孟 鴿，張同鋒，尚佳靜，張永英，羅 娟 ，封瑩潔 ，于曉慧，蔣文明，劉華雷，劉冠慧，李 陽(yáng)

（1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056038；2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；3.山東省鄆城縣行政審批服務(wù)局，山東鄆城 274700）

禽腺病毒（fowl aviadenovirus，F(xiàn)AdV）為無(wú)囊膜的雙股DNA 病毒，直徑70～90 nm，呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，病毒粒子衣殼主要由六鄰體（Hexon）蛋白、五鄰體（Penton）蛋白和纖維（Fiber）蛋白組成。Hexon 蛋白上的7 個(gè)高度變異區(qū)是區(qū)分不同F(xiàn)AdV 血清型的重要區(qū)域；Fiber 蛋白上有1 個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)，其在病毒侵入宿主細(xì)胞時(shí)起重要作用[1]。FAdV 根據(jù)其基因結(jié)構(gòu)與序列長(zhǎng)短分為3 個(gè)群：Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群。Ⅰ群屬于禽腺病毒屬，Ⅱ群屬于唾液酸酶腺病毒屬，Ⅲ群屬于胸腺病毒屬。Ⅰ群FAdV 根據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶消化模式的不同又可分為FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D、FAdV-E 等5 個(gè)種，也可以通過(guò)血清交叉中和試驗(yàn)分為1～7、8a、8b、9～11 等12 種血清型[2]。FAdV-A 對(duì)應(yīng)血清型1 型，F(xiàn)AdV-B 對(duì)應(yīng)血清型5 型，F(xiàn)AdV-C 對(duì)應(yīng)血清型4 和10 型，F(xiàn)AdV-D 對(duì)應(yīng)血清型2、3、9 和11 型，F(xiàn)AdV-E 對(duì)應(yīng)血清6、7、8a 和8b 型。Kiss 等[3]對(duì)365 株FAdV 分離株的部分聚合酶基因核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-A、FAdV-D、FAdV-E 占比最高，分別為11%、34%、50%。Wang 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，10%的FAdV 分離株與肝炎-心包積液綜合征（hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS）相關(guān)。

HHS 主要由FAdV 血清4 型（FAdV-4）引起，對(duì)未接種疫苗的禽類(lèi)具有較高的致死性，病死率高達(dá)80%[5]。1987 年HHS 首次被發(fā)現(xiàn)，此后在印度、加拿大、匈牙利、日本、韓國(guó)及波蘭等國(guó)家陸續(xù)暴發(fā)[6]。自2015 年起，我國(guó)山東、湖北、江蘇、安徽、江西和河北等省份均有由FAdV-4 引起的HHS 疫情的報(bào)告[7-8]。以上流行數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)AdV-4 引起的HHS 呈現(xiàn)世界范圍流行趨勢(shì)，嚴(yán)重危害全球家禽養(yǎng)殖業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)FAdV-4 感染的診斷及防控顯得尤為重要。本文綜述了國(guó)內(nèi)外FAdV-4 的血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展，以期為FAdV感染的防控提供技術(shù)參考。

1 血清學(xué)檢測(cè)方法

1.1 病毒中和試驗(yàn)（VNT）

VNT 是指病毒與待測(cè)血清混合、孵育后，接種給易感宿主或細(xì)胞，通過(guò)觀察病毒感染情況，即觀察中和后病毒對(duì)宿主或細(xì)胞的感染力，對(duì)分離株進(jìn)行分析鑒定的方法[9]。VNT 被認(rèn)為是檢測(cè)FAdV的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有高度的敏感性和特異性，但其操作流程復(fù)雜，主要用于血清分型和血清抗體檢測(cè)[10]。Guo 等[11]利用表達(dá)EGFP-Fiber-2 融合蛋白的重組病毒FA4-EGFP，建立了一種新的檢測(cè)FAdV-4 特異性中和抗體的VNT 方法。該方法僅對(duì)FAdV-4 血清有反應(yīng)，并且對(duì)試驗(yàn)感染和臨床接種家禽的FAdV-4 抗體檢測(cè)均有效，與傳統(tǒng)的VNT比較具有良好的線性相關(guān)性。該方法簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序，將檢測(cè)時(shí)間由3～4 d 縮短至24 h，為監(jiān)測(cè)疫苗免疫狀態(tài)和診斷FAdV-4 的臨床感染提供了快速、有效且節(jié)約成本的方法。欒慶東等[12]成功表達(dá)了FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11 共4 種我國(guó)主要流行血清型的可溶性Fiber 蛋白，在細(xì)胞水平進(jìn)行了交叉VNT，發(fā)現(xiàn)4 種血清型間存在的交叉保護(hù)與病毒的Fiber 蛋白無(wú)關(guān)，這項(xiàng)研究結(jié)果為后續(xù)血清分型診斷方法的建立提供了理論依據(jù)。傅禹銘[13]利用VNT 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4 血清能夠中和FAdV-11 分離株，F(xiàn)AdV-8a 和FAdV-8b 不能相互交叉中和，F(xiàn)AdV-8b 血清能和FAdV-11 分離株產(chǎn)生中和，但交叉保護(hù)作用較弱，這項(xiàng)研究為后續(xù)疫苗研制提供了數(shù)據(jù)支持。

