服溶液批準(zhǔn)的優(yōu)勢在于其便于難以吞咽膠囊的患者用藥,也便于腎功能損傷及由于腎功能減退可能需要減量的老年患者調(diào)整劑量。FDA審評報(bào)告中可查詢到普瑞巴林口服溶液的處方中含有普瑞巴林、羥苯甲酯、羥苯丙酯、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、三氯蔗糖與人造草莓香精,上述原輔料最終均溶解于純化水中,即成品為水溶液體系,其中普瑞巴林標(biāo)示量質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1。

普瑞巴林化學(xué)名為(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,含有一個(gè)手性碳原子,其對映異構(gòu)體(R)-3-氨甲基-5-甲基己酸(R-普瑞巴林,R-PRBL)的活性只有S-異構(gòu)體的十分之一[1],所以需將R-普瑞巴林作為雜質(zhì)進(jìn)行控制,建立分析方法進(jìn)行檢查。目前美國藥典、歐洲藥典與英國藥典的普瑞巴林原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均控制R-普瑞巴林含量不得超過普瑞巴林的0.15%,測定方法均為采用Marfey試劑進(jìn)行柱前衍生化的高效液相色譜法;而相應(yīng)制劑如普瑞巴林膠囊與普瑞巴林口服溶液等,則未把R-普瑞巴林定入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2-4]。為保證制劑的安全性和有效性,開展制劑的對映異構(gòu)體研究仍是必要的,即對映異構(gòu)體的含量仍是普瑞巴林口服溶液的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

由于普瑞巴林口服溶液組分復(fù)雜,抑菌劑和香精中的某些組分也會(huì)與Marfey試劑發(fā)生副反應(yīng),采用手性衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化再通過液相分離的方法進(jìn)行檢測,方法的回收率與重現(xiàn)性較差,不滿足檢測要求;而有學(xué)者采用正相色譜與蒸發(fā)光檢測器聯(lián)用測定普瑞巴林的光學(xué)純度的方法也不適用于含水相的普瑞巴林口服溶液[5];最新收載的文獻(xiàn)方法為李晶等發(fā)表在《理化檢驗(yàn)》中的用HPLC-ELSD測定普瑞巴林原料藥中的R-對映異構(gòu)體方法[6],該方法采用反相液相與鍵合兩性離子手性固定相的色譜柱進(jìn)行了方法開發(fā)與優(yōu)化,建立了一個(gè)快速、有效、靈敏的方法測定原料藥中的R-普瑞巴林,把該方法應(yīng)用于普瑞巴林口服溶液的檢測,發(fā)現(xiàn)不揮發(fā)的輔料峰會(huì)干擾R-普瑞巴林出峰,且流動(dòng)相的背景干擾較大,信噪比不滿足要求,故本文參考該方法結(jié)合口服溶液的特殊性進(jìn)行了方法的優(yōu)化,最終建立了一個(gè)反相高效液相色譜與電霧式檢測器聯(lián)用(HPLC-CAD)的方法測定普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林,該方法操作簡單、專屬性強(qiáng)、耐用性良好。

圖1為普瑞巴林與R-普瑞巴林結(jié)構(gòu)式。

圖1 普瑞巴林(左)與R-普瑞巴林(右)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器

Waters AUQUITY Arc高效液相色譜儀(美國Waters公司),CAD檢測器(美國Thermo公司);XS105DU型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);S220型pH計(jì)(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試驗(yàn)用藥與試劑

甲醇(色譜純,MERCK);乙醇(色譜純,MERCK);醋酸銨(LC/MS純,ACS);醋酸(分析純,廣東光華科技股份有限公司);水為超純水;普瑞巴林對照品(批號101106-201902,純度99.7%,中國食品藥品檢定研究院);R-普瑞巴林對照品(批號31225-A3,純度99.9%,上?？凭S化學(xué)技術(shù)有限公司);普瑞巴林口服溶液[批號20200605,規(guī)格2%(473 mL∶9 460 mg),江西青峰藥業(yè)有限公司];普瑞巴林口服溶液空白輔料溶液(批號20200606,江西青峰藥業(yè)有限公司)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

流動(dòng)相:0.01 mol/L醋酸銨緩沖液(pH值5.5)-乙醇(20∶80,體積比);色譜柱:CHIRALPAK ZWIX(+),4.0 mm×150 mm,3 μm;柱溫為20 ℃;流速為0.5 mL·min-1;進(jìn)樣體積20 μL;檢測器蒸發(fā)管溫度為35 ℃。

