姜云，喬春鳳，劉華，喬亞紅，李俊濤

1.鄭州頤和醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450047

2.河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院 藥物研究所，河南 鄭州 450052

茜草是茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥全草，可涼血、祛瘀、止血、通經(jīng)，臨床上主要用于吐血、衄血、崩漏、外傷出血、瘀阻經(jīng)閉、關(guān)節(jié)痹痛、跌撲腫痛[1]。蒽醌及其苷類化合物、萘醌類、萘氫醌、黃酮類、環(huán)己肽類、多糖類和微量元素等是茜草中主要藥效成分[2-4]?，F(xiàn)代研究表明，茜草具有抗腫瘤、升高白細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、抗炎、抗風(fēng)濕、抗氧化、止血等作用[5-7]，并且現(xiàn)代研究還證明，蒽醌類成分茜草素在體外對(duì)沙門菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和變形桿菌等都具有明顯的抑制作用[4]，還用于治療嬰幼兒病毒性腹瀉[5,8]。茜草收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定大葉茜草素不得少于0.40%，羥基茜草素不得少于0.10%。對(duì)于茜草質(zhì)量研究文獻(xiàn)僅限指紋圖譜[9-12]和1～2 個(gè)成分的定量[13-15]。中藥是復(fù)雜的個(gè)體，所含成分多而雜，少數(shù)指標(biāo)成分不能詮釋其內(nèi)在整體質(zhì)量。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）是化學(xué)計(jì)量學(xué)常用的技術(shù)手段，通過對(duì)含量數(shù)據(jù)分析挖掘，查找共性和不同，對(duì)樣品分組分類，發(fā)現(xiàn)決定產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)志性成分，預(yù)測(cè)精度高[16-19]。灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）可客觀地對(duì)各組數(shù)據(jù)相似程度進(jìn)行因素間相互關(guān)聯(lián)分析，是解決多目標(biāo)之間復(fù)雜關(guān)系問題的有力工具[20-22]。PCA、OPLS-DA 和GRA 均不存在主觀因素，客觀地對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，非常適用于所含成分繁多的中藥。本研究收集陜西、河南、安徽、河北、山東、青海、四川和西藏8 省區(qū)共18個(gè)批茜草藥材，采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素10 種成分，通過化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合GRA 法進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，希望為茜草質(zhì)量總體評(píng)價(jià)和新標(biāo)準(zhǔn)的提升、制定提供數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

新橙皮苷（批號(hào)111857-202305，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、山柰酚（批號(hào)110861-202214，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.4%）、羥基茜草素（批號(hào)111898-202004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.8%）、大葉茜草素（批號(hào)110884-202107，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、β-谷甾醇（批號(hào)110851-201909，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.7%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；茜草素（批號(hào)CFS202301，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%）、異茜草素（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%）、去氫-α-拉杷醌（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%）、異落葉松脂素（批號(hào)CFS202201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%）對(duì)照品均購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純，VSA 公司），磷酸（色譜純，F(xiàn)isher 公司），水為純凈水，甲醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；茜草經(jīng)河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院李俊濤研究員鑒定為正品，產(chǎn)地信息見表1。

1.2 儀器

LC-20A HPLC 儀（日本島津）；CP225D 型電子分析天平（北京賽多利斯），SB-5200 DTD 超聲波發(fā)生器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精準(zhǔn)稱取新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素10個(gè)對(duì)照品適量，用60%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.028、0.492、0.610、0.064、1.370、1.878、4.730、0.092、0.128、0.236 mg/mL 的混合貯備液，再將混合貯備液用同一溶劑稀釋20 倍，即得混合對(duì)照品溶液（含新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素1.40、24.60、30.50、3.20、68.50、93.90、236.50、4.60、6.40、11.80 μg/mL）。

2.2 供試品溶液的制備

將茜草樣品干燥、粉碎（過二號(hào)篩），取粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用提取溶劑補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.3 色譜條件

