梅源，蘇周晨星，譚立杭，郭賓，索雨潔，段冰冰，閆銀芳，劉旭*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，四川成都 610011；3.香格里拉酒業(yè)股份有限公司，云南迪慶 674400；4.五糧液仙林生態(tài)酒業(yè)有限公司，四川宜賓 644007）

生態(tài)條件是釀酒葡萄品質(zhì)形成的重要基礎(chǔ)[1]。在全球氣候變化的大背景下，氣溫升高、紫外輻射增強以及水資源短缺等問題突出，顯著影響了傳統(tǒng)葡萄酒產(chǎn)區(qū)葡萄生長發(fā)育的物候期和生理生化特性，進而影響了葡萄酒品質(zhì)[2-4]。為應(yīng)對氣候變化帶來的影響，釀酒葡萄栽培常通過調(diào)節(jié)果際微氣候來提高果實品質(zhì)[5]，此外國內(nèi)外酒莊還積極尋找更高海拔的葡萄酒產(chǎn)區(qū)。因為高海拔地區(qū)的平均氣溫普遍低于傳統(tǒng)葡萄酒產(chǎn)區(qū)，且晝夜溫差更大、光合有效輻射更強，有助于葡萄果實中積累更多的揮發(fā)性香氣化合物和黃酮類次生代謝產(chǎn)物，這既能提高高海拔地區(qū)葡萄果實的抗逆性，又有利于獲得優(yōu)質(zhì)的釀酒原料[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，海拔高度會影響葡萄果實中香氣物質(zhì)的積累[7]，進而造成葡萄酒中風(fēng)味化合物種類、含量的變化，以及風(fēng)味輪廓的差異[8]。Falc?o等[9]對比了不同海拔葡萄園釀造的‘赤霞珠’葡萄酒風(fēng)味物質(zhì)差異發(fā)現(xiàn)，2-甲氧基-3-異丁基吡嗪類物質(zhì)與海拔具有顯著相關(guān)性，且葡萄酒呈現(xiàn)更濃郁的“甜椒”氣味。Yue等[10]對云南高原5個不同海拔地區(qū)‘赤霞珠’葡萄酒的香氣特征進行了研究發(fā)現(xiàn)，隨著海拔升高，葡萄酒總揮發(fā)物的數(shù)量逐漸增加但濃度降低。此外，針對不同葡萄品種及所釀葡萄酒的酚類物質(zhì)、抗氧化活性和感官質(zhì)量特征等方面也有相關(guān)報道[7,11]。Berli等[12]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄漿果比表面積隨著海拔高度的增加而降低，從而有利于提高葡萄浸漬發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)和香氣物質(zhì)的可提取率。因此，高海拔葡萄酒往往呈現(xiàn)出更加突出的香氣和口感[13]。

除了葡萄品種、生態(tài)條件、栽培管理和陳釀措施等因素外，浸漬工藝對葡萄酒最終的風(fēng)味品質(zhì)形成也至關(guān)重要[14]。尤其是當(dāng)葡萄原料成熟度好，酚類物質(zhì)、花色苷及優(yōu)質(zhì)單寧等含量充足時，采用加強浸漬工藝更有利于釀造出風(fēng)味濃郁的高品質(zhì)葡萄酒[15]。針對于此，前人研究了不同浸漬工藝對常見海拔地區(qū)葡萄酒品質(zhì)的影響[14,16]。張娟等[17]探究了葡萄酒發(fā)酵結(jié)束后延長浸漬時間對葡萄酒香氣和品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著浸漬時間的延長葡萄酒的香氣成分含量增加，且具有更濃郁的果香和植物香氣。周繼亙等[18]對比了多種浸漬工藝條件對葡萄酒香氣物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)冷浸漬工藝下酒樣香氣物質(zhì)種類更多，且具有更好的感官特性。上述報道多針對單一的海拔高度因素或釀造工藝來研究其對葡萄酒風(fēng)味及品質(zhì)的影響，但在探索不同浸漬工藝對高海拔葡萄酒品質(zhì)尤其是香氣品質(zhì)相關(guān)影響的研究卻鮮有報道。