1.2 瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

AGP 通常是指雙向雙擴(kuò)散試驗(yàn)，是最早應(yīng)用于FAdV 檢測(cè)的經(jīng)典方法之一[14]。當(dāng)可溶性抗原（蛋白質(zhì)、多糖、結(jié)合蛋白等）與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂凝膠（瓊脂或瓊脂糖）內(nèi)由近及遠(yuǎn)不斷自由擴(kuò)散時(shí)可以形成一定的濃度梯度，在適當(dāng)比例相遇時(shí)可形成肉眼可見(jiàn)的沉淀線，由此來(lái)檢測(cè)抗體效價(jià)或抗原鑒定的一種技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單，所用儀器少，特異性較高，結(jié)果直觀容易判定[15]。張中秋等[16]和智海東等[17]利用FAdV -Ⅰ 制備瓊脂擴(kuò)散抗原，人工感染無(wú)特定病原體（SPF）雞胚，可檢測(cè)到沉淀抗體，表明研制的抗原可用于FAdV-Ⅰ檢測(cè)。但AGP 耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA 是基于抗原抗體特異性反應(yīng)而建立的血清學(xué)方法，是將抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單，特異性強(qiáng)，其靈敏度比常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)方法高得多，是最常用的血清學(xué)檢測(cè)方法，受到廣泛關(guān)注[18]。ELISA可分為間接ELISA（I-ELISA）、夾心ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)ELISA，根據(jù)檢測(cè)目的不同，又分為檢測(cè)抗原的ELISA 和檢測(cè)抗體的ELISA 方法。

我國(guó)由FAdV 感染引起的HHS 臨床病例有所增加[19]，因此開(kāi)發(fā)一種新的快速血清學(xué)檢測(cè)方法迫在眉睫。He 等[20]利用FAdV-4 JSJ13 株Fiber-2蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒作為包被抗原，建立了I-ELISA方法，并對(duì)450 份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未接種疫苗雞群的抗體陽(yáng)性檢出率低，而接種FAdV-4 疫苗的陽(yáng)性檢出率超過(guò)73.3%。該方法檢測(cè)FAdV-4 抗體準(zhǔn)確、靈敏，可用于FAdV-4 野外分離株的鑒定和分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。Pan 等[21]用高濃度的FAdV-4 病毒粒子作為包被抗原，開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)12 種FAdV Ⅰ群血清型的通用ELISA方法，其能夠區(qū)分FAdV Ⅰ群、FAdV Ⅲ群和其他病毒的抗體，且無(wú)交叉反應(yīng)，可作為FAdV Ⅰ群血清學(xué)調(diào)查和疫苗開(kāi)發(fā)的有力工具。Feichtener 等[22]開(kāi)發(fā)了針對(duì)所有血清型FAdV（1～7、8a、8b、9～11）重組蛋白的ELISA 方法，并對(duì)172 份樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其特異性為99.3%～100%，對(duì)接種FAdV-1、FAdV-4 疫苗的家禽血清進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其敏感性比VNT 更高。Shao 等[23]使用FAdV-4的Fiber-3 蛋白單克隆抗體4A3 和3C2，建立了一種基于單克隆抗體的夾心ELISA，此方法僅對(duì)FAdV-4 有反應(yīng)，對(duì)FAdV-4 蛋白和純化的GSTFiber2 蛋白的檢測(cè)限分別為1 000 TCID50/mL 和12.5 ng/mL。

