曹建華,楊柏高,張培培,馮肖藝,張 航,余 洲,牛一凡,郝海生,杜衛(wèi)華, 朱化彬,楊 凌,趙學明*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.河北工程大學生命科學與食品工程學院,邯鄲 056038)

奶牛的產(chǎn)奶量日益增加,然而對于生產(chǎn)性能的過度追求導致了其繁殖力逐年降低,在過去幾十年里,全球范圍內(nèi)的奶牛生育率都在下降[1]。據(jù)報道,近些年奶牛發(fā)情率從80%下降到50%,發(fā)情持續(xù)時間也從15 h減少到5 h,奶牛單次人工授精的妊娠率每年下降約0.45%～1%[2-3],首次受精懷孕率更是從70%下降到40%[4]。在日本北海道的荷斯坦奶牛,2012和2018年初產(chǎn)母牛的平均受孕率分別為55.2%和39.2%[5]。奶牛能量負平衡(negative energy balance,NEB)導致卵泡發(fā)育異常而引起的繁殖力下降,給全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟造成重大損失,幾乎所有高產(chǎn)奶牛的國家都受到了影響,成為世界性難題。

NEB干擾奶牛正常的卵巢活動,對產(chǎn)后奶牛的代謝和卵泡正常發(fā)育產(chǎn)生不利影響[6],進而影響到奶牛的健康和正常發(fā)情周期,降低產(chǎn)奶量和牛奶品質(zhì)。解決NEB問題勢在必行,近些年,組學技術(shù)的應用為解決奶牛NEB提供新方法,本文就近年來相關(guān)研究進展進行綜述及展望,以期為揭示NEB影響奶牛卵泡發(fā)育的機制提供參考。

1 奶牛能量負平衡的概述

NEB是奶牛在圍產(chǎn)期[7](臨產(chǎn)前3周至產(chǎn)后3周)經(jīng)常發(fā)生的一種導致機體代謝紊亂的疾病,圍產(chǎn)期階段奶牛體內(nèi)胎兒發(fā)育需要更多營養(yǎng),同時奶牛開始分泌初乳,干物質(zhì)采食量(dry matter intake, DMI)需求增加4～6倍[8],然而此階段奶牛應激嚴重,采食量下降,能量需求超過了DMI的能量供應[9]。當采食量無法滿足正常生理活動和產(chǎn)奶的能量需求時,奶?？赡艹霈F(xiàn)NEB狀態(tài)[10]。

NEB通常會導致奶牛出現(xiàn)肝功能紊亂、圍產(chǎn)期疾病和繁殖性能降低等情況[11-12]。奶牛的脂質(zhì)代謝在圍產(chǎn)期會發(fā)生顯著變化[13],為了滿足能量需求,奶牛體內(nèi)會進行肝糖異生,脂肪組織和蛋白質(zhì)被動員起來,大量非酯化脂肪酸(non esterified fatty acid,NEFA)被運輸?shù)礁?在肝細胞中氧化或酯化為甘油三酯(TG)[13]。過多的TG再酯化使肝中出現(xiàn)脂肪堆積現(xiàn)象,形成脂肪肝[14],嚴重的脂肪肝會影響奶牛生殖能力。同時,血漿中過多的NEFA無法完全氧化,產(chǎn)生大量酮體如β-羥丁酸(β-hydroxybutyric acid,BHBA),可能會使奶?；纪15]。NEB使高產(chǎn)奶牛發(fā)生代謝紊亂[6],持續(xù)存在會導致奶牛體脂減少,體況評分(body condition score,BCS)降低,影響奶牛生產(chǎn)性能和生育能力,NEB的持續(xù)時間及其程度因奶牛的遺傳性狀、產(chǎn)奶量和采食量的不同而產(chǎn)生差異[16]。