因此，本研究對我國西南高山產(chǎn)區(qū)高海拔‘赤霞珠’葡萄原料采用常規(guī)浸漬發(fā)酵、發(fā)酵前冷浸漬和發(fā)酵后延長浸漬3種方式，對所釀葡萄酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行了測定，采用偏最小二乘判別分析（PLSDA）和香氣活度值（OAV）等方法解析了3種浸漬工藝下葡萄酒風(fēng)味的差異和特征物質(zhì)，并結(jié)合感官評價探明了不同浸漬工藝對高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香氣品質(zhì)的影響，以期為高海拔地區(qū)優(yōu)質(zhì)葡萄酒釀造工藝的優(yōu)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料及試劑

試材為11年生‘赤霞珠’葡萄，2022年于商業(yè)采收期（9月25日）采自四川省甘孜藏族自治州得榮縣日雨鎮(zhèn)因都壩二號壩葡萄園（28°37’N，99°11’E），海拔2775 m，采用常規(guī)田間管理。

無水乙醇、酒石酸、氯化鈉（均為分析純），西安化學(xué)試劑站。超純水由純水制備儀Milli-Q（美國Millipore公司）制備。4-甲基-2-戊醇等香氣成分標(biāo)準品，Sigma-Aldrich公司（北京分部）。

1.2 儀器與設(shè)備

Lyza 5000 Wine全自動分析儀，安東帕有限公司（奧地利）；UV-1780紫外分光光度計，島津儀器公司（蘇州分部）；固相微萃取裝置（SPME，Supelco，Bellefonte PA，美國），配聯(lián)用手柄57330-U，萃取纖維50/30 μm DVB/CAR/PDMS；島津QP2020氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（島津，日本），色譜柱為毛細管柱DBWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W，美國）。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造

參考干紅葡萄酒小容器釀造規(guī)范[19]，略有修改。每個處理隨機選取成熟度良好、健康無病的葡萄漿果20 kg。除梗破碎后，加入50 mg?L-1焦亞硫酸，倒入20 L玻璃發(fā)酵罐后，采用以下3種方式進行浸漬發(fā)酵：

常規(guī)浸漬（NM）：入罐后的葡萄醪立即加入20 mg?L-1果膠酶（Lallzyme Ex，法國）和200 mg?L-1酵母菌（Lallemand，法國），啟動酒精發(fā)酵，每天壓帽3次。酒精發(fā)酵結(jié)束后立即進行皮渣分離，在酒液中加入50 mg?L-1焦亞硫酸，于4 ℃冷庫中澄清1個月，期間倒罐3次，去除酒泥，再將新酒封存于4 ℃冷庫中貯藏3個月，待后續(xù)指標(biāo)測定及感官評價。

發(fā)酵前冷浸漬（Pr-M）：將干冰加入發(fā)酵罐，使葡萄醪的溫度降至4 ℃，保持冷浸漬7 d，待葡萄醪回溫至12 ℃后加入20 mg?L-1果膠酶和200 mg?L-1酵母，啟動酒精發(fā)酵。后續(xù)管理同NM。

發(fā)酵后延長浸漬（Po-M）：常規(guī)浸漬發(fā)酵結(jié)束后，繼續(xù)每天壓帽3次，保持葡萄皮渣被酒液持續(xù)浸漬7 d后，期間加入適量干冰使葡萄醪溫度控制在18 ℃左右。浸漬結(jié)束后進行皮渣分離，后續(xù)管理同NM。

1.3.2 基本理化指標(biāo)及酚類物質(zhì)含量測定

采用葡萄酒全自動分析儀對不同處理下釀造所得葡萄酒的pH、酒精度、含糖量、可滴定酸含量等基本理化指標(biāo)進行測定。總酚含量的測定采用福林-肖卡法，結(jié)果以沒食子酸計；總單寧含量的測定采用甲基纖維素沉淀法（MCP）[20]，結(jié)果以兒茶素計；總花色苷含量的測定參考翦祎等[21]的方法進行，結(jié)果以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷計。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

采用頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC/MS）進行測定。依次取葡萄酒樣品5.0 mL、氯化鈉1.0 g和4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，置于20 mL頂空瓶中用于GC-MS分析；GC-MS設(shè)定條件參考李愛華等[22]的方法。測定所得結(jié)果經(jīng)NIST14.L譜庫檢索，對其中匹配度大于750的物質(zhì)進行定性分析。采用濃度為1.0 μg?L-1的4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)進行相對定量，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對濃度的計算參考畢蕓杰[23]的方法。

