陳銘秋，劉果，林彥，黃安瀛，翟江博，羅建中

木本植物組織培養(yǎng)及器官從頭再生的研究進(jìn)展

陳銘秋1，劉果2，林彥2，黃安瀛2，翟江博2，羅建中2*

（1. 西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院速生樹木研究所，廣東 湛江 524300）

組織培養(yǎng)技術(shù)是研究木本植物再生和繁殖的一種重要手段。文章總結(jié)了木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)及器官再生的分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展，明確了木本植物再生體系的建立與內(nèi)因（外植體基因型、生理狀態(tài)等）和外因（植物激素、培養(yǎng)條件等）密切相關(guān)?；虮磉_(dá)、激素信號途徑和其他信號通路在木本植物器官從頭再生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。不定芽和生根誘導(dǎo)困難是木本植物再生的瓶頸，未來應(yīng)進(jìn)一步深入研究木本植物再生的調(diào)控機(jī)制，以提高木本植物的再生效率和質(zhì)量。

木本植物；組織培養(yǎng)；器官發(fā)生；調(diào)控機(jī)制

自20世紀(jì)初首次提出“植物細(xì)胞全能性”的概念以來，植物再生一直是主要的研究重點(diǎn)[1]。植物再生是指植物的組織或器官在受損或受到脅迫后，自我修復(fù)或長出新的器官的過程[2]。植物細(xì)胞的全能性和多能性是植物再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[1]，如植物干細(xì)胞、單細(xì)胞受精卵或去分化的植物體細(xì)胞具有全能性，具有分化成完整植株的能力[3]；多能性則是細(xì)胞能夠分化成為特定類群組織或細(xì)胞的能力[4]。木本植物再生的方法包括組織培養(yǎng)、嫁接、扦插等，其中組織培養(yǎng)是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。組織培養(yǎng)簡稱“組培”，是指在規(guī)定的物理和化學(xué)條件下，對植物的細(xì)胞、組織或器官等進(jìn)行體外無菌培養(yǎng)[5]，具有高效、繁殖系數(shù)高和保持優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)。

木本植物為高度雜合的植物，自交和回交使得其很難在特定的遺傳背景中固定理想的等位基因，極大地限制了傳統(tǒng)林木育種方法的使用，延長了育種周期。組培技術(shù)使品種得以改良并縮短育種周期，是瀕危樹種繁殖及種質(zhì)資源保護(hù)的重要手段之一[6]，組培不同階段的機(jī)理調(diào)控研究對于提高木本植物再生率和利用率至關(guān)重要。為此，文章總結(jié)了木本植物組培技術(shù)的研究進(jìn)展，以期為木本植物組培技術(shù)提供理論參考。

1 影響木本植物組織培養(yǎng)的相關(guān)因素

影響木本植物組織培養(yǎng)的因素包括外植體、培養(yǎng)基的組成成分和培養(yǎng)條件。其中，外植體的取材部位、生理狀態(tài)和發(fā)育階段、采集時(shí)間以及滅菌程度等都與組培成功與否密切相關(guān)；培養(yǎng)基中的礦物鹽、糖、維生素、鐵鹽、激素和有機(jī)附加物均會對植物組培過程產(chǎn)生一定影響；溫度、光照、氣體狀況和滲透壓等培養(yǎng)條件也是植物組織培養(yǎng)成功的重要因素。

1.1 外植體

木本植物再生體系的建立與外植體關(guān)系密切，植物不同部位的器官、組織以及細(xì)胞都可作為離體再生實(shí)驗(yàn)的外植體來源[7]。不同植物有不同的基因型和生態(tài)型，外植體的不同取材部位、生理狀態(tài)和發(fā)育階段、不同取材時(shí)間以及不同滅菌等都具有不同的再生效率。

