楊雙娟 唐昊 趙艷艷 魏小春 王志勇 蘇賀楠 張文靜 李林 王坐京 原玉香 張曉偉

摘? ? 要：以大白菜蠟質(zhì)突變體YW71為對象，研究其亮綠無蠟粉性狀的遺傳規(guī)律和調(diào)控基因。通過遺傳分析，表明YW71中的亮綠無蠟粉性狀由隱性單基因控制。通過等位基因互補實驗證明YW71的亮綠性狀是BrWAX2等位突變引起的。序列分析表明，在YW71中BrWAX2基因在第3個外顯子末端發(fā)生了39 bp的缺失，進而引起轉(zhuǎn)錄水平的可變剪切和翻譯水平的提前終止。表達模式分析表明，BrWAX2基因在YW71莖和葉中表達量顯著下降。此外，研究針對39 bp的變異開發(fā)并驗證了共顯性標記BrWAX2-InDel1。研究結(jié)果豐富了白菜類蔬菜蠟質(zhì)突變遺傳資源，將為亮綠無蠟粉品種的分子育種提供理論指導和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：大白菜；亮綠突變體；等位基因互補實驗；序列變異分析

中圖分類號：S634.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）01-032-07

Inheritance and sequence variation analysis of a wax-less mutant YW71 in Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）

YANG Shuangjuan1， TANG Hao1， 2， ZHAO Yanyan1， WEI Xiaochun1， WANG Zhiyong1， SU Henan1， ZHANG Wenjing1， LI Lin1， WANG Zuojing1， YUAN Yuxiang1， ZHANG Xiaowei1

（1. Institute of Vegetables， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China; 2. College of? Horticulture and Landscape Architecture， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan， China）

Abstract： In this study， we identified a wax-less Chinese cabbage （Brassica rapa） mutant YW71， the inheritance and the controlling gene for the glossy trait were studied extensively. Genetic analysis indicated that the glossy trait in YW71 was controlled by a single recessive locus. Allelic complementary experiment showed that the glossy trait in YW71 was caused by mutation of the gene BrWAX2. Sequence analysis revealed that a 39 bp deletion was identified at the end of the third exon of BrWAX2， resulting in alternative splicing at the transcription level and finally leading to a premature stop codon at the translation level. Expression analysis showed that BrWAX2 was significantly down-regulated in stems and leaves of glossy YW71. Furthermore， a co-dominant marker BrWAX2-InDel was developed and validated. Overall， these results enrich the genetic resources of glossy mutants and provide applicable markers for marker-assisted selection （MAS）-based breeding of Chinese cabbage， which has pivotal significance in theory and practice.

Key words： Chinese cabbage; Glossy mutant; Allelic complementary experiment; Sequence variation analysis

植物表面的蠟質(zhì)也稱蠟粉，是覆蓋在植物表皮細胞外的一層由親脂性化合物構(gòu)成的疏水層[1-2]。蠟粉的主要作用是減少非氣孔的水分散失、增強植株對生物脅迫和非生物脅迫的抗性等。此外，蠟質(zhì)還影響植物的生長發(fā)育，蠟質(zhì)缺失相關(guān)基因的突變會引起器官融合和育性降低[3-4]。白菜類作物（Brassica rapa L.）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica），包括大白菜（B. rapa subsp. pekinensis）、小白菜（B. rapa subsp. chinensis）、蕪菁（B. rapa subsp. rapifera）、菜心（B. campestris L. chinensis var. utilis Tsen et Lee）等多個亞種和變種，擁有共同的基因組（A基因組），相互之間雜交可以結(jié)實，沒有生殖隔離，在大白菜中鑒定的優(yōu)異基因可以通過雜交并回交的方式轉(zhuǎn)移到菜心和小白菜中[5]。白菜類作物中的菜心和薹菜等以鮮嫩的莖和葉為食用器官，其葉片和莖表皮蠟質(zhì)性狀是一個重要商品性狀。蠟質(zhì)缺失蔬菜的葉片和莖部表皮覆蓋蠟質(zhì)極少，顏色亮綠，有光澤，商品性好，食用品質(zhì)佳，感官上更鮮嫩，更受消費者喜愛[6-7]。但是白菜類蔬菜的蠟質(zhì)性狀只有在抽薹開花期才能表現(xiàn)出來，在選育亮綠無蠟粉材料過程中費時費力，極大地延緩了育種進程。因此，鑒定新的亮綠無蠟粉基因，并開發(fā)實用的分子標記，進而利用分子標記輔助篩選對加快亮綠無蠟粉品種的育種速度具有重要意義。