1.3.4 感官評價

參考楊潔等[24]的方法對感官品評員進行訓(xùn)練，經(jīng)考核篩選后組建感官品評小組。小組成員共20人，男女比例1∶1，由年齡在18～25歲的西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院本科生及研究生組成。采用線性標(biāo)度法[25]（0～10 cm）對酒樣風(fēng)味描述詞的感官特性進行強度上的定量描述分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進行方差分析、多重比較（Duncan，P≤0.05）；采用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘回歸分析（PLSDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸漬方式對高海拔葡萄酒理化指標(biāo)的影響

由表1可知，Po-M處理組酒樣可滴定酸含量顯著高于NM和Pr-M組，pH則顯著低于其他兩個處理。3個處理間酒樣揮發(fā)性酸含量無顯著性差異。不同浸漬方式下葡萄酒的酒精度均較高，為15.06%～15.64%（Vol，下同）。Po-M處理酒樣的殘?zhí)呛匡@著高于其他兩個處理，3種浸漬方式下酒樣的殘?zhí)呛繛?.51～2.70 g?L-1，表明所有酒樣均為發(fā)酵完全的干型葡萄酒?？傮w而言，3種浸漬方式下的葡萄酒樣均符合GB 15037—2006《葡萄酒》的相關(guān)要求。Po-M酒樣的總酚含量為3.24 g?L-1，顯著高于NM和Pr-M，而后兩者間無顯著性差異。3種浸漬方式下酒樣的總花色苷和總單寧含量均無顯著差異。

2.2 浸漬方式對高海拔葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)影響

2.2.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量分析

利用HS-SPME-GC/MS方法得到的揮發(fā)性化合物，通過譜庫檢索共鑒定出73種物質(zhì)，包括酯類34種、醇類30種、酸類4種、醛酮類4種、酚類1種（表2），其中在NM、Pr-M和Po-M處理酒樣中分別鑒定出59、61、51種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由表2可知，3種浸漬方式的酒樣中醇類和酯類物質(zhì)的相對含量最高，總含量分別為602 851～652 904 μg?L-1和79 711～88 266 μg?L-1。此外，盡管各處理酒樣的醇類和酯類物質(zhì)總含量差異較小，但在種類上存在一定的差異。其中，NM處理酒樣的醇類物質(zhì)種類最多（27種），高于Pr-M（24種）和Po-M處理（20種）。而Pr-M處理酒樣的酯類物質(zhì)種類最多（29種），高于Po-M（25種）和NM處理（25種）。

表2 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量Table 2 Volatile aroma compounds content of high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

為了明確不同浸漬方式下高海拔葡萄酒揮發(fā)性化合物的整體概況以及所鑒定出的化合物是否具有代表性，以不同物質(zhì)的相對含量為X變量，不同浸漬方式為Y變量進行無監(jiān)督的PCA分析。由圖1可知，PC1和PC2累計解釋所有變量的86.1%，可以表示所有樣品的大部分信息。不同浸漬方式下葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在組成上具有較好的區(qū)分度，說明不同處理酒樣揮發(fā)性物質(zhì)的差異較大。其中Pr-M和Po-M處理分別與第一主成分呈現(xiàn)出負相關(guān)和正相關(guān)，且均與第二主成分呈負相關(guān)；NM處理主要與第二主成分呈正相關(guān)，這表明常規(guī)浸漬處理的酒樣與增強浸漬（Pr-M和Po-M）后的酒樣主要在第二主成分上存在差異。

圖1 不同浸漬方式下高海拔葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA分析Figure1 PCA analysis of volatilearoma compounds in high-altitudewinesunder diあerentmacerationmethods