Alltima C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.2%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～12 min，20.0% B；12～19 min，20.0%→28.0% B；19～40 min，28.0%→45.0% B；40～53 min，45.0%→80.0% B；53～60 min，80.0%→20.0% B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（0～40 min，新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌）、210 nm（40～60 min，β-谷甾醇、異落葉松脂素）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在上述色譜條件下，供試品溶液中10 種成分色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且峰形對(duì)稱，與相鄰色譜峰分離良好（分離度均≥1.5），色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品（A）和茜草供試品（B）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms reference substances (A)and Rubiae Radix samples (B)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸混合貯備溶液，分別用60%甲醇按照4、10、20、40、100、200 倍稀釋成從高到低的6 個(gè)質(zhì)量濃度，進(jìn)樣測(cè)定，用得到的色譜峰峰面積作線性回歸處理。逐步稀釋各對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算主峰峰高與基線噪音的比值（S/N）。以S/N 為3 時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)為檢測(cè)限濃度；S/N 為10 時(shí)的質(zhì)量濃度計(jì)為定量限濃度。結(jié)果見表2?？梢?0 個(gè)成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察Table 2 Linear relationship investigation

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素色譜峰峰面積，計(jì)算得10 個(gè)成分峰面積的RSD 值分別為1.45%、1.06%、0.98%、1.23%、0.56%、0.50%、0.39%、1.32%、1.18%、1.22%。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取1 份茜草（S1）樣品，制成供試品溶液，分別在0、2、5、9、14、20、24 h進(jìn)樣，計(jì)算得新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素峰面積的RSD 值分別為1.95%、1.66%、1.08%、1.74%、0.78%、0.92%、0.67%、1.62%、1.88%、1.76%，結(jié)果表明茜草供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取茜草（S1）6 份，制備供試品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.032、0.549、0.836、0.073、1.922、2.537、6.561、0.098、0.136、0.253 mg/g，RSD 值分別為1.98%、1.86%、1.35%、1.60%、1.02%、0.89%、0.63%、1.57%、1.79%、1.81%。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取茜草（S1）細(xì)粉（過二號(hào)篩）9 份，每份0.5 g，精密稱定，分別加入混合對(duì)照品溶液（含新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素0.017、0.271、0.426、0.039、0.965、1.263、3.251、0.048、0.069、0.124 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算得10 種成分的平均回收率分別為96.97%、97.68%、98.05%、97.54%、100.10%、99.09%、100.18%、97.15%、97.38%、98.05%，RSD 值分別為0.93%、1.43%、1.34%、1.06%、0.76%、1.38%、0.69%、1.51%、1.13%、1.91%。

2.5 樣品測(cè)定

精密吸取18 批茜草樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表3。

表3 茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的測(cè)定結(jié)果（n＝3）Table 3 Determination of neohesperidin,kaempferol,alizarin,xanthopurpurin,purpurin,1,3,6-trihydroxy-2-methylanthraquinone,mollugin,dehydro-α-lapachone,β-sitosterol and isolariciresinol from Rubiae Radix (n＝3)

2.6 主成分分析（PCA）

應(yīng)用SIMCA 14.1 軟件對(duì)18 批茜草樣品中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)建立PCA模型，得圖2。提取出2 個(gè)主成分，其中模型系數(shù)R2X＝0.820，18 批茜草樣品分為3 組，S1～S5 為1組，S6～S12 為2 組，S13～S18 為3 組，聚為相同組的樣品來自1 個(gè)產(chǎn)區(qū)，說明相同產(chǎn)區(qū)的茜草，質(zhì)量較接近，且所有散點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明檢測(cè)數(shù)據(jù)未出現(xiàn)異常。

圖2 PCA 得分圖Fig.2 PCA score chart

2.7 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）

運(yùn)行OPLS-DA 程序，結(jié)果見圖3，模型參數(shù)R2X＝0.990、R2Y＝0.935、Q2＝0.753，均大于0.5，表明建立的模型穩(wěn)定可靠、預(yù)測(cè)能力強(qiáng)[16]。再以變量重要性投影（VIP）值＞1 為顯著影響[18]，共找到4 個(gè)差異性標(biāo)志成分，影響顯著性為大葉茜草素＞茜草素＞1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌＞羥基茜草素，VIP 值分別為1.810 3、1.366 7、1.240 5、1.226 4，結(jié)果見圖4。

圖3 茜草的OPLS-DA 模型得分圖Fig.3 Score chart of OPLS-DA model for Rubiae Radix

圖4 茜草的VIP 圖Fig.4 VIP images of Rubiae Radix

2.8 灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）

采用均值變換法對(duì)18 批茜草中10 個(gè)成分新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇、異落葉松脂素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)格化處理（表4）。以處理后每個(gè)成分的最大值為最優(yōu)參考序列，最小值為最差參考序列，分別計(jì)算各評(píng)價(jià)單元與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)、與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)（表5、6）[20]，最后計(jì)算相對(duì)關(guān)聯(lián)度[20]。以相對(duì)關(guān)聯(lián)度為測(cè)度，對(duì)茜草樣品進(jìn)行質(zhì)量?jī)?yōu)劣排序（表7）。結(jié)果18 批茜草的相對(duì)關(guān)聯(lián)度在0.327 6～0.592 7，S16、S15、S14、S13、S18、S17 分別位于排名前6 位，S3、S5、S2、S4、S1 位于排名中間位置，S12、S9、S11、S6、S8、S10、S7位于排名后7 位。結(jié)果表明陜西、河南和安徽所產(chǎn)的茜草整體質(zhì)量較好，其次為河北和山東產(chǎn)地。

