張博媛 孫德鵬 王鈺涵 田敬怡 牟柏德 崔明勛 李官浩

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部延邊特色高品質(zhì)牛肉精深加工創(chuàng)新重點實驗室,吉林 延吉 133002;2. 東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心,吉林 延吉 133002;3. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

在評價鮮肉食用質(zhì)量特征時,嫩度在消費者接受程度上起著至關(guān)重要的作用[1]。動物經(jīng)屠宰后肌細(xì)胞處于無氧狀態(tài)導(dǎo)致肌肉收縮,影響肉的嫩度。在成熟過程中由于內(nèi)源性蛋白水解酶調(diào)控細(xì)胞凋亡[2],加快肌原纖維蛋白和結(jié)締組織蛋白的水解,以蛋白質(zhì)降解為主的生化反應(yīng)能夠改善肉的質(zhì)地。目前常見的宰后成熟方式有干法成熟和濕法成熟兩種[3-4],均能顯著提高肉的嫩度[5]。Kim等[6]分別將牛肉進行了28 d的濕法成熟和干法成熟,發(fā)現(xiàn)干熟樣品的剪切力低于濕熟樣品;也有研究[7]表明,干法成熟至14～35 d時,牛肉的嫩度和剪切力雖然持續(xù)改善,但14 d之后的嫩度改善效果顯著降低。張睿[8]的研究結(jié)果也顯示了干法成熟和濕法成熟均有效改善牦牛西冷的嫩度,且成熟時間越長,改善效果越好。肌纖維已被確定為影響肉類品質(zhì)的重要因素,肉的最終嫩度也取決于肌原纖維結(jié)構(gòu)的改變和降解的程度[9-10]。因此,為了探究宰后不同成熟過程中肉嫩度的變化,有必要深入探究成熟過程中肌原纖維蛋白降解與結(jié)構(gòu)特性改變對宰后牛肉的影響。

延邊黃牛臀肉中脂肪含量低,肌纖維比例較高,推斷其在成熟過程中結(jié)構(gòu)改變和降解速率較快[11]。研究擬以臀肉作為材料,分別進行30 d的干法成熟和濕法成熟,通過比較肉的嫩度相關(guān)品質(zhì)、肌纖維結(jié)構(gòu)特性和蛋白質(zhì)降解程度,分析宰后成熟過程中嫩度變化,以優(yōu)化最佳的嫩化方式為實際加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性成年延邊黃牛:龍井長白山犇福清真肉業(yè)有限公司;

氯化鉀、氯化鎂、乙二胺四乙酸、甲醛、乙醇、二甲苯、尿素、硫脲:分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、考馬斯亮蘭染色套裝、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒:北京索萊寶科技有限公司;

pH計:pH-STAR型,北京天翔飛域科技有限公司;

高速分散均質(zhì)機:DY89-Ⅱ型,寧波新芝生物科技股份有限公司;

質(zhì)構(gòu)儀:TMS-PLUS型,北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司;

酶標(biāo)儀:Multiskan FC型,德國賽默飛世爾科技公司;

組織切片機:HistoCore BIOCUT型,德國徠卡公司。

1.2 成熟工藝

成年雄性延邊黃牛屠宰后,將臀肉均勻分割成形狀統(tǒng)一、重量為(2.0±0.2) kg的肉塊,充分混合后隨機分為2組進行30 d的干法成熟和濕法成熟,干法成熟(D):懸掛在發(fā)酵箱中,溫度2～4 ℃,相對濕度(RH)(85±5)%,風(fēng)速1.2 m/s;濕法成熟(W):真空包裝放置于2～4 ℃的環(huán)境中;每組6塊,同時取2塊作為0 d空白對照樣品,各處理組分別在成熟10,20,30 d時取樣。

1.3 試驗方法

1.3.1 剪切力值測定 將溫度計插入肉塊中心,于蒸煮袋內(nèi)水浴加熱至溫度為75 ℃后取出,充分冷卻后順肌纖維方向切成1 cm×1 cm×3 cm的長條測定剪切力值,測試速度60 mm/min,初始力0.5 N。

1.3.2 水分含量測定 參照GB 5009.3—2016。

1.3.3 pH 采用pH計法。

1.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)的測定 參考張詩泉等[12]的方法并修改,取2 g成熟牛肉樣品,加入30 mL緩沖液(100 mmol/L KCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L MgCl2,pH 7.0),冰浴勻漿1 min。在4 ℃、10 000 r/min離心15 min,棄去上清液,在沉淀中再次加入20 mL緩沖液,充分溶解后用BCA試劑盒測定蛋白濃度后,稀釋至質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL,于540 nm下測溶液的吸光度,將吸光度值乘200后,即為肌原纖維小片化指數(shù)。

