胡詩(shī)恒，宋昕昊，林夢(mèng)娟，鄭玉玲，王俊棋，游鳳，呂英軍，高修歌，張軍忍，江善祥，郭大偉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

隨著人們生活水平的提升，養(yǎng)寵觀念不斷推廣與普及，寵物犬和貓?jiān)絹?lái)越成為人們生活中不可缺少的一部分，關(guān)于如何提升寵物犬貓的壽命和生活質(zhì)量已成為關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。犬乳腺癌是母犬最常見(jiàn)的癌癥之一[1-2]，常自發(fā)性發(fā)展，惡性率和死亡率較高，且能夠由良性向惡性發(fā)展[3-4]。犬乳腺癌與人乳腺癌在流行病學(xué)、組織病理學(xué)和臨床特征等方面都具有相似性[5]，因此被視為良好的人乳腺癌研究和藥物評(píng)價(jià)模型[6]。目前獸醫(yī)臨床上治療犬乳腺癌最主要的手段為手術(shù)和化療，手術(shù)治療能有效切除腫瘤組織，但是對(duì)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和惡性腫瘤仍然有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，化療仍然是抗腫瘤必不可少的治療手段。

常山酮(halofuginone)是一種從植物常山中提取的常山堿的衍生物，最初被用作抗球蟲(chóng)，近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]。鹽霉素(salinomycin)是一種聚醚類(lèi)離子載體抗生素，可有效抑制癌干細(xì)胞[9]。目前寵物腫瘤的化療藥物較少，多采用人用抗腫瘤藥物，但由于單一化療藥物對(duì)寵物機(jī)體的毒性作用使得療效欠佳且易產(chǎn)生耐藥性，因此開(kāi)發(fā)新的聯(lián)合用藥方案尤為重要。因此，本研究擬采用常山酮和鹽霉素共同作用于犬乳腺腫瘤細(xì)胞，以評(píng)估兩者間的協(xié)同抑制作用，從而有效減少藥物用量、降低毒副作用，同時(shí)增強(qiáng)抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 藥物、組織與細(xì)胞

常山酮(99%)由山西美林制藥有限公司饋贈(zèng)，鹽霉素(92%)購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CMT-N7由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥理與毒理實(shí)驗(yàn)室分離構(gòu)建，犬乳腺腫瘤組織樣品來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清(FBS)、0.25% 胰蛋白酶消化液 (含0.02% EDTA)、青霉素鏈霉素溶液(100×)、Ⅱ型膠原酶、兩性霉素B購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)購(gòu)自南京善本生物科技有限公司，無(wú)水乙醇、二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 犬乳腺腫瘤細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，用含有青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的PBS充分洗滌犬乳腺組織樣本。用眼科剪和眼科鑷取1 g左右的組織小塊，盡量剪成小碎塊，在修剪過(guò)程中，為了保持組織塊的濕潤(rùn)，向組織塊上滴加幾滴培養(yǎng)液。然后將剪碎的組織塊用眼科鑷轉(zhuǎn)移至無(wú)菌處理的三角燒瓶中，加入0.1%的Ⅱ型膠原酶溶液20 mL，同時(shí)放入幾粒玻璃珠，放入37 ℃恒溫振蕩器中消化1～2 h。消化完成后，將細(xì)胞懸液用70 μm直徑的細(xì)胞篩過(guò)濾2次，轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入含有FBS和青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察生長(zhǎng)狀態(tài)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右密度時(shí)，用含有EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化，傳代培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后，于第36代時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，分別以5 000個(gè)/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)至80%左右時(shí)，用不同濃度常山酮(0、15.625、31.25、62.5、125、250和500 nmol/L)和鹽霉素(0、1、2、4、8、16和32 μmol/L)分別處理細(xì)胞48 h，每組設(shè)計(jì)6個(gè)平行復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育大約1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算不同濃度下的細(xì)胞抑制率和半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)常山酮和鹽霉素聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響