2.2 溶液的配制

溶劑為純化水。

空白輔料溶液:取本品制劑的空白輔料溶液5 mL至10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

普瑞巴林定位溶液:取普瑞巴林對照品約50 mg,精密稱定,置5 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

R-普瑞巴林對照品貯備液:取R-普瑞巴林對照品約15 mg,精密稱定,置100 mL量瓶中,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

R-普瑞巴林對照品溶液:精密移取R-普瑞巴林對照品貯備液1 mL,置10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

系統(tǒng)適用性溶液:取普瑞巴林對照品約100 mg,精密稱定,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林對照品貯備液1 mL,加溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻。

供試品溶液:取普瑞巴林口服溶液5 mL,置10 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

2.3 專屬性

取空白溶劑、空白輔料溶液、普瑞巴林定位溶液、R-普瑞巴林對照品與系統(tǒng)適用性溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果表明R-普瑞巴林峰與普瑞巴林峰已基線分離,空白溶劑峰與空白輔料峰對R-普瑞巴林峰均無干擾,表明方法的專屬性良好,典型色譜圖見圖2。

(a)系統(tǒng)適用性溶液;(b)普瑞巴林定位溶液;(c)空白輔料溶液;(d)空白溶劑圖2 典型色譜圖

2.4 系統(tǒng)適用性

取“系統(tǒng)適用性溶液”按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,考察R-普瑞巴林峰的保留時(shí)間與峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)及分離度。結(jié)果顯示連續(xù)進(jìn)樣6次,R-普瑞巴林峰的保留時(shí)間RSD為0.1%,峰面積RSD為2.5%,分離度均在1.6以上,表明方法連續(xù)進(jìn)樣精密度較好。

2.5 檢測限

精密移取的“R-普瑞巴林對照品貯備液”1 mL至50 mL量瓶中,用溶劑稀釋至刻度,混勻,配制為每1 mL約含R-普瑞巴林3 μg(相對供試品溶液濃度0.03%)的溶液。

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,得R-普瑞巴林峰的信噪比(S/N)為9.4,滿足大于3的驗(yàn)證要求,表明該方法的最低檢測限可至供試品溶液濃度的0.03%,相當(dāng)于R-普瑞巴林約60 ng,滿足普瑞巴林口服溶液對于R-普瑞巴林的檢測與控制要求。

2.6 精密度

1)實(shí)際樣品檢測:實(shí)驗(yàn)員A和實(shí)驗(yàn)員B分別取樣各平行配制6份供試品溶液,考察測定所得結(jié)果之間的離散程度(RSD);2)加標(biāo)樣品回收率:實(shí)驗(yàn)員A和實(shí)驗(yàn)員B分別配制6份雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液,考察R-普瑞巴林回收率的離散程度(RSD),結(jié)果見表1。

雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液:取本品5 mL,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林對照品貯備液1 mL,用溶劑稀釋至刻度,搖勻。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 線性與范圍

分別精密移取“R-普瑞巴林對照品貯備液”適量,用溶劑稀釋至每1 mL含有R-普瑞巴林約3,7.5,12,15,18,22.5 μg的溶液,分別為限度濃度的20%,50%,80%,100%,120%,150%,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖。以峰面積對濃度作回歸處理。結(jié)果表明R-普瑞巴林的質(zhì)量濃度在2.99～22.39 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈線性,相關(guān)系數(shù)為0.999 1,說明方法線性較好。

2.8 準(zhǔn)確度

將已知含量的R-普瑞巴林加入普瑞巴林口服溶液中,制成低(限度的50%)、中(限度的100%)、高(限度的120%)三個(gè)濃度,每個(gè)水平三份,按擬定的方法測定回收率,結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 溶液穩(wěn)定性

將對照品溶液與雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液置進(jìn)樣瓶中,室溫條件下,分別在第一次進(jìn)樣(0 h)后的第3,6,9,12,18和24 h進(jìn)樣,考察各溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示在室溫條件下,對照品溶液和雜質(zhì)加標(biāo)供試品溶液的R-普瑞巴林峰面積在24 h內(nèi)與0 h 的變化率均在5%以下,表明對照品溶液和供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性

考察某些色譜參數(shù)或操作有意或無意發(fā)生微小改變時(shí),方法依然能穩(wěn)健執(zhí)行并獲得正確的結(jié)果,見表3、4。

表3 耐用性考察的色譜參數(shù)