目前，白菜類蔬菜中克隆了4個亮綠無蠟粉基因。Zhang等[8]以亮綠無蠟粉08A235-2為親本，克隆了BrWAX1基因，該基因編碼BAHD?；D(zhuǎn)移酶，與擬南芥CER2基因同源。筆者研究團隊前期以亮綠無蠟粉材料Y1211-1為親本，克隆了BrWAX2基因，該基因編碼醛脫羧酶，與擬南芥CER1基因同源[9]。研究表明，Y1211-1材料完全缺失了BrWAX2基因，阻礙了C30醛向C29烷烴的轉(zhuǎn)化，導致了烷烴物質(zhì)的含量降低，并最終表現(xiàn)出亮綠無蠟粉表型。此外，筆者研究團隊以亮綠無蠟粉材料SD369為親本，克隆了BrWAX3基因，該基因編碼酮脂酰CoA合酶，是AtCER60的同源基因[10]。最近，Li等[11]以亮綠材料HN19-G為親本，通過圖位克隆方式分離了一個新的蠟質(zhì)基因Brcer2，該基因編碼BAHD?；D(zhuǎn)移酶，影響C28脂肪酸的延伸。

前人分離蠟質(zhì)基因大多通過正向遺傳學的圖位克隆方式獲得目的基因，并解析蠟質(zhì)突變基因的序列變異方式，但是近年來涌現(xiàn)出很多重復性研究工作，例如Liu等[12]于2017報道鑒定了甘藍的一個蠟質(zhì)基因Cgl2，該基因在甘藍基因組中對應基因Bol013612，是擬南芥CER4的同源基因，該基因在突變材料LD10GL中發(fā)生了一個SNP的突變導致了功能缺失；而相同的作者于2018年又報道鑒定了一個蠟質(zhì)基因BoWax1，該基因同樣是擬南芥CER4的同源基因，在基因組上對應相同的基因Bol013612，只不過該基因在新的突變體材料HUAYOU2中發(fā)生了2 bp的缺失[13]，與之前的序列變異方式不同而已。筆者認為這種相同基因的不同等位變異方式的解析，可以先通過突變體材料的雜交確定是否是等位基因，如果是等位基因，直接對目的基因進行測序進而解析其序列變異方式，如果不是等位基因，再進行圖位克隆進行目的基因分離，如此可以避免圖位克隆的重復性工作，提高基因利用效率。

筆者以蠟質(zhì)突變體YW71為研究材料，通過構(gòu)建遺傳群體分析了YW71中亮綠無蠟粉性狀的遺傳規(guī)律，通過等位基因檢測方式判斷YW71與已知蠟質(zhì)突變體的關(guān)系，克隆了YW71中的蠟質(zhì)基因，開發(fā)了基因內(nèi)的分子標記，以期為白菜類蔬菜蠟質(zhì)合成的分子機制解析和亮綠無蠟粉材料的分子輔助育種提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料與遺傳分析