1.1.1 外植體的取材部位

誘導(dǎo)器官發(fā)生的木本植物外植體的選擇非常廣泛，不同樹種、不同部位的外植體在組織培養(yǎng)中具有不同的再生潛力，取材部位的不同對再生體系的建立影響重大。以桉樹（spp.）為例，半木質(zhì)化的莖段和種子是最為常用的外植體材料，葉片、木質(zhì)塊莖、節(jié)間、下胚軸及子葉、莖節(jié)、嫩枝段等不同器官，均能誘導(dǎo)出完整植株。例如，利用尾巨桉（×）無性系A(chǔ)EC224的葉片建立間接器官再生體系，再生率可達(dá)43%[8]；利用鄧恩桉（）腋芽作為外植體進(jìn)行組培研究，發(fā)現(xiàn)不同位置腋芽的萌芽率、褐化率和污染率均存在差異[9]。對鄧恩桉下胚軸的遠(yuǎn)端、近端和子葉的器官發(fā)生能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)下胚軸的遠(yuǎn)端具有更強(qiáng)的再生能力[10]；利用赤桉（）不同生長時(shí)期的子葉作為外植體進(jìn)行組培，發(fā)現(xiàn)越幼嫩的子葉產(chǎn)生愈傷組織體胚的潛力越大[11]。

此外，根據(jù)不同組織培養(yǎng)的目的和需求，選擇外植體的類型也不相同。例如，無性系的微繁殖是為了大量生產(chǎn)商品苗，需選擇具有較大再生效率的外植體類型；需生產(chǎn)大量次生代謝產(chǎn)物，選擇根尖作為外植體較合適；以獲得脫毒植株為目標(biāo)，選擇莖尖分生組織作為外植體的效果最佳[12]。

1.1.2 外植體的不同生理狀態(tài)和發(fā)育階段

外植體的幼化程度、發(fā)育階段及母樹年齡直接影響組織培養(yǎng)的成功率。一般認(rèn)為，根莖結(jié)合點(diǎn)是樹木個(gè)體最年輕的部位，成熟度隨離根莖結(jié)合點(diǎn)距離增加而增加[13]，因此木本植物常用伐樁萌芽枝條或基部環(huán)割的半木質(zhì)化枝條作為外植體材料。研究表明，下胚軸外植體中的愈傷組織再生區(qū)域?yàn)楫a(chǎn)生芽和芽的多能干細(xì)胞的發(fā)育重新創(chuàng)造了適當(dāng)?shù)纳鷳B(tài)位，越幼嫩、年限越短的組織器官通常具有更高的形態(tài)發(fā)生能力[14]。輻射松（）未成熟針葉的再生能力強(qiáng)于成熟真葉，這與未成熟的針葉中含有高表達(dá)水平的和相關(guān)[15]。研究表明，外植體的發(fā)育年齡極大地影響外植體的再生效率。如火炬松（）[16]、海岸紅杉（）[17]和板栗（）[18]的幼年期的形態(tài)發(fā)生能力更高，小葉紫檀（）[19]未成熟組織（合子胚、花瓣、子房和花藥）的再生效率更高。對毛白楊（）無性繁殖材料老化與復(fù)壯的研究表明，200年生毛白楊比30年生毛白楊的根萌條外植體組培成活率低29%[20]。由此可見，更幼嫩的外植體材料擁有更高的再生潛能。

1.1.3 外植體的取材時(shí)間

多年生木本植物一般具有明顯的生長期和休眠期，外植體采集的季節(jié)對木本植物的再生具有一定影響[9]。一般情況下，外植體材料的采集時(shí)間以春、秋季為佳，溫室條件下則四季皆可。由于夏季高溫多雨，外植體附著的雜菌多，外植體的滅菌不易徹底；而冬季木本植物代謝活性變慢、生理狀態(tài)變差、內(nèi)生菌容易滋生，從而導(dǎo)致外植體的污染率增加[21]。研究表明，鄧恩桉在春季取材所獲得的再生效率最高，且褐化率和污染率最低[9]。

外植體切割時(shí)間是植株再生的關(guān)鍵因素，待切割的外植體組織僅在短時(shí)間內(nèi)處于反應(yīng)性發(fā)育階段[22]。例如，北美白橡（）[23]的葉外植體被切割后僅有2 ～ 3 d的發(fā)育窗口期能形成體細(xì)胞胚；歐洲落葉松（）[24]的芽外植體僅有兩個(gè)短暫的形態(tài)發(fā)生峰，一個(gè)在芽斷裂前，另一個(gè)在夏末。