2 能量負平衡對奶牛繁殖性能的影響

NEB期間,奶牛的免疫力下降,繁殖性能也會被削弱,例如,發(fā)情天數(shù)、發(fā)情次數(shù)、發(fā)情周期、發(fā)情率、受胎率等均會下降。NEB通過多方面因素影響到奶牛的繁殖性能,主要包括激素代謝、能量代謝、體況等。奶牛繁殖過程中,激素代謝起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,奶牛NEB階段的機體代謝、激素分泌會發(fā)生異常。據(jù)Radcliff等[17]報道,血清中由膽固醇合成的性類固醇激素(如雌激素和孕酮)水平在圍產(chǎn)期期間發(fā)生了很大變化。NEB過程中營養(yǎng)不充足,也影響到了與生殖有關(guān)的激素合成與分泌,如卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)[18],激素代謝紊亂會對奶牛發(fā)情周期和繁殖力造成影響。

奶牛NEB狀態(tài)下需要動員機體脂肪組織來產(chǎn)生能量,這時奶牛血清中的BHBA、NEFA濃度升高,血漿中葡萄糖濃度降低[19-20],高濃度NEFA和低濃度葡萄糖對奶牛繁殖性能造成不良影響。在生產(chǎn)中通常以奶牛產(chǎn)后第1周血清中BHBA含量≥1.2 mmol·L-1和第2周BHBA含量≥5.1 mmol·L-1為閾值來預測臨床酮癥風險[21],據(jù)報道,在奶牛產(chǎn)后第2周,血清BHBA濃度超過亞臨床酮癥(SCK)閾值的奶牛在首次人工授精后懷孕率降低了50%[22]。SCK同樣增加了人工授精次數(shù),SCK奶牛每次懷孕的平均授精次數(shù)為2.8次,非SCK奶牛為2.0次[23],以上表明NEB階段時能量代謝異常,同樣降低了奶牛的繁殖性能。

NEB影響奶牛BCS,BCS通常作為奶牛管理中的有效指標,其過度增加或減少是影響繁殖性能的一個因素[24],評估BCS是了解營養(yǎng)狀況與繁殖性能之間關(guān)系的簡便方法。奶牛NEB狀態(tài)下體內(nèi)脂肪損失較大,它們通常在產(chǎn)犢后的最初幾周內(nèi)減少掉60%或更多的體脂[25],BCS明顯降低。Carvalho等[26]證實,產(chǎn)后早期BCS損失最大的奶牛在人工授精后的第1周表現(xiàn)出更多的胚胎發(fā)育障礙,與健康群體相比,BCS過度損失的奶牛繁殖性能和存活率降低[24]。另外,Stevenson等[27]報告稱,產(chǎn)犢后BCS損失較大的奶?；寂Ｄ虩?、酮癥、脂肪肝、子宮炎和乳腺炎的風險增加,這些疾病會導致奶牛生育能力下降、產(chǎn)奶量下降、屠宰風險升高[10,28]。BCS較差還與產(chǎn)后發(fā)情延遲、首次產(chǎn)犢和受孕間隔較長以及首次人工授精受孕間隔縮短有關(guān),是造成奶牛繁殖性能下降的重要原因[24]。

3 能量負平衡影響奶牛卵泡發(fā)育的機制

3.1 能量負平衡通過影響激素合成抑制卵巢中的卵泡發(fā)育

動物合成和分泌激素需要大量營養(yǎng)物質(zhì),尤其對蛋白質(zhì)和能量需求較高。奶牛在NEB狀態(tài)時,缺乏營養(yǎng),導致生殖激素的合成能力下降,血漿和卵泡液中的激素水平低下,包括促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、FSH、促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)、瘦素(leptin)等均會受到影響[29]。這些激素通常在下丘腦、垂體和卵巢水平發(fā)揮作用,涉及到許多代謝調(diào)節(jié)與正常卵巢活動相關(guān)的復雜內(nèi)分泌機制的相互作用[30],NEB對卵巢功能的影響主要是通過降低LH脈沖、降低體內(nèi)IGF-1、機體發(fā)生胰島素抵抗等所實現(xiàn)的[31]。一些研究表明,奶牛產(chǎn)后NEB會延遲卵巢功能的恢復,延長第一個卵泡波,并降低排卵率[32],干擾了奶牛正常排卵,最終導致奶牛繁殖性能下降。

圖1 能量負平衡影響奶牛卵泡發(fā)育的機制[30]Fig.1 Mechanism of negative energy balance affecting follicle development in dairy cows[30]