使用上述方法分別按照常山酮和鹽霉素比例為1∶1、3∶1、6∶1、9∶1、1∶9、1∶6和1∶3進(jìn)行配制給藥，試驗(yàn)共分為7組。保持常山酮與鹽霉素的藥物總濃度為0、31.25、62.5、125、250、500和1 000 nmol/L不變，根據(jù)不同的比例配制含藥培養(yǎng)基。加入CCK-8后用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，按照Chou-Talalay中位效應(yīng)與聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)[10]進(jìn)行常山酮和鹽霉素的聯(lián)合效應(yīng)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以CompuSyn 2.0軟件進(jìn)行藥物聯(lián)合作用分析，兩藥物的CI<1說(shuō)明藥物之間存在協(xié)同效應(yīng)。

1.6 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

將細(xì)胞接種至6孔板中，在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。隔天取出6孔板，用200 μL槍頭垂直于細(xì)胞表面由孔一端劃向另一端。隨后吸掉舊培養(yǎng)基，用PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入含有1% FBS的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組(CON)，含有不同濃度的1% FBS培養(yǎng)液配制成常山酮125 nmol/L單藥處理組(HF)，鹽霉素125 nmol/L單藥處理組(SAL)以及聯(lián)合用藥處理組(常山酮125 nmol/L+鹽霉素125 nmol/L，HF+SAL)，放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別取0和24 h時(shí)間點(diǎn)于倒置顯微鏡下觀察不同處理組的“劃痕”寬度并拍照。

1.7 細(xì)胞克隆試驗(yàn)

將細(xì)胞按照1 000個(gè)/孔的密度均勻接種于六孔板中，每孔加2 mL含10% FBS的完全DMEM培養(yǎng)液，置于含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，配置藥物分組為陰性對(duì)照組、常山酮125 nmol/L單藥處理組、鹽霉素125 nmol/L單藥處理以及聯(lián)合用藥組(常山酮125 nmol/L+鹽霉素125 nmol/L)處理，每隔2 d更換1次培養(yǎng)基，實(shí)時(shí)觀察克隆形成情況。大約14 d后，當(dāng)對(duì)照組細(xì)胞形成較大克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗，甲醇固定5 min，然后用PBS漂洗，加入0.5%結(jié)晶紫1 mL染色10 min，棄去染液，用超純水漂洗，拍照記錄。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)軟件(Quantity One 4.62)對(duì)細(xì)胞克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-way ANOVA)并作圖。所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 犬乳腺腫瘤細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

犬乳腺腫瘤細(xì)胞分離培養(yǎng)成功且生長(zhǎng)良好，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞普遍呈上皮樣形態(tài)或紡錘形，細(xì)胞核大而不規(guī)則，且明顯出現(xiàn)多核仁現(xiàn)象。隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)較穩(wěn)定且均一。穩(wěn)定傳代超過(guò)120代，命名為 CMT-N7，取第36代進(jìn)行試驗(yàn)(圖1)。

A. 第36代；B. 第120代。

2.2 常山酮和鹽霉素對(duì)CMT-N7細(xì)胞的毒性作用

使用CCK-8法檢測(cè)不同濃度梯度常山酮和鹽霉素處理后的犬乳腺腫瘤細(xì)胞CMT-N7活力，結(jié)果顯示，常山酮和鹽霉素均能有效抑制該乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性(圖2)。其中常山酮的IC50值為130 nmol/L，鹽霉素的IC50值為15.5 μmol/L。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 常山酮和鹽霉素聯(lián)用協(xié)同抑制CMT-N7細(xì)胞的增殖

通過(guò)CompuSyn軟件繪制常山酮和鹽霉素的藥物聯(lián)合指數(shù)-藥物作用效應(yīng)曲線，并計(jì)算出CI值。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)合能夠協(xié)同抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖，且當(dāng)常山酮和鹽霉素比例為1∶1和1∶9時(shí)，在不同抑制率下二者的CI值均小于1(圖3)，且1∶1時(shí)的CI值更小。因此選擇最佳協(xié)同比例為1∶1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖3 常山酮和鹽霉素對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞協(xié)同抑制比例的篩選

2.4 常山酮和鹽霉素聯(lián)用對(duì)CMT-N7細(xì)胞遷移能力的影響

為了探究常山酮、鹽霉素以及兩藥聯(lián)用是否引起乳腺癌細(xì)胞遷移能力的變化，采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)它們對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果顯示，常山酮處理組和鹽霉素處理組與對(duì)照組相比，劃痕愈合速率都極顯著降低(P<0.01)，且常山酮和鹽霉素聯(lián)用比二者單用時(shí)抑制效果更顯著(P<0.01)(圖4)。