筆者的試驗選用小孢子培養(yǎng)獲得的雙單倍體DH系YW71、R16、YW81、Y1211-1和SD369為供試材料，材料均由河南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所提供。YW71為亮綠無蠟粉材料，R16為正常的有蠟粉材料，以YW71和R16為親本，雜交獲得F1，進而F1自交獲得F2。2022年1月5日將YW71、R16以及F1和F2群體種植于河南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所原陽試驗田，田間統(tǒng)一管理，待所有材料抽薹后調(diào)查每個植株花莖、葉片上有無蠟粉，根據(jù)F2的有蠟粉植株和亮綠無蠟粉植株的分離比例進行遺傳規(guī)律分析。

YW81、Y1211-1和SD369均為亮綠無蠟粉材料，YW81的亮綠表型是由BrWAX1基因突變引起的[8]，Y1211-1的亮綠表型是由BrWAX2基因完全缺失造成的[9]，SD369的亮綠表型是由BrWAX3基因第一個外顯子的5567 bp的插入突變引起的[10]。筆者的研究將YW71分別與YW81、Y1211-1和SD369雜交獲得F1，進而觀察F1植株花莖和葉片表面蠟粉的有無。如果兩個亮綠材料的F1表現(xiàn)為有蠟粉表型，則表明兩個亮綠材料攜帶的蠟質(zhì)基因不是等位基因，在基因組上位于不同的位置；如果兩個亮綠材料的F1表現(xiàn)為亮綠無蠟粉表型，則表明兩個亮綠材料攜帶的蠟質(zhì)基因是同一個基因，即在基因組上位于同一基因座位。

1.2 基因組DNA提取和目的基因克隆

采集供試材料的新鮮葉片，采用CTAB法[14]提取所需材料的基因組DNA，用NanoDrop One（Thermo Scientific公司）和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度。

采用BrWAX2全長引物BrWAX2-g1（表1）[9]擴增YW71的gDNA全長和CDS全長序列。擴增所用PCR體系為50 μL：3 μL DNA模板（100 ng·μL-1），25 μL Phanta Flash Master Mix（2×）（諾唯贊生物科技股份有限公司），上下游引物各3 μL，16 μL ddH2O。PCR擴增程序為第一階段98 ℃變性30 s；第二階段98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；第三個階段72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物送公司（上海鉑尚生物科技有限公司）利用F和R引物進行雙向Sanger測序，進而獲得每份材料的基因序列。獲得序列利用DNAMAN8.0軟件進行多重序列比對。

1.3 RNA提取和qPCR定量分析

采集YW71和R16抽薹后的葉片和莖表皮，置于液氮中速凍。采用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒提取總RNA，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Kit（全式金生物技術(shù)有限公司）將YW71和R16的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

以BrGAPDH作為內(nèi)參基因[15-16]，用引物BrWAX2-Qua1（表1）[9]進行表達量分析。定量分析所用試劑為TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II，PCR反應在Roche LightCycler 480II上進行。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算。表達量顯著性分析和作圖利用GraphPad Prisim完成。

1.4 常規(guī)PCR擴增和檢測

PCR 反應體系總體積為 20 μL，其中包括 3 μL 50 ng ·μL-1 模板 DNA，上、下游引物（10 μmol ·L-1）各1 μL，10 μL 3G Taq Master Mix（諾唯贊生物科技股份有限公司），ddH2O 5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物使用9%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料YW71中亮綠無蠟粉性狀由隱性單基因BrWAX2控制

YW71的莖和葉表現(xiàn)為亮綠無蠟粉（圖1）， R16的莖和葉表面被覆蠟粉（圖1），兩個親本雜交得到的F1表現(xiàn)為有蠟粉表型，F(xiàn)2 群體中有蠟粉植株 102 株，無蠟粉植株40株，經(jīng)卡平方測驗符合3∶1的分離比例（χ2 = 0.76 < χ20.05 = 3.84，p < 0.05）。綜上，遺傳分析表明YW71中亮綠無蠟粉性狀由1對隱性核基因控制。