表4 數(shù)據(jù)規(guī)格化處理結(jié)果Table 4 Results of data contents

表5 各指標(biāo)與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 5 Correlation coefficient between each index and the optimal reference sequence

表6 各指標(biāo)與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 6 Correlation coefficient between each index and the worst reference sequence

表7 各樣品相對(duì)關(guān)聯(lián)度及質(zhì)量?jī)?yōu)劣排序Table 7 Relative correlation degree and quality ranking of the samples

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

茜草中主要藥效成分為蒽醌及其苷類化合物、萘醌類、萘氫醌、黃酮類、環(huán)己肽類、多糖類等，現(xiàn)代研究表明萘醌類和蒽醌及其苷類化合物類為茜草中最主要的活性成分，與其抗氧化、抗炎、抗腫瘤功能密切相關(guān)用[5]，以茜草素、羥基茜草素、1-羥甲基蒽醌、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、異茜草素、山柰酚、新橙皮苷的含量較高；甾醇類是一類天然化合物，以β-谷甾醇含量較高。故本實(shí)驗(yàn)以上述10 種成分作為目標(biāo)成分，采用HPLC法同時(shí)測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相和供試品溶液的處理方式確定

考察了洗脫能力較強(qiáng)的有機(jī)相乙腈，水相選擇0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.5%磷酸、0.1%甲酸、水。綜合色譜峰對(duì)稱情況、基線平穩(wěn)情況、成分間的分離度、出峰時(shí)間等，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液。由于本實(shí)驗(yàn)中待測(cè)成分涵蓋了黃酮類、萜類、蒽醌類、甾醇類化合物，各類物質(zhì)極性不同，在供試品的預(yù)處理時(shí)，以新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素的綜合提取率、雜質(zhì)峰為指標(biāo)，通過對(duì)提取溶劑（45%甲醇、60%甲醇、75%甲醇）進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)以60%甲醇提取色譜峰數(shù)目多，且峰的純度高。通過對(duì)提取方式（超聲、加熱回流）和時(shí)間（30、45、60 min）進(jìn)行了考察，最終確定以60%甲醇加熱回流提取45 min 為茜草供試品溶液的最佳提取方式。

3.3 測(cè)定結(jié)果和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地的18 批茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示部分產(chǎn)地茜草中未檢出新橙皮苷、異茜草素和去氫-α-拉杷醌，大葉茜草素和羥基茜草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別在5.258～8.815 mg/g 和1.520～3.065 mg/g，符合《中國(guó)藥典》2020 年版一部的要求。采用化學(xué)計(jì)量學(xué)中最常用的PCA 和OPLS-DA 對(duì)全國(guó)8 個(gè)省產(chǎn)地的18 批茜草中新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素共10個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大葉茜草素、茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌和羥基茜草素是影響茜草質(zhì)量的主要物質(zhì)，提示對(duì)茜草的研究應(yīng)著重關(guān)注上述4 個(gè)成分，而且這4 個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果顯示S13～S18 明顯高于其他批次。同時(shí)GRA 結(jié)果顯示，陜西、河南和安徽產(chǎn)地的茜草整體質(zhì)量較好，與文獻(xiàn)報(bào)道[6,9,12]相符，為茜草的道地性研究指明了方向。

本研究檢測(cè)的10 個(gè)成分新橙皮苷、山柰酚、茜草素、異茜草素、羥基茜草素、1,3,6-三羥基-2-甲基蒽醌、大葉茜草素、去氫-α-拉杷醌、β-谷甾醇和異落葉松脂素涵蓋了黃酮類、蒽醌類、甾體類和木脂素類，方法便捷、準(zhǔn)確，易于推廣，可以更全面、更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)茜草的質(zhì)量，為茜草藥材的綜合評(píng)價(jià)、產(chǎn)地道地性評(píng)價(jià)提供了參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突