為區(qū)分FAdV-4 自然感染動(dòng)物與免疫接種動(dòng)物，Xie 等[24]合成了FAdV-4 22k 非結(jié)構(gòu)蛋白66～88 aa 區(qū)對(duì)應(yīng)的免疫原性肽，并以該肽為包被抗原，建立了FAdV-4 特異性I-ELISA 方法，其與間接免疫熒光法和商用ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性分別為95%和85%，在檢測(cè)臨床感染樣本時(shí)，其與間接免疫熒光法的一致性為80.5%，能有效區(qū)分FAdV-4 感染雞和疫苗接種雞，為臨床樣品上FAdV-4 的檢測(cè)提供了一種高效的區(qū)分感染和疫苗接種的新技術(shù)。

1.4 間接免疫熒光技術(shù)（IFA）

IFA 又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是把抗原抗體反應(yīng)的敏感性和特異性同顯微形態(tài)學(xué)相結(jié)合的技術(shù)，既具有高度的免疫學(xué)特性和敏感性，又具有顯微形態(tài)學(xué)的精確性和直觀性，可用于免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)抗原性物質(zhì)的定位研究，也可用于檢測(cè)抗原或未知抗體，應(yīng)用十分廣泛。國(guó)紀(jì)壘等[25]通過(guò)制備FAdV-Ⅰ 12 個(gè)血清型的兔抗FAdV IgG，建立了IFA 方法，對(duì)感染雞的各組織器官進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該方法簡(jiǎn)單、快速、特異，是檢測(cè)FAdV-Ⅰ和抗原定位的良好方法。Feichitner 等[26]開(kāi)發(fā)了一種基于重組FAdV Fiber 蛋白的6 種血清型多重免疫熒光微球測(cè)定（fluorescent microsphere immunoassay，F(xiàn)MIA）方法，其能夠在高通量技術(shù)下同時(shí)檢測(cè)針對(duì)所有臨床相關(guān)血清型的抗體。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR 是一種用于擴(kuò)增特定DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，其最大特點(diǎn)是能將微量的DNA 進(jìn)行大量特異性擴(kuò)增。PCR 是檢測(cè)FAdV 的主要方法，具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可直接從臨床或環(huán)境樣品中檢測(cè)FAdV，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行處理。張夢(mèng)荷[27]通過(guò)構(gòu)建6 個(gè)重組質(zhì)粒建立了針對(duì)FAdV I 群PCR 檢測(cè)方法，其靈敏度高，可檢測(cè)出3.02×10-2ng/μL 的病毒DNA。Mase 等[28]建立了一種普通PCR 方法，其可同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分FAdV的主要血清型（1、2、4、8a 和8b）。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

qPCR 實(shí)現(xiàn)了從常規(guī)PCR 定性到定量的跨越，被廣泛用于多種病原體的檢測(cè)和定量，與常規(guī)PCR 相比，qPCR 具有敏感性高、特異性強(qiáng)，而且具有快速、高效、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需同PCR 一樣進(jìn)行后處理，避免了交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。Wang 等[29]根據(jù)FAdV-4 Hexon 蛋白編碼基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，建立了FAdV-4TaqMan 探針qPCR 方法，其檢測(cè)限為10 copies/μL，是傳統(tǒng)PCR 的10 倍，具有高度特異性，與其他11 種血清型FAdV 以及禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和禽白血病病毒等均無(wú)交叉反應(yīng)。盧清俠等[30]基于FAdV-4 的Hexon 蛋白編碼基因保守區(qū)建立了FAdV-4 SYBR Green ⅠqPCR 方法，其最低檢測(cè)限為7.1×102copies/μL，且與其他禽源病毒無(wú)交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均不超過(guò)2%，具有良好的特異性和重復(fù)性，可用于FAdV-4 臨床早期快速檢測(cè)。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）

LAMP 是一種簡(jiǎn)單、快速、特異的核酸篩選擴(kuò)增方法，無(wú)需借助復(fù)雜儀器，在恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增[31]。LAMP 檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，因而可通過(guò)濁度儀測(cè)量沉淀物產(chǎn)生的濁度或者在紫外光源下觀察反應(yīng)管中的LAMP 產(chǎn)物[32]。唐熠等[33]根據(jù)FAdV Ⅰ群Hexon蛋白編碼基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)LAMP 擴(kuò)增引物，建立了適用于FAdV Ⅰ群的LAMP 快速檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)10 copies/μL，操作簡(jiǎn)便、快速，特異性高。Yuan 等[34]建立了FAdV-4 LAMP 實(shí)時(shí)濁度法，其對(duì)FAdV-4 具有特異性，檢測(cè)下限為75 copies/μL，與qPCR 結(jié)果一致。Zhai 等[35]建立了用于快速檢測(cè)FAdV-4 的LAMP 與橫向流動(dòng)試紙條（LFD）相結(jié)合的方法，其與FAdV-7、FAdV-8b 以及雞馬立克氏病毒、傳染性法氏囊病毒等均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，最低檢測(cè)限為 10 copies/μL，靈敏度是普通PCR 的1 000 倍，比 qPCR 高10 倍，優(yōu)化后的LAMP-LFD 可在65 ℃下60 min 內(nèi)完成反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，無(wú)需有害試劑和精密儀器，可以應(yīng)用于資源有限的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。Fan等[36]針對(duì)雞細(xì)小病毒（ChPV）、雞傳染性貧血病毒（CIAV）和FAdV-4 研發(fā)了一種多重?zé)晒猸h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（mLAMP）技術(shù)。該方法特異性良好，對(duì)ChPV、CIAV 和FAdV-4 的最低檢測(cè)限分別為307、749 和648 copies/μL，可直接觀察到擴(kuò)增結(jié)果，可用于基層等試驗(yàn)設(shè)備有限的地區(qū)。