1.3.5 石蠟切片制備及染色 肉樣垂直肌纖維方向切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊后放置于體積分?jǐn)?shù)4%的甲醛溶液中固定24 h,再用自來水沖洗過夜。將組織切成合適大小裝入包埋盒,依次于體積分?jǐn)?shù)為70%,80%,90%,95%,100%的酒精中脫水1 h,再放置于二甲苯中浸泡10 min透明;分別于軟蠟和硬蠟中浸泡1 h后包埋。用石蠟切片機將組織切成6 μm的薄片后HE染色。

1.3.6 肌纖維結(jié)構(gòu)觀察 用顯微鏡觀察染色后的切片并拍照,隨機選取20根肌纖維[13],用Image-pro plus軟件計算肌纖維橫截面積S和肌纖維直徑L;肌纖維密度D以單位面積S1內(nèi)肌纖維數(shù)量N計算。

1.3.7 蛋白提取 根據(jù)Roberto等[14]的方法。取1 g肉樣,加入10 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)后,在冰浴中勻漿2 min,4 ℃ 10 000×g離心20 min,取上清液,為肌漿蛋白提取物;再次向沉淀中加入等體積緩沖液,渦旋后離心除掉上清液中的可溶性蛋白,再向沉淀中加入10 mL含6 mol/L尿素和1 mol/L硫脲的50 mmol/L Tris-HCl渦旋5 min,4 ℃ 10 000×g離心20 min,將上清液置于活化后的透析袋中4 ℃透析過夜,即得肌原纖維蛋白提取液。

1.3.8 SDS-PAGE分析 用BCA蛋白定量試劑盒測量提取的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的濃度,并用磷酸鹽緩沖液調(diào)至2 mg/mL。以體積比3∶1加入4×蛋白上樣緩沖液,在沸水中煮5 min至變性。SDS-PAGE條件:分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%,濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%,上樣量10 μL,先以80 V電壓電泳直到條帶于濃縮膠與分離膠臨界處,然后以140 V電壓電泳直到指示條帶至分離膠底端,用考馬斯亮藍(lán)套裝染色、脫色后觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個試驗平行重復(fù)3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;采用SPSS 27.0.1軟件中單因素方差分析數(shù)據(jù)是否具有顯著性差異,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 剪切力值的變化

由圖1可知,兩種成熟方式的剪切力值均隨時間延長呈顯著下降趨勢(P<0.05),這一過程是由蛋白酶的作用或鈣離子在成熟過程中引起肌原纖維間Z線降解引起的[15]。相比于干法成熟,濕法成熟對嫩度有更好的改善作用(P<0.05),是由于無氧狀態(tài)下宰后肌肉發(fā)生糖酵解等生化反應(yīng)使pH值下降[16],變性的肌原纖維蛋白成為組織蛋白酶B、蛋白酶體6等蛋白酶系統(tǒng)更容易作用的靶點,在牛肉嫩化方面也很重要[17-18]。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.2 水分含量的變化

由圖2可知,干法成熟過程中牛肉水分含量隨成熟時間延長呈下降趨勢,且顯著低于濕法成熟組(P<0.05)。濕法成熟的水分含量穩(wěn)定歸因于真空包裝,而干法成熟由于環(huán)境濕度的影響,在牛肉解僵和成熟過程中汁液流失過多,水分含量降低。肌肉中的水分含量一定程度上會影響肉的嫩度,牛肉脫水使肌纖維空隙增大[19],因此干法成熟牛肉的嫩度低于濕法成熟樣品。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.3 pH值的變化

pH值對宰后牛肉的嫩度和持水力等都有一定的影響[20]。由圖3可知,干法成熟牛肉的pH值隨時間延長呈上升趨勢,濕法成熟的相反。這可能是由于微生物的作用,干法成熟牛肉表面的低水分環(huán)境有利于酵母菌的增殖[21],蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)使得成熟期間pH值升高。而濕法成熟樣品由于真空包裝隔絕氧氣,乳酸菌增殖導(dǎo)致成熟期間pH值降低[22]。有研究表明,在濕法成熟過程中,pH值下降增強了caspase-3的激活和線粒體功能障礙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[23],或由于低pH值改變了質(zhì)子的穩(wěn)態(tài),降低了肌原纖維蛋白之間的靜電斥力,引起肌肉纖維不可逆?zhèn)认蚴湛s,使牛肉嫩度提升[24]。

小寫字母表示同種成熟方式不同成熟時期差異顯著(P<0.05);大寫字母表示相同時期不同成熟方式間差異顯著(P<0.05)

