董曉飛 梁紫堯 范龍 全景羽 林琳 周穎芳 吳蕾 于旭華

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 510150； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣州 510120； 3.粵港澳中醫(yī)藥與免疫疾病研究聯(lián)合實驗室，廣州 510290）

吸煙對人體免疫系統(tǒng)具有復(fù)雜的影響［1］。研究表明，與不吸煙人群相比，吸煙者感染流感病毒風(fēng)險增加［2］。但吸煙對呼吸道抗病毒免疫的影響并不清楚。TLR3是病毒入侵宿主后激活宿主免疫的主要途徑，也是促進(jìn)Ⅰ型干擾素生成的主要途徑。本研究通過觀察香煙煙霧對TLR3激動劑聚肌苷聚胞苷酸鈉poly（I：C）誘導(dǎo)的氣道免疫炎癥反應(yīng)和Ⅰ型干擾素及干擾素刺激基因的影響，明確香煙煙霧暴露對TLR3激活誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 poly（I：C）、鹽酸吖啶橙溶液、溴化乙錠（Sigma，貨號：019M4060v、8097-10ML、E1510-10-ML）；SteadyPure通用RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Tab HS預(yù)混型qPCR試劑盒（Accurate Biology，貨號：AG21017、AG11701）；KWIK-DIFF溶液#1、#2、#3快速染色試劑盒（Thermo Fisher，貨號：9990700）；大前門牌過濾嘴香煙（煙堿含量0.8 mg，焦油量11 mg/支，上海煙草集團(tuán)）。引物均來源于Invitrogen（Fisher Scientific），引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2 儀器 多功能臺式冷凍離心機(jī)（AllegraX-22R）；超微量紫外/可見分光光度計（賽默飛，Nanodrop 2000c）；PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystem）；熒光定量PCR儀（Ⅵ A7）；顯微鏡（BX61+DP720，Olympus）；細(xì)胞涂片離心機(jī)（Stat Spin CytoFuge12/IRIS）。

1.1.3 實驗動物 SPF級6～8周齡BALB/c小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2） g，由廣東斯嘉景達(dá)生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（粵）2020-0052。飼養(yǎng)溫度：（24±3） ℃，相對濕度：（40±5）%，光照：明暗交替，噪聲＜55 dB，自由攝水?dāng)z食，每周更換墊料2次。本研究經(jīng)廣東省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（2021066）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、熏煙組、poly（I：C）組、熏煙聯(lián)合poly（I：C）組，每組6只。熏煙方法：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，置于18 L塑料熏煙箱中，于9：00、12：00、15：00進(jìn)行熏煙，3支/次，3次/d，1 h/次，共4 d，煙霧用60 ml注射器注入熏煙箱。假熏煙即每天按時置于18 L塑料箱，但不給予香煙煙霧暴露。poly（I：C）滴注方法：熏煙結(jié)束后第1天經(jīng)異氟烷吸入麻醉，移液器經(jīng)鼻孔滴入50 μl poly（I：C）（1 mg/ml），待小鼠清醒后置于籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。假滴注即在異氟烷麻醉后滴入50 μl生理鹽水。對照組給予假熏煙和假滴注，熏煙組給予熏煙聯(lián)合假滴注，poly（I：C）組給予假熏煙和poly（I：C）滴注，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組給予熏煙和poly（I：C）滴注。

1.2.2 氣道灌洗液制備［3］小鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，切開氣管處皮毛，充分暴露氣管，經(jīng)環(huán)狀軟骨間隙切開一小口，插入氣管灌洗管（剪成楔形的24 G靜脈留置針），分4次向氣管內(nèi)注射1.3 ml PBS并回抽，每只小鼠共回收約1 ml含免疫細(xì)胞的灌洗液。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù) 將氣道灌洗液混勻，加入20 μl AO/EB工作液混勻，將細(xì)胞計數(shù)板置于熒光顯微鏡下進(jìn)行有核細(xì)胞計數(shù)。剩余含細(xì)胞的灌洗液根據(jù)細(xì)胞濃度用涂片離心機(jī)進(jìn)行涂片離心，干燥后進(jìn)行快速KWIKDIFF染色。按細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異對細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)，獲得不同種類細(xì)胞比例，計算每只動物灌洗液中不同種類細(xì)胞絕對數(shù)。