1.1.4 外植體的滅菌

外植體滅菌是木本植物再生體系建立的關(guān)鍵步驟，滅菌不成功會導(dǎo)致外植體污染，無法進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)步驟；滅菌過度，外植體會被試劑傷害導(dǎo)致細(xì)胞喪失活力后死亡。恰當(dāng)?shù)臏缇椒梢钥刂茰缇鷦ν庵搀w的傷害，并滅菌徹底。目前外植體滅菌已取得一定研究成果，主要集中在滅菌方法的優(yōu)化、滅菌時(shí)間、滅菌試劑對外植體的生長和發(fā)育的影響以及滅菌后外植體的誘導(dǎo)和繁殖四個(gè)方面，外植體的滅菌試劑和濃度、滅菌時(shí)間和流程的選擇應(yīng)根據(jù)外植體的類型、發(fā)育階段和生理狀態(tài)來調(diào)整。

木本植物組培中外植體常用的消毒試劑有酒精、氯化汞和次氯酸鹽[25]。例如，皺果桉（）[26]的種子、烏頭木（）[21]的帶芽莖段和茶樹（）[27]幼嫩莖段新梢的滅菌均使用70% ～ 75%酒精和0.1%的氯化汞。研究表明，木本植物的滅菌方式主要是以表面滅菌為主，外植體采用酒精和升汞進(jìn)行交叉滅菌效果較優(yōu)[28]。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中含有植物生存所需的各種營養(yǎng)，如礦物鹽、糖類、維生素、生長調(diào)節(jié)劑和有機(jī)附加物等。培養(yǎng)基的狀態(tài)、所含的各礦物鹽元素占比、植物激素種類和比例都是組培成功的關(guān)鍵。MS培養(yǎng)基含有高濃度的氮（N）、鉀（K）等無機(jī)鹽，其營養(yǎng)元素比例較合適，不僅可以滿足植物快速生長所需的營養(yǎng)條件，還可以根據(jù)培養(yǎng)需求進(jìn)行改良[29]，目前被廣泛使用。例如，茶樹[27-28]、桉樹[9,25]和楊樹[20]等大多木本植物在愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)及增殖階段一般采用全量MS培養(yǎng)基，生根階段使用半量MS培養(yǎng)基。CIM愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基、SIM芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基等也都是常用培養(yǎng)基。在器官組織培養(yǎng)中，常采用固體培養(yǎng)基；而原生質(zhì)體和細(xì)胞培養(yǎng)中，采用液體培養(yǎng)基可更好地促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)與發(fā)育[30]。

1.2.1 礦物鹽

培養(yǎng)基中的礦物鹽濃度對過度愈傷組織形成、外植體褐變和試管苗玻璃化均有一定程度影響[31]。通過對鄧恩桉缺乏各礦物元素的研究發(fā)現(xiàn)，缺鐵（Fe）導(dǎo)致葉片萎黃，缺N導(dǎo)致葉片發(fā)黃掉落并伴隨莖尖壞死，錳（Mn）與K、鋅（Zn）具有拮抗作用[32]。大量元素在尾巨桉無性系DH32-29組培苗的生根過程中具有一定影響，硝酸鉀對根條數(shù)、根長、莖高起主效應(yīng)作用[33]。氮源是蛋白質(zhì)、核酸和葉綠素的成分，對植物生命至關(guān)重要，NO3?在一定程度上會影響植物的生長質(zhì)量[34]。培養(yǎng)基中的鹽濃度也需要控制在合適范圍內(nèi)，過高會引起酚類物質(zhì)大量產(chǎn)生從而導(dǎo)致外植體褐化；而提高Ca2+濃度，增加Mn、K、磷（P）、Fe、銅（Cu）元素的含量，降低N和氯（Cl）元素比例，可以降低玻璃化[9]。

1.2.2 糖類

體外植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)物不能完全自養(yǎng)，需要在培養(yǎng)基中攝入碳水化合物來維持滲透勢，而培養(yǎng)基中的糖類可以提供能量和碳源[35]。不同物種、不同階段所需碳源種類和濃度不盡相同。蔗糖屬于非還原性二糖，一般不能被微生物直接利用，且具有一定抑菌效果，是木本植物組培培養(yǎng)基的常用碳源[36]。在不定芽繼代增殖階段的培養(yǎng)中添加蔗糖的效果優(yōu)于果糖，而在生根階段添加果糖比葡萄糖和蔗糖具有更好的促進(jìn)效果[37]。在歐洲李子（）和日本李子（）的組培研究中發(fā)現(xiàn)蔗糖顯著促進(jìn)了枝和葉的生長，以3%的蔗糖濃度培養(yǎng)效果最優(yōu)[38]；在枸杞（）的組培中，蔗糖是莖段愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的關(guān)鍵因子，以4%蔗糖的無植物激素培養(yǎng)基上器官發(fā)生的效果最好[39]；碳源作為營養(yǎng)因子在核桃（spp.）的生根培養(yǎng)中起著關(guān)鍵作用[40]。

