井雅朋 黃曉明 吳桐 簡(jiǎn)天明 史雙雙 趙亮 孫豐源 唐東潤(rùn)

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所,天津 300384

甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是以眶脂肪增生和眼外肌纖維化為特征的自身免疫性疾病,與Graves病(Graves disease,GD)密切相關(guān)[1]。TAO的發(fā)病機(jī)制主要涉及眼眶成纖維細(xì)胞(orbital fibroblast,OF)向脂肪細(xì)胞及肌纖維母細(xì)胞的分化[2]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的特異性細(xì)胞因子之一,與其他細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素6、γ干擾素等的相互作用在TAO患者眼眶組織改變過程中發(fā)揮重要作用[3]。雖然已有研究深入探討了TNF-α增加人、大鼠和小鼠3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂解作用以及藥物對(duì)TAO脂肪細(xì)胞分化的抑制作用[4-8],但在TAO中,TNF-α致眼眶脂肪細(xì)胞的去分化作用鮮有報(bào)道。通過KEGG PATHWAY Database網(wǎng)站查詢可知脂肪細(xì)胞成脂分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子信號(hào)通路為ERK1/2-PPARγ-perilipin1,且已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過影響PPARγ的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制脂肪細(xì)胞分化的作用[8]。因此,推測(cè)TNF-α可能直接通過影響脂肪分化信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮其抑制脂肪細(xì)胞分化的作用。本研究通過觀察人OF在TNF-α誘導(dǎo)過程中的形態(tài)學(xué)以及功能的變化,以明確TNF-α是否促進(jìn)TAO患者OF來(lái)源的脂肪細(xì)胞去分化以及其通路機(jī)制,為尋找調(diào)控TAO發(fā)病的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標(biāo)本來(lái)源 收集2019年12月至2020年8月在天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院行眼眶減壓術(shù)的TAO患者6例6眼術(shù)中眼眶脂肪組織,年齡20～50歲,平均35歲。納入標(biāo)準(zhǔn):患者T3、T4、促甲狀腺激素等指標(biāo)正常,并穩(wěn)定半年以上,病情穩(wěn)定期眼球突出影響外觀,出現(xiàn)嚴(yán)重眼表并發(fā)癥,視神經(jīng)受壓,視力急劇下降,除甲狀腺功能異常外無(wú)其他病史,病程1～2年。本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批文號(hào):2019KY(L)-29],所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylanxthine,IBMX)(美國(guó)MCE公司);細(xì)胞組織RNA提取試劑盒(美國(guó)EZB公司);兔抗P44/42 MAPK(ERK1/2)單克隆抗體(137F5)、兔抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)單克隆抗體(Thr202/Tyr204)、兔抗PPARγ單克隆抗體(C26H12)、兔抗perilipin1單克隆抗體(D1D8)、兔抗波形蛋白抗體(ab128507)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司);山羊抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司);牛血清蛋白、Fraction V(上海碧云天生物科技有限公司);2倍濃縮RT-PCR擴(kuò)增混合液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì)有限公司);油紅O染色液(細(xì)胞專用)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。7900HTFAST Q-PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);微量分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

表1 各目的基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for target genes基因正向序列(5'-3')反向序列(5'-3')PPARγGGGATCAGCTCCGTGGATCTTGCACTTTGGTACTCTT-GAAGTTERK1CCAGAGTGGCTATCAAGAAGTCCATGAGGTCCTGAACAAERK2TGCCGTGGAACAGGTTGTTGGGCTCATCACTTGGGTPERILIPIN1GGAGGACGTGGCATGATGACGGCCCTTCCATTCTGCAAGAPDHGGAGCGAGATCCCTC-CAAAATGGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG 注:PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;ERK:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;PERILIPIN:脂肪包被蛋白;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶 Note:PCR:polymerase chain reaction;PPARγ:Peroxisomal proliferation-activated receptor γ;ERK:extracellular regulatory protein kinase;PERILIPIN:fat-coated protein;GAPDH:phosphoglyc-eraldehyde dehydrogenase