1.2.4 qPCR測定肺組織細(xì)胞因子 完成氣管灌注后切開胸腹，充分暴露心肺，用5 ml生理鹽水進(jìn)行心臟灌流，洗去肺中殘存血液，切下兩側(cè)肺，濾干水分，液氮速凍后-80 ℃保存。使用SteadyPure通用型RNA提取試劑盒提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照劑盒說明書操作，2-ΔΔCt計算RNA相對表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗，兩兩比較采用Tukey檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香煙煙霧聯(lián)合poly（I：C）對氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)的影響 與對照組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)（P＜0.01）、巨噬細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）、中性粒細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）和淋巴細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）均明顯升高。與熏煙組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)（P＜0.01）、巨噬細(xì)胞數(shù)量（P＜0.05）、中性粒細(xì)胞數(shù)（P＜0.01）均顯著升高（P＜0.01）。與poly（I：C）組小鼠相比，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)（P＜0.05）和巨噬細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）顯著升高（表2）。

表2 氣道灌洗液細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)（，n=6）Tab.2 Total number of cells and cell differentials in airway lavage fluid （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.05.

Total lymphocytes（×105）0.03±0.00 0.09±0.02 0.32±0.061）3）0.23±0.061）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）Total cells（×105）1.27±0.22 2.26±0.35 4.29±0.861）7.28±0.782）4）5）Total macrophages（×105）1.09±0.19 1.89±0.26 1.84±0.43 3.49±0.322）3）5）Total neutrophils（×105）0.05±0.01 0.26±0.11 2.13±0.751）3）3.56±0.532）4）

2.2 香煙煙霧聯(lián)合poly（I：C）對灌洗液中免疫細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 對照組灌洗液以單核-巨噬細(xì)胞為主，偶見中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。巨噬細(xì)胞胞體呈圓形，胞核呈圓形，深染；中性粒細(xì)胞通常呈桿狀或2～3分葉狀。熏煙組細(xì)胞以巨噬細(xì)胞為主，體積較對照組巨噬細(xì)胞稍大。poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液可見大量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，中性粒細(xì)胞核多呈明顯的3～5分葉狀，葉與葉間多有細(xì)絲相連，巨噬細(xì)胞數(shù)量相對較少，與對照組比較，體積較大。熏煙聯(lián)合poly（I：C）組巨噬細(xì)胞體積較大，呈圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見空泡，部分細(xì)胞處于有絲分裂期；中性粒較多，分葉狀明顯（圖1）。

圖1 香煙煙霧聯(lián)合poly（I：C）對免疫細(xì)胞形態(tài)的影響（KWIK-DIFF快速染色，×200）Fig.1 Effects of cigarette smoke combined with poly（I：C）on immune cell morphology （KWIK-DIFF rapid staining，×200）

2.3 香煙煙霧聯(lián)合poly（I：C）對肺組織趨化因子表達(dá)的影響 與對照組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）和淋巴細(xì)胞趨化因子CCL2（P＜0.01） mRNA表達(dá)均升高。與熏煙組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織CXCL1（P＜0.05）、CXCL2（P＜0.01）、CCL2（P＜0.01） mRNA表達(dá)均顯著升高。與poly（I：C）組小鼠比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織CXCL2 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，表3）。

表3 小鼠肺組織中趨化因子表達(dá)（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

表3 小鼠肺組織中趨化因子表達(dá)（，n=6）Tab.3 Expressions of chemokines in lung tissues of mice（，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 5）P＜0.05.

CCL2 mRNA 0.94±0.12 2.99±0.41 70.69±14.911）3）105.50±24.282）4）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）CXCL1 mRNA 1.10±0.13 3.70±0.63 22.40±7.39 37.06±9.731）3）CXCL2 mRNA 1.00±0.02 2.08±0.45 3.39±1.51 8.38±1.822）4）5）

2.4 香煙煙霧聯(lián)合poly（I：C）對肺組織中細(xì)胞因子及MMP-12表達(dá)的影響 與對照組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。與熏煙組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。與poly（I：C）組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織TNF-α mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。各組間MMP-12表達(dá)無明顯變化（P＞0.05，表4）。

表4 小鼠肺組織中細(xì)胞因子及金屬蛋白酶MMP-12表達(dá)（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

表4 小鼠肺組織中細(xì)胞因子及金屬蛋白酶MMP-12表達(dá)（，n=6）Tab.4 Expressions of cytokines and metalloproteinase MMP-12 in lung tissues of mice （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.05， 4）P＜0.01； compared with poly（I：C） group，5）P＜0.01.