2.4 肌原纖維小片化指數(shù)變化

由圖4可知,兩種成熟方式的肌原纖維小片化指數(shù)均隨時間延長呈上升趨勢,且濕法成熟顯著高于干法成熟組(P<0.05),分別達(dá)到339.8±16.6和231.6±19.0。肌原纖維小片化指數(shù)在一定程度上能夠間接預(yù)測肉的嫩度,變化趨勢反映出牛肉結(jié)構(gòu)蛋白水解程度隨成熟時間的延長而升高,并被降解為片段[25]。肌纖維間I帶斷裂、肌聯(lián)蛋白降解等變化降低肌原纖維結(jié)構(gòu)強度,使肉的嫩度提高[12]。

2.5 肌纖維特性變化

延邊黃牛肉干法成熟和濕法成熟過程中肌纖維結(jié)構(gòu)特性如圖5和表1所示。干法成熟組肌纖維特性隨時間延長均無顯著差異(P>0.05),濕法成熟組肌纖維面積和直徑均隨時間延長呈降低的趨勢,肌纖維密度顯著升高(P<0.05)。濕法成熟組的肌內(nèi)膜邊緣降解,逐漸模糊、厚度變小,肌纖維之間排列緊密,幾乎沒有間隙,這可能是導(dǎo)致濕法成熟樣品嫩度提升的原因之一。推測肌內(nèi)膜和肌束膜等結(jié)締組織的變化對肉的嫩度一樣起著關(guān)鍵作用[26]。宰后成熟是改善肉品質(zhì)的重要途徑,控制細(xì)胞凋亡能夠調(diào)控肉品嫩化的進程,或通過調(diào)節(jié)蛋白酶活性及產(chǎn)生作用的持續(xù)時間來控制[27]。

表1 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌纖維組織學(xué)特性?

2.6 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析

如圖6可知,兩種成熟方式在成熟30 d時,Ⅰ肌漿(180 kDa蛋白條帶)處出現(xiàn)新的條帶,可能是大分子肌漿蛋白降解的結(jié)果;肌漿蛋白是水溶性蛋白,包括糖酵解途徑的許多酶[28],其中肌酸激酶和醛縮酶(35～48 kDa范圍內(nèi)兩條蛋白條帶)隨成熟時間延長逐漸降解;干法成熟組Ⅱ肌漿(25 kDa蛋白條帶)和Ⅲ肌漿(11 kDa以下蛋白條帶)明顯深于濕法成熟。以上條帶的變化說明干法成熟更容易使牛肉中相對分子質(zhì)量高的肌漿蛋白分解成為相對分子質(zhì)量低的蛋白,且種類增多,濃度增大。

圖6 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌漿蛋白的降解

如圖7可知,肌球蛋白和肌動蛋白變化不明顯,但隨著成熟時間的延長,原肌球蛋白(35～45 kDa處蛋白條帶)和肌鈣蛋白(17 kDa蛋白條帶)出現(xiàn),肌球蛋白輕鏈(25 kDa蛋白條帶)逐漸加深,由以上蛋白條帶變化可知,肌原纖維蛋白的降解主要發(fā)生在17～48 kDa范圍內(nèi),濕法成熟樣品由于內(nèi)源酶作用蛋白水解更強烈[18],出現(xiàn)的新條帶可能是肌動蛋白和肌球蛋白的降解產(chǎn)物[29],肌原纖維是肌肉結(jié)構(gòu)蛋白,牛肉成熟過程中肌原纖維蛋白降解和肌原纖維小片化指數(shù)增加顯示出肌原纖維結(jié)構(gòu)被破壞。

圖7 延邊黃牛肉宰后成熟過程中肌原纖維蛋白的降解

3 結(jié)論

干法成熟和濕法成熟均能夠提升延邊黃牛肉的嫩度,剪切力值、肌原纖維小片化指數(shù)以及蛋白降解等嫩度相關(guān)指標(biāo)隨時間延長存在顯著變化(P<0.05)。由于濕法成熟組牛肉蛋白降解快,肌原纖維破裂指數(shù)顯著高于干法成熟組,并且從肌纖維結(jié)構(gòu)可以觀察到濕法成熟組肌纖維內(nèi)膜邊緣降解,肌纖維排列緊密,肉質(zhì)更嫩(P<0.05)。干法成熟組在11～25 kDa范圍內(nèi)的肌漿蛋白條帶明顯加深,說明延邊黃牛肉在成熟過程中肌漿蛋白降解為相對分子質(zhì)量小的蛋白,改善肉的嫩度。研究宰后成熟過程中蛋白質(zhì)降解、肌纖維結(jié)構(gòu)變化對牛肉嫩度的影響有利于延邊黃牛肉高檔產(chǎn)品的加工貯藏,在后續(xù)的試驗中應(yīng)更加深入研究濕法成熟過程中內(nèi)源性蛋白酶如半胱氨酸蛋白酶和鈣蛋白酶等對肌肉細(xì)胞凋亡、結(jié)締組織降解的影響。