A. 細(xì)胞遷移結(jié)果(100 ×)；B. 傷口愈合率定量結(jié)果。大寫(xiě)字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.5 常山酮和鹽霉素聯(lián)用對(duì)CMT-N7細(xì)胞克隆形成的影響

用常山酮、鹽霉素以及兩藥聯(lián)合處理細(xì)胞14 d后記錄形成的細(xì)胞克隆，結(jié)果表明，常山酮和鹽霉素克隆形成率分別為 (55.13±3.31)%和(89.15±1.77)%，兩藥聯(lián)用時(shí)抑制效果更顯著(P<0.01)，達(dá)(26.91±1.57)%(圖5)，說(shuō)明常山酮和鹽霉素能夠協(xié)同抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力。

A.細(xì)胞克隆染色；B. 細(xì)胞克隆定量。

3 討論

犬是一種自發(fā)性乳腺腫瘤幾率較高的動(dòng)物[11]，尤其是老齡雌犬，惡性率和死亡率較高[1-2，12]。犬乳腺腫瘤和人乳腺腫瘤在流行病學(xué)、組織形態(tài)學(xué)和病理生理學(xué)等多方面都具有相似特征，因此犬作為研究乳腺腫瘤的模型對(duì)后續(xù)研究人乳腺癌治療方案具有重要意義。目前，獸醫(yī)臨床上治療犬乳腺腫瘤的主要方法為手術(shù)和化療，但犬乳腺腫瘤化療藥物的研究很少，大多采用人乳腺腫瘤的常用化療藥物[13]。鹽霉素是一種聚醚類(lèi)離子載體抗生素，最初用于防治球蟲(chóng)病。最近研究發(fā)現(xiàn)，鹽霉素可特異性殺傷乳腺癌干細(xì)胞，使其受到廣泛關(guān)注[14-18]。研究表明，鹽霉素能有效提高傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的細(xì)胞毒作用，與多種化療藥物在抗腫瘤細(xì)胞研究中表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)[19]。常山酮由中藥植物常山中所提取出的有效成分常山堿衍生而得，可用于治療雞球蟲(chóng)病和犢牛隱孢子蟲(chóng)病[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，常山酮對(duì)多種腫瘤都具有抑制作用，可以抑制腫瘤血管新生、增殖、轉(zhuǎn)移等多個(gè)腫瘤發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[22-23]。此外，常山酮與其他抗癌藥物聯(lián)用能有效降低化療藥物的劑量，減輕癌癥患者治療壓力[24]。隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受增強(qiáng)，多藥聯(lián)合應(yīng)用成為人腫瘤治療上克服藥物耐受最常見(jiàn)的手段，能夠有效克服耐藥性、降低藥物用量、提升抗腫瘤效果[25-27]。但目前對(duì)犬乳腺癌聯(lián)合用藥的研究較少。因此，本研究采用常山酮和鹽霉素聯(lián)合用藥，評(píng)估其協(xié)同作用，能夠有效降低藥物用量，減少化療藥物帶來(lái)機(jī)體毒性的同時(shí)進(jìn)一步提升抗腫瘤效果。綜合細(xì)胞增殖、聯(lián)合用藥CI值的分析以及細(xì)胞克隆試驗(yàn)和遷移試驗(yàn)的結(jié)果，表明常山酮和鹽霉素都具有抗犬乳腺腫瘤活性，且二者聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，篩選出最佳協(xié)同比例為1∶1，在該比例下不同抑制率的CI值均小于1，細(xì)胞克隆和遷移能力試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)兩藥的協(xié)同抗犬乳腺腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明常山酮和鹽霉素聯(lián)用對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生協(xié)同抑制效應(yīng)，且二者的最佳協(xié)同比例為1∶1，在此協(xié)同比例下兩藥聯(lián)用能夠協(xié)同抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和克隆形成，為獸醫(yī)臨床抗腫瘤藥物的體外研究以及抗腫瘤藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供了依據(jù)和參考。