YW81、Y1211-1和SD369均為亮綠無蠟粉材料，攜帶的蠟質(zhì)基因分別是BrWAX1、BrWAX2和BrWAX3。為了明確YW71攜帶的蠟質(zhì)基因是否與上述3份亮綠無蠟粉材料攜帶的蠟質(zhì)基因一樣，將YW71和這3份材料分別雜交獲得F1。結(jié)果表明，YW71和YW81雜交得到的F1植株表現(xiàn)為正常有蠟粉表型，（YW71×SD369）F1也表現(xiàn)為正常有蠟粉表型，但是YW71和Y1211-1的雜交F1植株表現(xiàn)為亮綠無蠟粉表型（圖1），表明YW71和Y1211-1攜帶蠟質(zhì)基因相同，均是由BrWAX2基因突變引起的亮綠表型。

2.2 YW71中亮綠無蠟粉性狀由BrWAX2基因39 bp缺失引起

為了探明亮綠材料YW71中BrWAX2基因是如何變異導致的亮綠無蠟粉表型，筆者利用全長引物BrWAX2-g1擴增亮綠材料YW71的全長DNA和CDS序列（圖2），序列分析表明在DNA水平上，與正常有蠟粉材料R16相比，亮綠材料YW71中BrWAX2基因在790 bp處發(fā)生了39 bp的缺失，但是在cDNA水平上，R16的CDS全長為1887 bp，YW71的CDS全長序列為1436 bp，YW71的CDS全長序列比R16減少了451 bp（圖3-A）。筆者在第4個外顯子末端設(shè)計了2個反向互補引物BrWAX2-P2R和BrWAX2-P3F，分別與BrWAX2-g1F和BrWAX2-g1R配對組成分段引物BrWAX2-P2和BrWAX2-P3，以YW71和R16的cDNA為模板進行擴增，結(jié)果表明，BrWAX2-P2在R16中的擴增產(chǎn)物大小為714 bp，在YW71中的擴增產(chǎn)物大小為263 bp （圖3-B），片段大小差異為451 bp，而BrWAX2-P3在R16和YW71中的擴增大小一致，均為1195 bp，由此也進一證明，BrWAX2基因在亮綠材料YW71中缺失了451 bp的CDS序列。將2份材料BrWAX2基因的DNA和CDS序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)亮綠無蠟粉材料YW71中39 bp的缺失發(fā)生在第3個外顯子末端4 bp和第3個內(nèi)含子前端35 bp的鄰接處，該39 bp的缺失引起了可變剪切，具體表現(xiàn)為第2和第3外顯子的缺失（圖3-C），最終導致翻譯蛋白的提前終止和蛋白功能缺失（圖3-D）。

2.3 YW71中BrWAX2基因表達量顯著下降

前期研究表明，蠟質(zhì)基因BrWAX2在莖、葉、萼片、花瓣等地上組織中表達量均較高[9]，為分析亮綠無蠟粉材料YW71中BrWAX2基因的表達情況，研究提取了YW71和R16莖和葉的RNA。以BrGAPDH作為內(nèi)參基因，用引物BrWAX2-Qua1（表1）檢測BrWAX2基因在YW71中的相對表達量。結(jié)果表明，無論是在有蠟粉材料R16還是在亮綠材料YW71中，BrWAX2基因在葉片中的表達量均高于在莖中的表達量（圖4）。BrWAX2基因在材料R16莖表皮的表達量是YW71莖表皮中的3.2倍（圖4），表達水平呈極顯著差異；在R16葉片中的表達量是YW71葉片中的2.2倍（圖4），表達水平也呈極顯著差異。

綜上，BrWAX2基因在亮綠無蠟粉材料YW71中的表達量顯著降低，與蠟粉表型數(shù)據(jù)是一致的，從表達水平證明了YW71亮綠無蠟粉表型與BrWAX2基因的變異相關(guān)。