1.2 方法

1.2.1人OF的原代培養(yǎng) 將TAO患者眼眶脂肪結(jié)締組織浸泡在PBS中充分洗滌,去除肉眼可見的血管組織,切取純凈脂肪組織,剪成0.5～1 mm3大小均勻的顆粒,加入適量PBS,離心半徑10 cm,1 000 r/min離心10 min。取上層純脂肪顆粒,輕輕地鋪在干燥的25 cm2培養(yǎng)瓶底壁上,放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置40 min,待脂肪顆粒黏附牢固后緩慢加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)液1～2 ml,常規(guī)CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)4 d;更換培養(yǎng)液至5 ml,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng),取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2體外培養(yǎng)OF的免疫熒光鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶液消化,制成單細(xì)胞懸液,接種到預(yù)先放置6 mm×22 mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(直徑35 mm)中,置5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d;待細(xì)胞接近單層融合,取出蓋玻片,浸入PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)洗2次,4%多聚甲醛室溫固定40 min。將細(xì)胞玻片放入蓋片染色缸,置于PBS中振蕩洗滌5 min,取出吹干,滴加抗波形蛋白抗體(1∶500稀釋),置濕盒內(nèi)避光37 ℃孵育60 min或4 ℃冰箱中過夜;置于PBS中振蕩洗滌3次,每次5 min,吹干,滴加熒光素標(biāo)記二抗(1∶100稀釋),在濕盒中37 ℃保溫60 min;置于PBS中振蕩洗滌2次,每次5 min,然后用蒸餾水振蕩洗滌1次;50%緩沖甘油封片,暗室熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3體外培養(yǎng)OF的成脂分化及鑒定 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OF,胰蛋白酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml并接種于6孔板中,每孔2 ml,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)基本融合后,換用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液1(含0.25 mmol/L IBMX、10 μg/ml胰島素、1 μmol/L地塞米松的不完全培養(yǎng)液)進(jìn)行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng),每3 d換液1次;換液2次后,用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液2(含10 μg/ml胰島素、1 μmol/L地塞米松的不完全培養(yǎng)液)繼續(xù)誘導(dǎo)至第14天,倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的分化成脂情況。移除細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗2次,參照油紅O染色液(細(xì)胞專用)試劑盒步驟加入油紅O染色固定液固定30 min;蒸餾水洗2次,加入60%異丙醇浸洗5 min;棄去異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液浸染20 min;流水清洗2～5次,直到無(wú)多余染色液,加入Mayer蘇木素染色液,復(fù)染核1～2 min;流水清洗2～5次,加入油紅O染色緩沖液室溫孵育1 min后棄去;加入蒸餾水覆蓋細(xì)胞并在倒置顯微鏡下觀察,中性脂肪呈橘紅色或橙紅色,磷脂呈粉紅色,細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.2.4OF成脂后的去分化誘導(dǎo) 使用簡(jiǎn)單隨機(jī)分組法,將成脂分化第14天細(xì)胞隨機(jī)分為4個(gè)組,培養(yǎng)液分別換成含0、0.1、1.0、10.0 μg/L TNF-α的完全培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于誘導(dǎo)第0、6、10、18、24、28天倒置顯微鏡下固定視野觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含脂滴細(xì)胞的變化情況,并于脂肪細(xì)胞去分化第20天再次行油紅O染色,顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PPARγ、ERK1、ERK2及perilipin1 mRNA的表達(dá) 取原代OF細(xì)胞、分化第14天及去分化第20天細(xì)胞,分別提取細(xì)胞總mRNA。使用微量分光光度計(jì)測(cè)量所提取總RNA的濃度,逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA;以cDNA為模板,行熒光定量PCR檢測(cè),擴(kuò)增體系為10 μl。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán)。各目的基因引物設(shè)計(jì)見表1,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次,以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測(cè)PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白的表達(dá)

取原代、分化第14天及去分化第20天的細(xì)胞用預(yù)冷PBS沖洗3次,根據(jù)每孔細(xì)胞數(shù)量加入50～100 μl蛋白裂解液,冰上靜置約10 min后用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于1.5 ml EP管中,吹打20次,冰上靜置20 min,重復(fù)2次后4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,收集上清液于新EP管中。測(cè)定總蛋白濃度后加入50 μl 5倍蛋白上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,取20 μl蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜;取出膜置于封閉液(其中PPARγ、T-ERK1/2、perilipin1、GAPDH使用5%脫脂奶粉封閉,P-ERK1/2使用5%牛血清白蛋白封閉)中,室溫?fù)u床上輕搖2 h;將ERK1/2、P-ERK1/2、PPARγ、perilipin1和GAPDH單克隆抗體加入封閉液中,稀釋比例均為1∶1 000,4 ℃孵育過夜;PBS洗膜3次后用山羊抗兔IgG室溫?fù)u床上輕搖1 h;再次洗膜3次后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參照,計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)人OF的形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察,原代培養(yǎng)第4天可見少量細(xì)胞從眼眶脂肪結(jié)締組織塊邊緣長(zhǎng)出(圖1A);培養(yǎng)第14天可見細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部,細(xì)胞呈梭形或多角形細(xì)胞,增生融合,呈旋渦狀排列(圖1B)。免疫熒光結(jié)果顯示,細(xì)胞波形蛋白染色陽(yáng)性,表明培養(yǎng)細(xì)胞屬于成纖維細(xì)胞(圖1C)。