3.1.1 GnRH GnRH是一種調(diào)節(jié)哺乳動物生殖功能關(guān)鍵作用的激素,是由位于弓狀核和下丘腦視前區(qū)的特定下丘腦神經(jīng)元合成的十肽[33]。生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)由下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸組成,精確調(diào)節(jié)哺乳動物的生殖過程[34],下丘腦分泌的促GnRH調(diào)節(jié)腺垂體中促性腺激素的合成和分泌,從而調(diào)節(jié)性腺功能。GnRH促進FSH的合成和分泌,調(diào)節(jié)動物生長繁殖,在卵泡發(fā)育中起重要作用[35],目前,GnRH被廣泛用于調(diào)節(jié)動物繁殖[36]。產(chǎn)后恢復排卵的關(guān)鍵驅(qū)動因素是LH脈沖頻率的增加,LH脈沖頻率又受到GnRH高頻脈沖的控制[37],奶牛NEB時 GnRH水平低下,影響了FSH、LH的脈沖頻率,卵泡的選擇及發(fā)育受到干擾。

3.1.2 FSH FSH是由垂體前葉產(chǎn)生的一種由α和β亞基組成的二聚體糖蛋白,是一種促性腺激素,在配子發(fā)生和成熟的調(diào)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用[38]。FSH在卵泡生長和顆粒細胞功能中起關(guān)鍵作用[39],卵泡發(fā)育過程中需要依靠 FSH、LH等激素的調(diào)節(jié),FSH、LH協(xié)同促進發(fā)育成熟的卵泡分泌雌激素和排卵[40]。FSH的每一次增加都會導致卵泡波的出現(xiàn),在卵泡發(fā)育后期,其生長明顯依賴于垂體促性腺激素FSH和LH,這些激素通過下丘腦-垂體的負抑制反饋回路保障了控制卵泡招募、選擇和優(yōu)勢的主要機制[41]。

奶牛排卵是正常發(fā)情的保障,無排卵乏情是由于優(yōu)勢卵泡(dominant follicle, DF)無法正常排卵導致的乏情[42]。處于NEB狀態(tài)的奶牛,FSH合成能力下降[17],導致對DF的選擇出現(xiàn)差錯:顆粒細胞在FSH刺激下將雄激素芳香化生成雌二醇[43-44],此時由于FSH水平較低,奶牛DF中的顆粒細胞無法受到足夠的刺激產(chǎn)生一定濃度的雌二醇來誘導排卵,導致DF閉鎖[45],奶牛不發(fā)情。

3.1.3 LH LH是由垂體前葉合成和分泌的一種促性腺激素,負責誘導排卵、準備受精卵母細胞植入子宮,以及通過刺激膜細胞和黃體化顆粒細胞來產(chǎn)生卵巢黃體酮[37]。LH在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,它刺激關(guān)鍵類固醇激素雌激素的合成和分泌,從而促進卵巢中卵泡的生長和發(fā)育[46]。產(chǎn)后恢復排卵的關(guān)鍵因素是LH脈沖頻率的增加,LH脈沖頻率是影響所選DF最終命運的主要決定因素[47],在招募階段之后,由于雌二醇和抑制素的負反饋,FSH從被招募的卵泡下降到卵泡進一步選擇的閾值以下,此時DF可以使用LH來支持其繼續(xù)生長[48]。當奶牛發(fā)生NEB時,體況不佳加上營養(yǎng)水平低,生殖激素LH分泌水平降低,生長發(fā)育到更大尺寸的卵泡數(shù)量就會減少[49],因此排卵率下降,發(fā)情率降低。