1.2.3 維生素

維生素具有維持細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì)，是大多數(shù)植物組織培養(yǎng)基的重要組成成分，在細(xì)胞代謝中起調(diào)節(jié)及控制作用[41]。維生素C是一種重要的抗氧化劑，能夠保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化應(yīng)激傷害。

例如，在歐洲丁香（）[42]、梨（spp.）[43]的組織培養(yǎng)過程中，添加低濃度的維生素C可以有效避免和緩解褐化現(xiàn)象；在黃樟（）[44]的組培培養(yǎng)基中添加維生素C和維生素B2可有效控制褐化的發(fā)生。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對培養(yǎng)效果有重要影響。例如，6-芐氨基嘌呤（6-BA）對細(xì)葉桉（）[45]芽增殖和芽伸長均可取得良好效果；在蘋果（）[46]和梨[47]等木本植物的繼代培養(yǎng)中效果較理想；以1-萘乙酸（NAA）濃度為2 mg·L?1對赤桉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，在含有1 mg·L?1的6-BA和0.1 mg·L?1的NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)可獲得最佳效果[48]。

生長素對培養(yǎng)生根十分關(guān)鍵，它能刺激細(xì)胞的分裂，使特定的靜止細(xì)胞重新進(jìn)入分裂狀態(tài)，再生主要是生長素在損傷部位附近快速積累引起的[49]。次級代謝尤其是酚類化合物也與生長素有關(guān)，如在蘋果微芽上切下的莖片中發(fā)現(xiàn)生長素能誘導(dǎo)二酚和多酚化合物，促進(jìn)不定根的形成[50]。對于難以生根的木本樹種，優(yōu)化處理和多種外源激素的添加是生根的先決條件。杜曉艷[51]研究發(fā)現(xiàn)添加3-吲哚乙酸（IBA）的培養(yǎng)基可使青海青楊（）組培苗生根率達(dá)100%；在生根困難的巨桉（）組培中，添加NAA可以促進(jìn)生根，以MS+0.4 mg·L?1NAA為培養(yǎng)基時(shí)生根率最高（65.47%）[52]。

1.3 培養(yǎng)條件

1.3.1 溫度

溫度是影響植物生長發(fā)育速度的主要因素。培養(yǎng)溫度過高會使植物產(chǎn)生熱應(yīng)激反應(yīng)，破壞葉綠體內(nèi)類囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能，降低葉綠素含量，使光合作用減弱，導(dǎo)致組培苗玻璃化[53]；培養(yǎng)溫度低于15 ℃會導(dǎo)致組培苗生長緩慢甚至死亡[54]。不同的培養(yǎng)階段需要的培養(yǎng)溫度也不同，例如，歐洲黑楊（）N46分化最佳的誘導(dǎo)溫度為27 ℃，最佳生根溫度為25 ℃[55]。溫度還可通過影響吸水率和營養(yǎng)代謝以及促進(jìn)或抑制酶促作用來影響不定根的生長[56]。大部分的木本植物如桉樹[9]、楊樹[56]、茶樹[29]等的組培溫度以25 ℃左右為宜。