圖1 人OF的形態(tài)觀察及免疫熒光鑒定 A:原代培養(yǎng)至第4天,倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣少量梭形或多角形細(xì)胞,貼壁生長(zhǎng)(×200,標(biāo)尺=200 μm) B:原代培養(yǎng)培養(yǎng)至第14天,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞融合,呈旋渦狀排列(×100,標(biāo)尺=500 μm) C:原代培養(yǎng)細(xì)胞波形蛋白的免疫熒光染色呈陽(yáng)性(異硫氰酸熒光素 ×200,標(biāo)尺=200 μm)

2.2 OF的成脂分化及鑒定

光學(xué)顯微鏡下觀察可見,誘導(dǎo)分化后24 h,OF表現(xiàn)為細(xì)胞回縮,細(xì)胞間隙增大,增生逐漸停止,細(xì)胞形態(tài)漸變?yōu)闄E圓形或圓形,細(xì)胞體積逐漸增大;誘導(dǎo)分化第6天,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微細(xì)脂滴樣結(jié)構(gòu);誘導(dǎo)分化第10天,可見較多細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)細(xì)小、排列緊密的脂滴樣結(jié)構(gòu),光學(xué)顯微鏡下呈透亮的脂肪滴樣,小脂滴聚集融合成較大脂滴,可見含有脂滴樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞數(shù)量增加;誘導(dǎo)分化第14天,可見部分細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,而剩余未分化的細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)明顯脂滴(圖2A)。分化第14天,細(xì)胞油紅O染色顯示,部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等紅色脂肪滴,部分脂滴分泌出細(xì)胞外(圖2B)。

圖2 體外培養(yǎng)OF細(xì)胞成脂分化及油紅O染色鑒定(×400,標(biāo)尺=100 μm) A:誘導(dǎo)分化第14天,部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有脂滴樣結(jié)構(gòu)(實(shí)線箭頭),另一部分細(xì)胞呈圓形或橢圓形,細(xì)胞質(zhì)中無(wú)脂滴樣結(jié)構(gòu)(虛線箭頭) B:分化第14天油紅O染色顯示,部分細(xì)胞的胞質(zhì)中可見大小不等的紅色著染脂肪滴,脂肪滴包裹細(xì)胞核,并將細(xì)胞核推擠到胞質(zhì)的一側(cè),部分脂滴分泌出細(xì)胞外

2.3 OF成脂后的去分化誘導(dǎo)及鑒定

0 μg/L TNF-α組去分化誘導(dǎo)后6、10、20 d細(xì)胞質(zhì)中脂滴大小未見明顯變化。相比于0 μg/L TNF-α組,0.1 μg/L TNF-α組、1.0 μg/L TNF-α組、10.0 μg/L TNF-α組去分化誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)中脂滴減小,數(shù)量減少,其中10.0 μg/L TNF-α組脂肪細(xì)胞去分化效果最明顯,去分化20 d細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴基本消失,細(xì)胞生長(zhǎng)融合(圖3)。10.0 μg/L TNF-α組去分化20 d細(xì)胞質(zhì)中未見明顯油紅O染料著染(圖4)。

圖3 不同濃度TNF-α完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)TAO眼眶成熟脂肪細(xì)胞去分化過程 (×200,標(biāo)尺=100 μm) 0 μg/L TNF-α組去分化誘導(dǎo)后細(xì)胞質(zhì)中脂滴大小未見明顯變化。0.1 μg/L TNF-α、1.0 μg/L TNF-α、10.0 μg/L TNF-α組去分化誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中脂滴減小,數(shù)量減少,其中10.0 μg/L TNF-α組脂肪細(xì)胞去分化效果最明顯,在去分化20 d細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂滴基本消失,細(xì)胞生長(zhǎng)融合 TNF:腫瘤壞死因子