2.4 其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

隨著分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不斷應(yīng)用于核酸檢測(cè)領(lǐng)域。重組聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA） 是一種簡(jiǎn)單、先進(jìn)的DNA 擴(kuò)增方法[37]。RPA 可在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)病毒核酸的快速擴(kuò)增，通常在30 min 內(nèi)完成反應(yīng)[38]。研究[39-40]表明，RPA 反應(yīng)利用噬菌體衍生的重組酶與單鏈寡核苷酸引物結(jié)合，能夠在雙鏈DNA 中尋找同源序列，保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，發(fā)生鏈置換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA 合成，對(duì)模板上的靶標(biāo)進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。Zhang 等[41]研究出一種適用于檢測(cè)FAdV 12 種血清型的RPA 方法，該方法可在14 min 內(nèi)完成反應(yīng)，與qPCR 相比時(shí)間縮短了74.5%，病毒DNA 核酸的陽(yáng)性檢出限低至0.1 fg，靈敏性極高。為降低檢測(cè)所需的試劑量、時(shí)間以及檢測(cè)成本，Li 等[42]建立了多重反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（MRT-qPCR）。該方法可同時(shí)檢測(cè)可垂直傳播或造成免疫抑制的6 種禽病毒，如馬立克氏病毒（MDV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病毒（REV）、禽呼腸孤病毒（ARV）、CIAV、FAdV和傳染性法氏囊病毒（IBDV），具有高特異性、敏感性和可重復(fù)性的優(yōu)勢(shì)。Xie 等[43]利用兩種單克隆抗體（mAb），建立了針對(duì)FAdV-4 的Fiber-2蛋白編碼基因的快速膠體金試紙條。該試紙條具有高特異性，對(duì)FAdV-4 及Fiber-2 蛋白的最低檢測(cè)限分別為1×105TCID50/0.1 mL 及0.1 μg/0.1 mL，為資源有限地區(qū)提供了一種高效、便捷的診斷方法。

3 小結(jié)

FAdV Ⅰ群中的FAdV-4 主要引起HHS。HHS自1987 年首次在巴基斯坦安卡拉地區(qū)被發(fā)現(xiàn)后已在世界范圍內(nèi)普遍存在，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大威脅和經(jīng)濟(jì)損失。FAdV-4 的檢測(cè)方法目前主要包括血清學(xué)檢測(cè)方法和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。血清學(xué)檢測(cè)中，以FAdV 重組蛋白作為包被抗原建立的ELISA 方法最為常用，其靈敏度比常規(guī)血清學(xué)檢測(cè)高很多。同時(shí)，ELISA 方法的簡(jiǎn)便和快速等優(yōu)勢(shì)，使其成為臨床檢測(cè)FAdV 的一種重要方法。PCR 是最常用的分子生物學(xué)診斷方法，能將微量的DNA 大量擴(kuò)增；qPCR 被廣泛用于多種病原體的檢測(cè)和定量，與常規(guī) PCR 相比，qPCR 具備敏感性高、特異性強(qiáng)，而且快速、高效、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)；LAMP 反應(yīng)時(shí)間短，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，近年來(lái)受到了眾多學(xué)者的關(guān)注；隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，已建立出可以檢測(cè)12 種血清型的RPA 方法，這種可以檢測(cè)不同血清型FAdV 的通用檢測(cè)方法在臨床上具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的新型檢測(cè)技術(shù)逐漸被用于FAdV-4 的快速檢測(cè)，為該病的快速診斷、防控提供了更有力技術(shù)支撐。