2.4 突變位點的標記開發(fā)和驗證

為了進一步驗證YW71亮綠無蠟粉表型是否是由BrWAX2基因突變引起的，筆者針對YW71中該基因39 bp的缺失設(shè)計了一個InDel標記BrWAX2-InDel1（表1），在有蠟粉材料R16中擴增條帶為255 bp，在亮綠材料YW71中條帶大小為216 bp。將此標記在（YW71×R16）F2群體中進行驗證，結(jié)果表明，在檢測的142個F2單株中，102株有蠟粉單株的基因型有2種帶型，其中65株的帶型為雜合帶型，37株的帶型與R16一致（圖5），而40株亮綠無蠟粉單株的基因型均和YW71一致，均擴增出216 bp的條帶（圖5）。

綜上，標記BrWAX2-InDel1檢測的基因型和有無蠟粉表型數(shù)據(jù)完全一致，表明YW71亮綠無蠟粉表型是由BrWAX2基因突變引起的。

3 討論與結(jié)論

筆者發(fā)現(xiàn)了一個新的蠟質(zhì)突變體YW71，通過多個證據(jù)證明了YW71的亮綠無蠟粉表型是由BrWAX2基因等位突變引起的。其一，通過突變體等位基因測試實驗證明YW71與Y1211-1突變體為等位基因，均是由BrWAX2基因突變引起的；其二，序列分析表明BrWAX2基因在YW71中發(fā)生了39 bp的缺失，該變異發(fā)生在第3個外顯子末端，引起了可變剪切和翻譯的提前終止，最終導致蛋白功能缺失；其三，表達量分析表明，BrWAX2基因在亮綠無蠟粉材料YW71的莖和葉中的表達量均顯著下降；其四，基于39 bp缺失變異設(shè)計的標記BrWAX2-InDel1在F2群體中的基因型與有、無蠟粉表型完全一致。綜上，材料YW71的亮綠無蠟粉表型是由BrWAX2基因第3個外顯子末端39 bp的缺失引起的。

植物蠟質(zhì)的合成包括三個階段：首先是C16/C18脂肪酸在質(zhì)體中的從頭合成；然后是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成超長鏈飽和脂肪酸（VLCFA）；最后是VLCFAs通過醇合成途徑（Alcohol-forming pathway）和烷烴合成途徑（Alkane-forming pathway）合成表皮蠟質(zhì)成分[2-3]。烷烴代謝途徑的主要產(chǎn)物有烷烴、醛、酮、次級醇等，這些蠟質(zhì)成分大約占擬南芥蠟質(zhì)總量的80%左右；醇合成途徑的主要產(chǎn)物是初級醇和蠟酯，它們大約占蠟質(zhì)總含量的20%左右[17]。CER1是烷烴合成途徑的主要基因，催化C30醛脫羧基轉(zhuǎn)變?yōu)镃29烷烴，CER1基因的突變會引起C29烷烴的含量下降，以及C30醛含量的上升[9，18]。在白菜中，筆者研究團隊發(fā)現(xiàn)突變體Y1211-1的亮綠無蠟粉表型是由BrWAX2（CER1）基因的完全缺失引起的[9]。Liu等[19]在一個白菜EMS突變體中發(fā)現(xiàn)CER1基因在第4個外顯子的一個SNP變異導致了亮綠無蠟粉表型。本研究通過等位基因雜交測驗方式快速證明了新發(fā)現(xiàn)的蠟質(zhì)突變體YW71和已知突變體Y1211-1攜帶的蠟質(zhì)突變基因為等位基因，避免了圖位克隆等分子實驗，大大節(jié)約了實驗成本以及人力物力投入。

綜上所述，筆者研究發(fā)現(xiàn)YW71的亮綠表型是由CER1基因在第3個外顯子末端的39 bp的缺失變異導致的，豐富了BrWAX2（CER1）基因的遺傳資源和變異形式。此外，筆者研究開發(fā)的基因特異標記BrWAX2-InDel1可以用于亮綠無蠟粉材料和品種的分子標記輔助選擇，具有重要的應用價值。

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