1.3.2 光照

適宜的光照可以延長愈傷組織的保存期。光照過強(qiáng)會導(dǎo)致植株體內(nèi)多酚氧化酶活性增加從而導(dǎo)致組培苗褐化[57]；光照不足容易導(dǎo)致組培苗玻璃化和生長緩慢。光周期、光質(zhì)都會影響植物細(xì)胞、組織和器官的形態(tài)發(fā)生和生長[58-59]。杉木（）組培的光周期設(shè)置為16 h時(shí)，其組培苗株高、生根率、根數(shù)較高且幼苗根系更長[60]。張亞如等[59]研究發(fā)現(xiàn)單色藍(lán)光可促進(jìn)桉樹生根誘導(dǎo)，單色紅光可促進(jìn)組培苗的莖葉生長；XU等[60]研究發(fā)現(xiàn)紅藍(lán)紫復(fù)合光可以促進(jìn)杉木組培苗的幼苗生長。光質(zhì)的選擇可以根據(jù)培養(yǎng)目的和植物需求進(jìn)行改變，而一定的暗培養(yǎng)對于組培植物生長也具有一定的促進(jìn)作用。張廣輝等[61]研究發(fā)現(xiàn)暗培養(yǎng)能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)并獲得更大體積的愈傷組織。亮果桉（）下胚軸外植體在黑暗中培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)移到高光照強(qiáng)度下，再生率最高可達(dá)40% ± 5.8%[62]；尾巨桉無性系的愈傷組織暗培養(yǎng)30 d后，芽誘導(dǎo)的效率更高[8]。

1.3.3 氣體狀況

為保護(hù)無菌培養(yǎng)物免受污染，防止植物和培養(yǎng)基干燥，組織培養(yǎng)一般在封閉的容器中進(jìn)行，這限制了容器中的氣體和外部空氣之間的交換[63]。影響氣體積累的最重要因素包括植物材料的類型和數(shù)量、容器的密封性及容量、培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件等。雜交白楊（×）[64]外植體在密封培養(yǎng)管中誘導(dǎo)的芽在生長量上優(yōu)于未密封的培養(yǎng)管。培養(yǎng)容器中的氣體組成一般為氧氣（O2）、二氧化碳（CO2）和乙烯（C2H4），密封容器可能會導(dǎo)致CO2濃度過高，高濃度的CO2對組培苗有毒性，從而導(dǎo)致組培苗生長緩慢，但一定濃度的CO2可以作為乙烯抑制劑，從而有助于組培苗的生長，因?yàn)橐蚁ㄟ^氣孔閉合機(jī)制誘導(dǎo)組培苗玻璃化[65]。研究表明，2%以下濃度的CO2有益于輻射松（）組培苗的生長[66]。乙烯由組培苗和培養(yǎng)基中的瓊脂產(chǎn)生，與瓊脂的濃度有關(guān)。添加乙烯抑制劑可以有效促進(jìn)組培苗的生長，硫代硫酸銀（STS）或氨基乙氧基乙烯甘氨酸（AVG）等乙烯抑制劑的使用已被證明可以增加杏（）葉的再生率[67]；在石榴（）外植體培養(yǎng)基中添加乙烯抑制劑AgNO3和AVG可以有效提高再生效率并獲得更多的不定芽[68]。

1.3.4 滲透壓

培養(yǎng)基中碳水化合物的濃度會與組織培養(yǎng)中的外植體、愈傷組織或幼苗產(chǎn)生滲透勢，只有平衡的滲透勢才能使植物組培體系成功建立[69]。在白楊（）外植體培養(yǎng)基中添加不同濃度的山梨醇和甘露醇可以造成白楊愈傷組織不同水平的滲透應(yīng)激反應(yīng)[69]。使用滲透調(diào)節(jié)劑如聚乙二醇（PEG），可使?jié)B透壓達(dá)到一定程度，從而促進(jìn)外植體的繁殖潛能。例如，大麻（）花藥在15%蔗糖濃度的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移到6%蔗糖濃度的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)的不定芽數(shù)明顯增多[70]。

2 器官從頭再生

植物組織培養(yǎng)通過器官從頭再生途徑實(shí)現(xiàn)[71]，而木本植物器官的從頭發(fā)生決定了再生植株的完整性，涉及復(fù)雜的生理生化變化過程，其調(diào)控機(jī)制包括DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞的分化與脫分化、氮同化和氨基酸代謝、碳水化合物的代謝和利用、內(nèi)源激素與外源激素信號的應(yīng)答與平衡調(diào)控[72]。