MMP-12 1.23±0.32 1.79±0.47 0.77±0.13 1.86±0.50 Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IL-1β mRNA 1.04±0.16 0.83±0.14 7.31±1.611）3）10.08±2.512）4）IL-6 mRNA 0.89±0.08 2.07±0.57 57.40±15.22）3）65.06±16.492）4）TNF-α mRNA 0.98±0.08 2.54±0.95 4.01±0.70 12.36±3.072）4）5）

2.5 熏煙聯(lián)合poly（I：C）對小鼠肺組織干擾素及干擾素刺激基因表達(dá)的影響 與對照組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.05）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表達(dá)顯著升高。與熏煙組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織IFN-β（P＜0.01）、IFN-γ（P＜0.01）、MX2（P＜0.01）和IP-10（P＜0.01）表達(dá)顯著升高。且與單純poly（I：C）組比較，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠IFN-β表達(dá)顯著升高（P＜0.01，表5）。

表5 肺組織中干擾素表達(dá)及干擾素刺激基因轉(zhuǎn)錄（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

表5 肺組織中干擾素表達(dá)及干擾素刺激基因轉(zhuǎn)錄（，n=6）Tab.5 Expressions of interferons and transcription of interferon-stimulated-genes in lung tissues （，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05， 2）P＜0.01； compared with smoke group， 3）P＜0.01； compared with poly（I：C） group， 4）P＜0.01.

IP-10 1.02±0.12 1.81±0.31 90.23±33.08 153.52±30.882）3）Groups Control Smoke poly（I：C）Smoke+poly（I：C）IFN-α 1.38±0.78 1.40±0.50 1.07±0.25 1.88±0.66 IFN-β 1.41±0.83 1.29±0.49 3.81±1.18 10.67±2.222）3）4）IFN-γ 1.00±0.03 0.90±0.23 5.85±0.772）3）5.04±1.161）3）IFN-λ 1.30±0.67 1.52±0.70 1.48±0.68 1.79±0.49 OAS1 1.06±0.25 1.34±0.66 1.59±0.40 1.31±0.25 MX2 1.01±0.10 1.38±0.50 7.68±1.572）3）9.39±1.032）3）

3 討論

吸煙可誘導(dǎo)氣道炎癥并導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)不可逆破壞。poly（I：C）是人工合成的雙鏈RNA，可模擬病毒感染并通過激活TLR3引發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答，產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮抗病毒作用［4］。poly（I：C）本身具有強(qiáng)烈促炎作用以及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬、殺菌等功能，廣泛用于病毒引起的宿主免疫應(yīng)答研究［5］。盡管短期香煙暴露并未導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)破壞，但課題組前期研究表明，4 d香煙煙霧暴露可誘導(dǎo)氣道免疫細(xì)胞聚集和肺組織炎癥反應(yīng)［3］，因此本研究揭示香煙暴露誘導(dǎo)的氣道免疫應(yīng)答與poly（I：C）誘導(dǎo)的氣道免疫應(yīng)答的疊加效應(yīng)，從而反映吸煙人群在病毒感染過程中的免疫應(yīng)答變化以及吸煙對呼吸道病毒感染免疫應(yīng)答的影響。

巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是固有免疫屏障的重要組成，可吞噬清除病原微生物和氣道中的有害顆粒［6］。淋巴細(xì)胞可介導(dǎo)被感染細(xì)胞的免疫應(yīng)答，通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對細(xì)胞進(jìn)行殺傷或誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。本研究表明，香煙暴露4 d導(dǎo)致小鼠氣道灌洗液細(xì)胞數(shù)量輕度升高，未出現(xiàn)明顯炎癥反應(yīng)，可能由于香煙暴露第5天接受了假氣道滴注，24 h后進(jìn)行取材，此時短期香煙暴露導(dǎo)致的氣道急性炎癥反應(yīng)有所衰減。相比于poly（I：C）組，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組氣道灌洗液中細(xì)胞總數(shù)明顯增多，主要為巨噬細(xì)胞增多，而中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示香煙煙霧加劇了poly（I：C）對巨噬細(xì)胞的趨化和募集，這一過程可能更有利于微生物清除。