圖4 眼眶成熟脂肪細(xì)胞去分化20 d油紅O染色(×200,標(biāo)尺=200 μm) 未見明顯油紅O染料著染

2.4 各組PPARγ、ERK1、ERK2及perilipin1 mRNA的表達(dá)比較

原代組、分化14 d組和去分化20 d組細(xì)胞中PPARγ、ERK1、ERK2、perilipin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=574.099、15.378、148.330、370.435,均P<0.01)。分化14 d組細(xì)胞中PPARγ、ERK1、ERK2和perilipin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于原代組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);去分化20 d組細(xì)胞中PPARγ、ERK2、perilipin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯低于分化14 d組,perilipin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于原代組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表2)。

2.5 各組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白的表達(dá)比較

分化14 d組P-ERK1/2、PPARγ和perilipin1蛋白電泳條帶灰度值較原代組明顯增強(qiáng);去分化20 d組P-ERK1/2、PPARγ和perilipin1蛋白電泳條帶灰度值明顯減弱,低于分化14 d組(圖5)。各組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=368.600、108.500、325.700,均P<0.001),其中分化14 d組各蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于原代組和去分化20 d組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)(表3)。

圖5 Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá) 分化14 d組perilipin1、PPARγ、P-ERK1/2蛋白條帶灰度均明顯強(qiáng)于原代組和去分化20 d組 P-ERK:磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;T-ERK:總細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;perilipin:脂肪包被蛋白;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶

3 討論

OF是TAO免疫應(yīng)答中主要的自身免疫靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞,在TAO的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[9-10]。近年來(lái),關(guān)于不同細(xì)胞因子及藥物對(duì)OF增生、分泌、分化影響的研究已較為廣泛而深入[11-14]。目前,人OF的體外培養(yǎng)方法主要為組織塊法和酶消化法,由于組織塊法具有操作簡(jiǎn)便、需要的組織標(biāo)本量少等特點(diǎn),故本研究中采取組織塊法培養(yǎng)人OF來(lái)進(jìn)行分化及去分化的研究。

表2 原代組、分化14 d組、去分化20 d組細(xì)胞中PPARγ、ERK1、ERK2、perilipin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(x±s)Table 2 Comparison of expression levels of PPARγ,ERK1,ERK2 andperilipin1 mRNA among primary group,14-day differentiationgroup and 20-day dedifferentiation group (x±s)組別樣本量PPAR-γERK1ERK2perilipin1原代組31.00±0.091.05±0.191.00±0.101.05±0.07分化14 d組34.26±0.09a2.01±0.09a3.23±0.10a8.69±0.33a去分化20 d組31.06±0.03b1.73±0.041.15±0.11b6.27±0.09abF值574.09915.378148.330370.435P值<0.0010.0260.001<0.001 注:與原代組比較,aP<0.05;與分化14 d組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;ERK:細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;perilipin:脂肪包被蛋白 Note:Compared with primary group,aP<0.05;compared with 14-day differentiation group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) PPARγ:peroxisomal proliferation-activated receptor γ;ERK:extracel-lular regulatory protein kinase;perilipin:fat-coated protein

表3 原代組、分化14 d組及去分化20 d組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白表達(dá)比較(x±s)Table 3 Comparison of expression of PPARγ,P-ERK1/2and perilipin1 proteins among primary group,14-daydifferentiation group and 20-day dedifferentiation group (x±s)組別樣本量PPARγP-ERK1/2perilipin1原代組30.37±0.020.29±0.020.00±0.00分化14 d組31.07±0.03a1.00±0.03a1.13±0.02a去分化20 d組30.20±0.02b0.38±0.06b0.00±0.00F值368.600108.500325.700P值<0.001<0.001<0.001 注:與原代組比較,aP<0.001;與分化14 d組比較,bP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;P-ERK:磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;perilipin:脂肪包被蛋白 Note:Compared with primary group,aP<0.001;compared with 14-day dif-ferentiation group,bP<0.001 (One-way ANOVA,LSD-t test) PPARγ:peroxisomal proliferation-activated receptor γ;P-ERK:phosphorylated extra-cellular regulatory protein kinase;perilipin:fat-coated protein