2.1 愈傷組織

生長素與細(xì)胞分裂素相互作用，從而產(chǎn)生無組織細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）[73]。在細(xì)胞水平上，愈傷組織由一組異質(zhì)細(xì)胞組成，類似于根原基或根尖分生組織[62]，起源于各外植體的中柱鞘細(xì)胞。愈傷組織分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織，胚性愈傷組織的形成是間接型體細(xì)胞胚發(fā)生途徑的基礎(chǔ)，具有再生成完整植株的能力[74]；非胚性愈傷組織的形成是間接型器官發(fā)生途徑的重要階段[75]。在波絲斯桉（）中，首次發(fā)現(xiàn)40%的愈傷組織是木質(zhì)部樣細(xì)胞，并且在培養(yǎng)過程中愈傷組織中的木質(zhì)素含量逐漸增加[76]。

內(nèi)源性細(xì)胞分裂素和生長素激素信號相互作用在愈傷組織的形成過程中起到了關(guān)鍵作用[77]。生長素激活（）和的表達(dá)，誘導(dǎo)（）和的表達(dá)[78]；、、和作用于生長素，響應(yīng)（）和的表達(dá)，并調(diào)控（）轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)細(xì)胞分裂誘導(dǎo)愈傷組織的形成[79]。

2.2 芽的從頭再生

芽的從頭再生可以直接從莖段未萌出的腋芽產(chǎn)生，也可以由非胚性愈傷組織產(chǎn)生間接的器官再生。木本植物芽的從頭再生是經(jīng)外源性應(yīng)激刺激（如損傷和外源激素等）誘導(dǎo)[80]、由植物激素動態(tài)積累和合成水平與外部培養(yǎng)條件交叉作用發(fā)生的，受到多個(gè)不同效應(yīng)量的數(shù)量性狀位點(diǎn)控制[81]，如細(xì)胞命運(yùn)決定因子、表觀遺傳調(diào)控因子等。

芽從頭再生大致可以分為4步，包括：多能性獲得、芽前分生組織形成、限定芽祖細(xì)胞的建立和芽長出[71]。

2.2.1 多能性的獲得

新長出來的芽是直接或間接來源于臨近木質(zhì)部的中柱鞘細(xì)胞，間接從愈傷組織誘導(dǎo)芽從頭再生的形成過程與側(cè)根分生組織的形成過程類似[82]。、（），，（）和等均在此過程中表達(dá)[82]。、和在維持愈傷組織的多能性中起到關(guān)鍵性作用[83]。在楊樹雜交無性系84K（×）中，響應(yīng)創(chuàng)傷被誘導(dǎo)，在愈傷組織中表達(dá)，還能激活和的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞多能性的產(chǎn)生[84]。

2.2.2 芽前分生組織形成和限定芽祖細(xì)胞的建立

CUP-SHAPED COTYLEDON（CUC）蛋白是芽原生系統(tǒng)建立所必需的，芽原生系統(tǒng)在愈傷組織中產(chǎn)生局限的芽祖細(xì)胞[82]，和參與了植物莖部分生組織的維持[85]。莖尖分生組織包含植物整個(gè)生命周期中葉片、花分生組織和莖生長所需的多能干細(xì)胞庫。研究表明，（）基因能使鄰近細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，與芽祖細(xì)胞的形成密切相關(guān)，且基因僅存在于SAM靜止中心中[86]；同時(shí)，表達(dá)水平的表觀遺傳控制與新生芽再生發(fā)育率之間具有顯著相關(guān)性[87]。移動到中心區(qū)并激活（），是芽分生組織發(fā)育的特異性調(diào)節(jié)因子，表達(dá)系統(tǒng)形成一個(gè)核心調(diào)節(jié)環(huán)，可以協(xié)調(diào)芽尖分生組織中的增殖并保持干細(xì)胞數(shù)量恒定[88]。在分生組織中表達(dá)的（）基因使SAM細(xì)胞維持未分化形式并促進(jìn)細(xì)胞分裂[89]。

2.3 不定根的從頭再生

不定根是指從植物莖或葉等非中柱鞘組織產(chǎn)生的根[90]。大部分木本植物不定根的從頭再生依賴于外源激素的誘導(dǎo)，乙烯可以正向調(diào)節(jié)不定根的形成，植物受到損傷后（）能直接激活（）的表達(dá)，基因是內(nèi)源生長素產(chǎn)生途徑中的色氨酸生物合成基因，同時(shí)其他生長素合成基因、和等共同產(chǎn)生內(nèi)源生長素[91]，生長素在傷口積累激活，和可直接激活和[92]，的表達(dá)是細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變的第一步[93]。研究發(fā)現(xiàn)，損傷通過茉莉酸和生長素信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)紅楓（）根系再生，和通過調(diào)控SCARECROW的活性，通過合成生長素間接參與根的從頭再生[94]。