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

由表3、4可知微小改變擬定方法的色譜條件,對分離度與檢測結(jié)果均無影響,說明方法耐用性良好。

3 結(jié)論

3.1 檢測器的選擇

普瑞巴林及其對映異構(gòu)體無共軛雙鍵體系,紫外吸收弱,故選用質(zhì)量型檢測器提高檢測靈敏度,與液相匹配的檢測器可選用示差折光檢測器(RID)、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)、電霧式檢測器(CAD)與質(zhì)譜檢測器(MS)等,根據(jù)日常檢測的便利性,選用了靈敏度更高、重現(xiàn)性更好的CAD檢測器。

3.2 色譜柱的選擇

普瑞巴林有類似氨基酸的結(jié)構(gòu),對于普瑞巴林和R-普瑞巴林這種兩性手性化合物的分離,優(yōu)先考慮兩性離子色譜柱,另普瑞巴林口服溶液含水相,故需選擇可適用反相液相的色譜柱。本文考察了兩根手性色譜柱,分別為CHIROBIOTIC?T和CHIRALPAK ZWIX(+),兩根色譜柱均可使用常規(guī)的HPLC流動(dòng)相(甲醇、乙腈和水等)。其中CHIROBIOTIC?T色譜柱鍵合相為替考拉寧手性選擇劑,對未衍生化的α,β,γ以及環(huán)氨基酸等可提供獨(dú)特的選擇性;CHIRALPAK ZWIX(+)色譜柱的填料為硅膠表面鍵合奎寧(S,S)-ACHSA(*)衍生物(*)反式-2-氨基環(huán)己基磺酸,主要用于分離自由氨基酸的兩性離子手性固定相,對兩性手性化合物,尤其是未經(jīng)衍生的氨基酸和多肽,有顯著的立體選擇性。

3.3 流動(dòng)相體系的選擇

在兩性離子模式下,所有參與離子交換平衡的物質(zhì)需要在流動(dòng)相中較好地解離,流動(dòng)相首選能提供質(zhì)子化的溶劑,反相液相色譜中典型的能質(zhì)子化有機(jī)相溶劑主要有甲醇和乙醇,首選甲醇-水與乙醇-水體系進(jìn)行方法開發(fā)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在甲醇-水與乙醇-水體系下普瑞巴林與R-普瑞巴林未基線分離,故考慮加入緩沖鹽體系增加選擇性。根據(jù)FDA審評報(bào)告提到的普瑞巴林pKa分別為4.2與10.6,結(jié)合色譜柱的pH值耐受范圍,首選緩沖鹽的pH值范圍為5.2～6.8,緩沖鹽在該范圍的主要有醋酸鹽和磷酸鹽,由于選用的CAD檢測器優(yōu)選能揮發(fā)的緩沖鹽,故選擇醋酸鹽體系,在考察了0.01 mol·L-1醋酸鹽緩沖液-乙醇體系時(shí),發(fā)現(xiàn)了更優(yōu)的分離度,繼續(xù)優(yōu)化pH值至5.5時(shí)得到分離度最優(yōu)值,其中CHIROBIOTIC?T色譜柱在普瑞巴林與R-普瑞巴林均在低濃度時(shí)(約為30 μg·mL-1)才能有效分離,按普瑞巴林口服溶液中普瑞巴林(100%)與R-普瑞巴林的限度濃度(0.15%)比例配制的系統(tǒng)溶液圖譜中,普瑞巴林峰會(huì)完全包裹R-普瑞巴林峰,色譜柱不適用,而色譜柱CHIRALPAK ZWIX(+)在方法優(yōu)化后得到了較好的分離圖譜,詳見圖2典型色譜圖。

3.4 驗(yàn)證方法

本文驗(yàn)證的方法為雜質(zhì)定量分析方法,旨在通過高效液相色譜法測定普瑞巴林口服溶液中含量水平在0.15%以下的R-普瑞巴林。根據(jù)ICH Q2(R1)和《中國藥典》2020年版四部9101的法規(guī)要求及本方法的使用目的[7],本文驗(yàn)證了方法的專屬性、系統(tǒng)適用性、靈敏度(檢測限)、線性與范圍、準(zhǔn)確度(回收率)、精密度(重復(fù)性和中間精密度)、溶液穩(wěn)定性和耐用性,各驗(yàn)證項(xiàng)目均符合擬定的驗(yàn)證要求,證明該方法可用于檢測普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林的含量。當(dāng)然,該方法的重點(diǎn)在于色譜柱和流動(dòng)相的結(jié)合,在該體系下更換不同的檢測系統(tǒng)例如HPLC-ELSD或LC-MS等同樣可以用于檢測普瑞巴林原料藥或者普瑞巴林口服溶液的對映異構(gòu)體含量。