研究結(jié)果表明,依據(jù)Thy-1抗原(CD90)表達(dá)的不同,可將OF分為可轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的Thy-1+成纖維細(xì)胞和可轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞的Thy-1-成纖維細(xì)胞[15]。在本實(shí)驗(yàn)中,通過使用胰島素、地塞米松和IBMX對(duì)原代培養(yǎng)的OF進(jìn)行成脂誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)至第14天時(shí)部分細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞,而另一部分細(xì)胞僅表現(xiàn)為形態(tài)上變圓,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未出現(xiàn)脂滴樣結(jié)構(gòu),最終未能被誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。該結(jié)果提示TAO患者眼眶中同時(shí)存在Thy-1+和Thy-1-的OF。

去分化是指一個(gè)終末分化的細(xì)胞退回到其所在細(xì)胞譜系中一個(gè)低分化狀態(tài)的過程,去分化的細(xì)胞可以進(jìn)入細(xì)胞周期、分裂增生,也可以再分化為成熟細(xì)胞[16]。經(jīng)成熟脂肪細(xì)胞去分化后所得到的細(xì)胞被稱為去分化脂肪細(xì)胞,其具有多向分化潛能,經(jīng)過體外誘導(dǎo)后可向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化[17-18];去分化脂肪細(xì)胞還可作為組織工程和干細(xì)胞移植的優(yōu)良干細(xì)胞來(lái)源,在治療缺血性心臟病、骨缺損疾病、腎臟疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種臨床疾病方面有較好應(yīng)用前景[19-21]。在本實(shí)驗(yàn)中,使用TNF-α可誘導(dǎo)OF分化的脂肪細(xì)胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,即細(xì)胞逐漸由圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形,細(xì)胞內(nèi)的脂滴逐漸減小,含有脂滴的細(xì)胞也逐漸減少。

TNF-α作為T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子之一,參與TAO眼眶炎癥、纖維化及脂肪增生等多個(gè)病理過程,并與其他細(xì)胞因子相互作用,共同影響TAO的發(fā)生和發(fā)展[3]。有研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化血管內(nèi)皮下脂肪細(xì)胞表面標(biāo)志物和相關(guān)功能基因,如PPARγ的表達(dá)[22-23];其還可影響脂肪細(xì)胞分化,表現(xiàn)為破壞前脂肪細(xì)胞的分化,同時(shí)誘導(dǎo)成熟脂肪細(xì)胞發(fā)生去分化,加速脂肪細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞的凋亡[24-26]。在本實(shí)驗(yàn)中,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)成脂分化過程中ERK1/2、PPARγ、perilipin1 mRNA和蛋白表達(dá)量均增加,而隨著TNF-α干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),相關(guān)脂肪分化通路基因和蛋白表達(dá)量逐漸減少,推測(cè)TNF-α可能通過下調(diào)脂肪分化信號(hào)通路中PPARγ、ERK1/2及perilipin1基因的表達(dá)影響眼眶成熟脂肪細(xì)胞的分化,從而對(duì)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生去分化的作用。

綜上所述,本研究表明TNF-α具有抑制TAO眼眶脂肪細(xì)胞分化的潛能,可促使TAO眼眶脂肪細(xì)胞發(fā)生去分化現(xiàn)象,其機(jī)制可能與下調(diào)ERK1/2-PPARγ-perilipin1信號(hào)通路有關(guān)。本研究為后期進(jìn)一步探索TAO眼眶脂肪異常增生的機(jī)制以及優(yōu)化治療手段提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)脂肪細(xì)胞分化通路中PPARγ、P-ERK1/2和perilipin1這3個(gè)基因和蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行探索,未來(lái)需對(duì)該通路其他基因和蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行較全面的研究,以進(jìn)一步明確TNF-α致脂肪細(xì)胞去分化的通路機(jī)制;同時(shí),針對(duì)TNF-α誘導(dǎo)去分化形成的成纖維樣細(xì)胞功能及生物學(xué)行為變化,以及TNF-α是否通過影響其他通路蛋白的表達(dá)間接影響脂肪細(xì)胞的分化等問題均有待進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明井雅朋:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究實(shí)施、文章起草及修改;黃曉明、吳桐:參與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究實(shí)施;簡(jiǎn)天明、史雙雙、趙亮:參與研究實(shí)施及統(tǒng)計(jì)分析;孫豐源、唐東潤(rùn):實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、對(duì)本文的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