免疫細(xì)胞在炎癥部位聚集是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)，而趨化因子是誘導(dǎo)免疫細(xì)胞移動、回巢和聚集的關(guān)鍵［7］。本研究中，熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠肺組織單核-巨噬細(xì)胞趨化因子CCL2和IP-10表達(dá)較其余各組有不同程度升高，解釋了熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液中巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多的原因。巨噬細(xì)胞分泌的多形核細(xì)胞趨化因子CXCL2表達(dá)較poly（I：C）組小鼠明顯升高，說明氣道中巨噬細(xì)胞可能通過增加CXCL2表達(dá)進(jìn)一步加劇中性粒細(xì)胞招募，從而促進(jìn)“炎癥瀑布”形成。

IL-6、TNF-α、IL-1β是常見的促炎因子，均可參與炎癥反應(yīng)發(fā)生。IL-6是最早升高的急性炎癥標(biāo)志物。TNF-α、IL-6和IL-1β能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)并參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，同時促進(jìn)炎癥細(xì)胞活化與浸潤，增強(qiáng)炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的呼吸道黏液細(xì)胞高分泌狀態(tài)，引發(fā)支氣管狹窄、收縮等氣道高反應(yīng)性［8-9］。本研究表明，氣道滴注poly（I：C）24 h后，小鼠肺組織IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)明顯升高，說明小鼠氣道處于急性炎癥反應(yīng)階段。而熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)略高于poly（I：C）組，且TNF-α mRNA表達(dá)明顯高于poly（I：C）組，說明香煙煙霧暴露加劇了poly（I：C）誘導(dǎo)的小鼠肺部急性炎癥反應(yīng)，且熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道灌洗液中性粒細(xì)胞較多，巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生大量吞噬空泡，說明熏煙聯(lián)合poly（I：C）組小鼠氣道炎癥反應(yīng)加劇。

干擾素是抑制病毒復(fù)制的重要介質(zhì)，根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞不同可分為IFN-α、IFN-β和IFN-γ，近年還發(fā)現(xiàn)了IFN-λ，也稱Ⅲ型IFN，具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能。IFN-α和IFN-β被歸為Ⅰ型IFN，能在病毒感染早期抑制病毒復(fù)制［10］。IFN-γ即Ⅱ型IFN，是一種免疫調(diào)節(jié)因子而非抗病毒介質(zhì)［11］。本研究中，熏煙聯(lián)合poly（I：C）滴注顯著升高了IFN-β表達(dá)，其水平高于單獨poly（I：C）滴注組，說明香煙煙霧暴露促進(jìn)了poly（I：C）誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN表達(dá)。Ⅰ型IFN可通過與IFN受體（IFNAR）結(jié)合促進(jìn)下游IFN刺激基因轉(zhuǎn)錄，如OAS、MX和IP-10等。OAS1可調(diào)節(jié)核糖核酸酶L的抗病毒活性，導(dǎo)致病毒RNA降解，抑制病毒復(fù)制［12-13］。MX蛋白可通過蛋白寡聚和GTP酶水解抑制RNA和DNA病毒復(fù)制［14］。IP-10具有促進(jìn)T細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞、抗腫瘤活性和抑制骨髓集落形成和血管生成作用，也是有力的巨噬細(xì)胞趨化因子，參與COVID-19誘導(dǎo)的炎癥風(fēng)暴［15-16］。本研究表明，香煙煙霧暴露聯(lián)合poly（I：C）氣道滴注顯著增加了小鼠肺部MX2和IP-10表達(dá)，提示香煙煙霧暴露聯(lián)合poly（I：C）滴注促進(jìn)了IFN刺激基因表達(dá)，可能因此抑制病毒復(fù)制和促進(jìn)炎癥風(fēng)暴。

綜上，短期香煙煙霧暴露可能通過增加poly（I：C）誘導(dǎo)的氣道巨噬細(xì)胞數(shù)量和Ⅰ型IFN表達(dá)促進(jìn)呼吸道病毒清除，同時增加了poly（I：C）誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)，加劇氣道損傷和重構(gòu)。

本研究結(jié)果并未提示香煙煙霧可通過抑制Ⅰ型IFN表達(dá)增加呼吸道病毒感染，與既往研究結(jié)果不一致，其原因可能與本次香煙暴露時間較短有關(guān)［17-18］。同時提示香煙煙霧可能通過其他途徑影響呼吸道病毒感染，為進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。