3.1.4 瘦素 瘦素是一種主要由脂肪細胞產(chǎn)生和分泌的激素[50],其他非脂肪組織也可以產(chǎn)生瘦素,例如下丘腦、腺垂體和乳腺對生殖功能至關(guān)重要的組織[51-52]。瘦素是向中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)送動物營養(yǎng)狀況信號的主要因素,因此參與能量代謝和生殖功能相關(guān)的調(diào)節(jié)[53]。瘦素控制著女性生殖系統(tǒng)的正常生理機能,它通過一種將能量穩(wěn)態(tài)與生殖聯(lián)系起來的復雜機制與下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸相互作用,并調(diào)節(jié)瘦素受體(LEP-R)的豐度[54],這些受體的激活可能導致各種功能和途徑的調(diào)節(jié),例如:GnRH、FSH和 LH濃度的調(diào)節(jié)[55-56]。在母牛發(fā)情周期的卵泡期,血清瘦素濃度與DF的卵泡液中孕酮濃度呈正相關(guān)[57]。有證據(jù)表明,卵母細胞成熟過程中使用瘦素處理可改善牛的胚胎發(fā)育[58],瘦素還可以用作抗凋亡和抗氧化促進劑,以支持體外胚胎發(fā)育,特別是在胚胎冷凍保存出現(xiàn)的氧化應激狀態(tài)下[59]。奶牛分娩前后出現(xiàn)NEB影響血漿中瘦素濃度,妊娠晚期血漿中瘦素水平很高,并在分娩時下降到最低點[60],正常的卵巢周期受到干擾,導致奶牛生育能力下降。

3.2 INS/IGF系統(tǒng)對卵泡的影響

胰島素(insulin,INS)被認為是類固醇生成、卵泡生長、卵母細胞成熟和之后胚胎發(fā)育的關(guān)鍵媒介,因為它與促性腺激素分泌相關(guān)[45]。胰島素樣生長因子-1(insulin -like growth factor-1, IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)上與INS相關(guān)的70個氨基酸肽,在體外胚胎發(fā)育過程中影響細胞生長和分化并具有抗凋亡作用[61]。在許多物種中,IGF-1的受體和IGF結(jié)合蛋白在準備子宮內(nèi)膜植入胚胎以及胚胎生長發(fā)育方面起著重要作用[62]。INS可刺激顆粒細胞的增殖,血液中INS的平均濃度降低會導致奶牛發(fā)情周期不規(guī)律[63]。

IGF-1 是NBE奶?；謴椭芷谛阅芰Φ牧己妙A測指標。IGF-1通過增強促性腺激素在卵巢中的作用,也刺激卵泡生長和雌二醇合成,血漿中IGF-1濃度降低和營養(yǎng)不足會導致卵泡生長速度降低甚至不排卵[64]。據(jù)報道,IGF-1敲除的小鼠卵泡無法到達竇期,因排卵不足而導致不孕[65]。INS、IGF-1與LH的聯(lián)合作用能促進優(yōu)勢卵泡的形成[66],NEB嚴重的奶牛血漿中INS、IGF-1和葡萄糖的濃度較低,從而降低LH脈沖頻率,減少了卵泡合成雌二醇的水平[67]。NEB奶牛體內(nèi)葡萄糖濃度處于較低水平,導致胰高血糖素濃度上升,胰島素濃度下降[68]。有研究比較了NEB奶牛組血漿與正常奶牛組血漿后發(fā)現(xiàn),INS、IGF-1濃度在NEB奶牛組更低,NEB奶牛組卵泡的生長速度顯著低于正常奶牛組[69],奶牛發(fā)情率處于較低水平。

3.3 能量負平衡對卵泡能量代謝的影響

卵母細胞是哺乳動物體內(nèi)最大的細胞,相對其他體細胞,其發(fā)育消耗更多的能量。另一方面,胚胎發(fā)育初始所需的能量和底物由卵母細胞提供,因此正常的能量代謝在卵母細胞生長和胚胎發(fā)育方面顯得尤為重要。葡萄糖代謝和脂肪酸氧化是哺乳動物細胞攝取能量的兩種常規(guī)方式,在細胞質(zhì)中,葡萄糖和脂肪酸先轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,最后被氧化為三磷酸腺苷提供能量,雖然兩種物質(zhì)提供的底物最終的氧化方式不同,但是氧化過程都在細胞的線粒體中進行,而脂肪酸氧化可以產(chǎn)生更多的能量[70]。