2.2.2 主要差異性和風(fēng)味貢獻化合物分析

為了進一步明確不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒樣中具有差異性的主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物，對NM、Pr-M和Po-M處理下酒樣中檢測到的73種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行偏最小二乘判別分析，交叉驗證R2為0.584，Q2為-0.029，表明模型未過擬合[26]，且PLS-DA模型的R2X為0.995，R2Y為0.998，Q2為0.993，表明模型穩(wěn)定可靠[27]。PLS-DA分析雙標(biāo)圖（圖2A）中從大到小的橢圓分別表示置信度為100%、75%和50%。在模型中鑒定出9種VIP>1.0的差異貢獻化合物（圖2B），大部分為醇類化合物；其中1-戊醇（A38）與第二主成分呈現(xiàn)正相關(guān)，是NM處理相對Pr-M和Po-M處理下的主要差異化合物。另外，異戊醇（A37）、正己醇（A42）、苯乙醇（A60）和正丁醇（A36）等化合物與第一主成分呈負相關(guān)，是Pr-M處理酒樣中的主要差異性風(fēng)味物質(zhì)；而乙酸乙酯（A1）、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇（A48）、己酸（A65）和苯甲醇（A59）等風(fēng)味化合物則與Po-M處理密切相關(guān)。結(jié)合圖2A的結(jié)果表明，盡管大多數(shù)風(fēng)味化合物與Pr-M處理酒樣具有更強的相關(guān)性，但在主要差異化合物中具有代表性的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量與Po-M處理相同，且均高于NM處理。在加強浸漬處理中，Po-M處理酒樣的主要差異化合物除了醇類化合物外還包括酯類和酸類化合物，因此在風(fēng)味物質(zhì)組成上較Pr-M酒樣更加豐富。

圖2 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PLS-DA分析Figure 2 PLS-DA analysis of volatile aroma compounds in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wines under diあerent maceration methods

香氣活度值（OAV）是評價某單一香氣化合物對食品整體香氣貢獻程度的指標(biāo)[28]，尤其當(dāng)OAV＞1時，表明該物質(zhì)含量超過了人體感官閾值，是評估其對葡萄酒風(fēng)味貢獻的重要指標(biāo)。3種不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV＞1的主要物質(zhì)包括13種化合物（表3）。其中酯類化合物7種，醇類物質(zhì)4種，酸類物質(zhì)2種；OAV值最高的化合物為呈果香的異戊酸乙酯，其次是呈甜果香和草莓香的2-甲基丁酸乙酯，第三是呈現(xiàn)脂肪氣味的己酸。盡管大多數(shù)酯類化合物在PLS-DA分析中并非差異化合物，但其含量對不同浸漬方式下葡萄酒的風(fēng)味輪廓差異仍具有一定影響，尤其是OAV值較高的幾種酯類物質(zhì)中Po-M處理的最高，這表明Po-M處理酒樣可能具有更多的果香特征。再結(jié)合VIP＞1的化合物發(fā)現(xiàn)，作為Pr-M處理酒樣主要差異貢獻物的異戊醇、正己醇和苯乙醇可能使Pr-M酒樣呈現(xiàn)更多的花香和植物香氣。然而NM處理酒樣中，這些化合物的OAV值與其他處理的酒樣相比，均位于中間值或最低值，表明NM處理下葡萄酒的花果香和植物香等香味強度低于增強浸漬處理后的樣品。

表3 不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒中OAV>1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Volatile aroma compounds with OAV> 1 in high-altitude 'Cabernet Sauvignon' wine under diあerent maceration methods

2.3 不同浸漬方式對高海拔葡萄酒感官品質(zhì)的影響

為明確不同浸漬方式下高海拔‘赤霞珠’葡萄酒香氣感官特性的差異，感官品評小組對所有處理組酒樣的風(fēng)味特性進行了定量描述分析。不同的香氣描述詞根據(jù)其風(fēng)味特性分為6類，分別是果香（包括覆盆子、黑醋栗、草莓、香蕉等描述詞）；花香（包括紫羅蘭、玫瑰等描述詞）；植物（包括青椒、薄荷、香草等描述詞）；煙熏、香料（包括煙草、胡椒、桂皮等描述詞）；木頭、堅果（包括橡木、雪松、烤杏仁等描述詞）；脂肪（包括奶油、巧克力等描述詞）。根據(jù)不同類別風(fēng)味強度的得分情況繪制雷達圖（圖3）。NM處理酒樣具有更濃郁的木頭、堅果和脂肪味，而在花果香、植物香和香料等風(fēng)味的強度上最低。和NM相比，Pr-M處理酒樣的花香和植物香型更強，且具有中等強度的煙熏、香料味。Po-M處理酒樣具有濃郁的果香和煙熏、香料味，以及中等強度的木頭、堅果和脂肪味，而在花香和植物香上強度略低于Pr-M酒樣。不同浸漬方式下葡萄酒風(fēng)味輪廓的感官分析結(jié)果與VIP結(jié)合OAV值篩選出的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)基本符合，即酯類化合物如異戊酸乙酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯等含量較高的Po-M處理酒樣更具果香，醇類物質(zhì)如正庚醇、苯乙醇等含量較高的Pr-M處理酒樣更具花香和植物香。