研究表明，基因家族在植物生根的關(guān)鍵時(shí)期起重要調(diào)控作用?；蚩梢哉{(diào)控楊樹不定根的發(fā)育，在毛白楊的不定根尖端和側(cè)根尖端特異性表達(dá)；表型互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，可以在靜止中心細(xì)胞中對進(jìn)行功能互補(bǔ)[95]；84K楊中基因在主根和側(cè)根中的表達(dá)量很高，且在韌皮部及形成層中也有較高的表達(dá)量，該基因可能參與根系、韌皮部及分生組織發(fā)育的調(diào)控[96]；核桃中的基因轉(zhuǎn)到楊樹中，過表達(dá)基因增加了楊樹的根毛長度和不定根數(shù)，推測基因可能調(diào)節(jié)根系發(fā)育與生長[97]。

3 木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)難點(diǎn)及局限

3.1 外植體滅菌問題

外植體外部攜帶灰塵及微生物且有內(nèi)生菌，需要滅菌徹底但不能損傷植物細(xì)胞，因此外植體滅菌成功是組培的第一步。需根據(jù)木本植物物種、外植體的生理狀態(tài)和部位等因素全面考慮，選擇合適的滅菌試劑、滅菌流程和時(shí)間等，以獲得良好的滅菌效果。

3.2 外植體和愈傷組織的褐化問題

外植體褐化分為酶促褐化和非酶促褐化兩種。其中，酶促褐化普遍存在于木本植物的組織培養(yǎng)中。一般情況下，選擇對培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化以緩解褐化。如在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑維生素C、活性炭、半胱氨酸或聚乙烯吡絡(luò)烷酮（PVP），添加激素6-BA、IAA和GA等[98]控制培養(yǎng)基中無機(jī)鹽Cu2+和Mn2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蔗糖濃度、pH值在合適范圍[30]。研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)蜏乜梢砸种品宇惢衔锏暮铣?，降低多酚氧化酶的活性，從而減輕褐變[99]。另外，控制繼代周期[100]、選擇幼嫩外植體[101]以及進(jìn)行一定的暗培養(yǎng)[56]均可減少外植體和愈傷組織的酶促褐化。針對非酶促褐化，則需要控制外植體消毒時(shí)試劑對外植體植物細(xì)胞的傷害。

3.3 組培苗的玻璃化問題

玻璃化是指組培苗的莖和葉成透明水漬狀，生長畸形，難以誘導(dǎo)生根[98]，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致死亡，常見于組織培養(yǎng)過程中的不定芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)階段。這是由于玻璃苗的細(xì)胞壁發(fā)育差、細(xì)胞質(zhì)膜透性改變、蛋白質(zhì)合成能力和光合作用能力低下導(dǎo)致的[9]?？刂婆囵B(yǎng)基中的無機(jī)鹽濃度、提高Ca2+濃度和增加Mn、K、P、Fe、Cu元素的含量及降低N和Cl元素比例，可以降低玻璃化程度[9]；合適的瓊脂濃度、半木質(zhì)化莖段[102]、適宜的溫度[52]和光照[103]可避免或降低玻璃化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，在泡桐（）的組織培養(yǎng)中，添加不同比例的激素優(yōu)化培養(yǎng)基能一定程度上逆轉(zhuǎn)玻璃化[103]；在MS培養(yǎng)基中補(bǔ)充多胺，使用合適的培養(yǎng)容器降低乙烯濃度亦可以降低玻璃化的發(fā)生率[64]。

3.4 木本植物組培苗生根困難

木本植物組培苗生根是組織培養(yǎng)植株再生體系建設(shè)和快繁技術(shù)的瓶頸。毛白楊[104]、部分梓屬（spp.）植物[105]和部分桉樹[106]的無性繁殖均存在不定根生根困難和生根緩慢等難題。不定根發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，受年齡、脅迫條件、環(huán)境因素、遺傳性狀、礦物質(zhì)營養(yǎng)和植物激素等的影響[106-107]。