3.3.1 葡萄糖 葡萄糖是所有哺乳動物細胞能量需求的重要代謝底物,它是一種親水性分子,不能透過質(zhì)膜,其攝取是由許多葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白介導的[71]。葡萄糖是牛卵母細胞成熟所必需的能量底物,在培養(yǎng)液中添加葡萄糖可以促進卵母細胞的糖酵解,在體外成熟的卵母細胞中,較高的糖酵解率反映了較高的發(fā)育能力[72]。卵丘和卵母細胞復合體通過糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝葡萄糖,葡萄糖的代謝物與調(diào)節(jié)卵母細胞減數(shù)分裂有關(guān)[72],這表明,卵母細胞在成熟期獲得發(fā)育能力需要足夠的葡萄糖,維持最佳的葡萄糖生理濃度直到囊胚期,對于卵母細胞成熟和隨后的發(fā)育至關(guān)重要[73]。NEB與血液中低濃度的葡萄糖密切相關(guān),由低葡萄糖水平而引起促性腺激素分泌的變化會降低FSH和LH濃度,從而導致LH峰缺失進而無排卵[74]。奶牛NEB期間血漿葡萄糖濃度很低,通常不高于3.0 mmol·L-1[75],不利于卵母細胞發(fā)育,進而影響到奶牛排卵,奶牛繁殖率下降。

3.3.2 脂肪酸 Bertevello等[76]利用脂質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn),脂肪酸在卵泡環(huán)境中廣泛存在,在卵母細胞、卵丘細胞、其他卵泡細胞以及卵泡液中均可觀察到脂肪酸。在卵母細胞中,甘油三酯主要以脂滴的形式存在,脂滴是一種重要的能量儲存形式,盡管各個物種在不同發(fā)育階段的脂滴含量差異很大,但哺乳動物卵母細胞通常富含脂質(zhì),以確保減數(shù)分裂有足夠的能量供應[77]。NEFA也存在于細胞質(zhì)中,可以直接從脂滴轉(zhuǎn)運到線粒體,通過β-氧化,快速簡便地獲取能量。用于產(chǎn)生能量的脂肪酸通過脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白從循環(huán)系統(tǒng)或通過脂質(zhì)雙層直接擴散進入細胞,卵泡液中的NEFA也可能通過類似的機制進入卵丘細胞和卵母細胞[78]。奶牛NEB狀態(tài)下,體內(nèi)脂肪動員,血漿和卵泡液中的NEFA處于較高水平,高濃度的飽和NEFA會影響顆粒細胞的增殖,降低顆粒細胞活力,對濾泡細胞、卵母細胞減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育也產(chǎn)生不利影響[79-80]。長期暴露在高濃度NEFA帶來的有害影響統(tǒng)稱為脂毒性,脂毒性損害細胞結(jié)構(gòu)和功能,導致奶牛器官和機體損傷,奶牛的生殖性能受到極大影響[81]。有研究表明,給奶牛口服丙二醇可有效增加其血漿中的葡萄糖濃度,降低BHBA和NEFA水平,緩解奶牛NEB,預防酮癥[12]。此外,由于血漿中葡萄糖水平升高,奶牛的繁殖性能和免疫功能也會適當提高。

4 展 望

奶牛NEB通過影響奶牛的下丘腦-垂體-卵巢軸的激素分泌以及卵泡的能量代謝而影響卵泡發(fā)育,奶牛的發(fā)情周期受到干擾,影響到正常生產(chǎn),給畜牧業(yè)造成了極大損失。改善奶牛NEB問題,有助于奶制品行業(yè)的發(fā)展,更有利于我國畜牧業(yè)振興。近年來,得益于組學技術(shù)的快速發(fā)展,人們對于奶牛NEB的認識越來越清晰,為解決奶牛NEB提供了寶貴的理論依據(jù)。然而現(xiàn)有的研究無法完全解決奶牛NEB問題,在未來,隨著奶牛生產(chǎn)管理經(jīng)驗的逐漸豐富、組學分析技術(shù)的進一步發(fā)展,奶牛NEB的分子機制將逐步揭示,為提高奶牛繁殖力、生產(chǎn)效率提供重要實踐積累和理論依據(jù),奶牛NEB問題有望得到妥善解決。