圖3 感官分析雷達圖Figure 3 Radar map of sensory analysis

3 討論與結(jié)論

香氣是表征葡萄酒感官質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。由于釀酒葡萄中大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)主要存在于果皮中[33]，因此在葡萄原料品質(zhì)較好的情況下常采用加強浸漬的方式來提高葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)和整體質(zhì)量。然而，針對不同的葡萄品種和原料品質(zhì)，采用的加強浸漬方式也各不相同，因此本研究通過頂空固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對高海拔‘赤霞珠’葡萄在不同浸漬方式下釀造葡萄酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異進行了檢測分析。本試驗共鑒定出73種化合物，其中醇類和酯類化合物種類和含量最高，占所有香氣成分含量的98%，與前人的研究結(jié)果一致[17-18]。

不同浸漬方式會影響葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量[34]，發(fā)酵前冷浸漬處理葡萄酒中的風(fēng)味化合物種類最多，較另外兩個處理酒樣的主要差異化合物為醇類物質(zhì)，如由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生的苯乙醇[17]以及正己醇等化合物，其獨特的紫羅蘭、玫瑰香氣和青草味使葡萄酒呈現(xiàn)出更濃郁優(yōu)雅的花香和植物香氣。這是由于發(fā)酵前葡萄醪的冷浸漬有利于提高‘赤霞珠’葡萄酒中糖苷含量[35]，且有利于更多芳香類物質(zhì)的浸出[18]。另外，本試驗中發(fā)酵后延長浸漬處理葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量較常規(guī)浸漬處理更少，但其關(guān)鍵差異化合物的組成更加復(fù)雜，且葡萄酒風(fēng)味貢獻化合物中乙酸乙酯及脂肪酸等的含量更高。由于酯類物質(zhì)是葡萄酒發(fā)酵香氣中果香的主要貢獻物質(zhì)[29]，因此發(fā)酵后延長浸漬處理的葡萄酒表現(xiàn)出更濃厚的甜果香，且其中的差異化合物己酸具有的脂肪味也能有效調(diào)節(jié)葡萄酒風(fēng)味的平衡性，從而豐富風(fēng)味結(jié)構(gòu)。值得注意的是，發(fā)酵后延長浸漬處理和發(fā)酵前冷浸漬一樣可提高葡萄酒風(fēng)味和品質(zhì)，且發(fā)酵后延長浸漬能有效提高葡萄酒中的酚類化合物含量[14]，使葡萄酒更加飽滿醇厚，并能在一定程度上彌補發(fā)酵前期產(chǎn)生的缺陷[17]，提高葡萄酒的整體風(fēng)味。相比發(fā)酵前冷浸漬處理，發(fā)酵后延長浸漬處理葡萄酒風(fēng)味產(chǎn)生的差異可能與其浸漬溫度和浸漬階段有關(guān)[36]，且發(fā)酵后延長浸漬相比發(fā)酵前冷浸漬可能延長了葡萄酒中酯化反應(yīng)的進程，從而能萃取出更多的酯類物質(zhì)。感官評價結(jié)果表明，增強浸漬處理能顯著提升高海拔‘赤霞珠’葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)，尤其是發(fā)酵后延長浸漬較發(fā)酵前冷浸漬釀造的葡萄酒具有更濃郁的果香和更豐富的風(fēng)味結(jié)構(gòu)。

綜上所述，以高海拔‘赤霞珠’葡萄為原料，經(jīng)過加強浸漬處理的葡萄酒較常規(guī)浸漬處理具有更豐富的風(fēng)味物質(zhì)組成，且貢獻差異的化合物含量更高，發(fā)酵后延長浸漬能使葡萄酒呈現(xiàn)出更豐富的香味類型。本研究結(jié)果為優(yōu)化我國高海拔地區(qū)葡萄酒釀造工藝，進一步提升高海拔葡萄酒的品質(zhì)提供了一定的理論和實踐基礎(chǔ)。