3.5 無性系繁殖過程中的遺傳變異與品種退化

在組織培養(yǎng)過程中可能會產(chǎn)生一定的遺傳變異性，即由于基因突變或表觀遺傳標(biāo)記的變化而導(dǎo)致的體克隆變異，這種變異可能會導(dǎo)致遺傳保真度的喪失[108]。組織培養(yǎng)中造成突變的觸發(fā)因素有植物基因型、脅迫、外植體類型、傳代培養(yǎng)時(shí)間和次數(shù)、植物生長調(diào)節(jié)劑等[109]。其中，植物基因型是導(dǎo)致遺傳變異最重要的決定因素，決定變異的類型和頻率，這些變異如果可以被穩(wěn)定遺傳，則可以作為育種的補(bǔ)充部分[110]。

在組培過程中，氧化應(yīng)激損傷也能導(dǎo)致遺傳變異[111]，氧化應(yīng)激導(dǎo)致促氧化劑或活性氧（ROS）水平升高。ROS可能涉及DNA的高甲基化和低甲基化改變，使染色體數(shù)量從多倍體到非整倍體變化，染色體鏈斷裂、染色體重排以及DNA堿基缺失和替換，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞突變[112]。因此，選擇腋芽或者芽尖這類非高度分化的組織[113]、在器官再生培養(yǎng)階段盡量選擇直接再生途徑[114]、控制傳代次數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間[111]、選擇合適的植物激素及濃度，這些方法均能在一定程度上減小氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低變異率。

4 展望

木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖周期短、繁殖系數(shù)高、能在有限的空間和時(shí)間內(nèi)培育無性系良種的優(yōu)點(diǎn)，通過與基因工程相結(jié)合，能培育出抗逆性更強(qiáng)的優(yōu)良無性系品種，對于擴(kuò)大森林潛能、提高森林生產(chǎn)力、緩解木材資源匱乏等具有重要推動作用。同時(shí)，木本植物組織培養(yǎng)也為遺傳轉(zhuǎn)化、基因編輯等提供了豐富的研究材料，但目前還缺少對組織培養(yǎng)的不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根這三個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞學(xué)、生理生化水平、形態(tài)學(xué)、代謝組和表觀遺傳學(xué)等方面全面而深入的研究，各種次生代謝物在木本植物組培中的作用研究也較少。

由于木本植物生長周期較長且次生代謝物較多，生命活動更復(fù)雜，建立再生體系困難且組培技術(shù)普適性差，完全解析木本植物器官從頭再生的分子調(diào)控機(jī)制仍然困難。未來可以通過識別關(guān)鍵調(diào)控基因和調(diào)控元件，豐富理論知識，為實(shí)現(xiàn)特定性狀的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)，縮短木本植物組織培養(yǎng)體系建立時(shí)間，提高良種培育的效率，最大程度發(fā)揮林木的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

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Research Progress in Tissue Culture and Organ de Novo Regeneration of Woody Plants

CHEN Mingqiu1, LIU Guo2, LIN Yan2, HUANG Anying2, ZHAI Jiangbo2, LUO Jianzhong2*

(1. Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China; 2. Research Institute of Fast-growing Trees, Chinese Academy of Forestry, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

Tissue culture technology is an important means for the regeneration and reproduction of woody plants. This paper summarizes the research progress of tissue culture technology and molecular regulation mechanism of organ regeneration in woody plants. This scrutiny of research progress has made it clear that establishment of regeneration systems for woody plants is closely related to internal factors (explant genotypes, physiological states, etc.) and external factors (plant hormones, culture conditions, etc.). Gene expression, hormone signaling pathways and other signaling pathways play key regulatory roles in the process of de novo regeneration of woody plant organs. The difficulty in inducing adventitious buds and roots can be a bottleneck in the regeneration of woody plants. In the future, regulatory mechanism of regeneration of woody plants should be further studied to improve the regeneration efficiency and quality of woody plants.

woody plant; tissue culture; organogenesis; regulatory mechanism

10.13987/j.cnki.askj.2023.04.012

Q813.1+2

A

“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2022YFD2200203-3）；廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2023KJCX012）

陳銘秋（1997— ），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)殍駱潆s交育種。E-mail:1596299123@163.com

羅建中（1969— ），男，博士，研究員，從事桉樹種質(zhì)資源評價(jià)、群體改良及雜交育種研究。E-mail:luojz69@hotmail.com