趙茹 羅晉媛 賀濤 邢怡橋

武漢大學(xué)人民醫(yī)院眼科中心,武漢 430060

青光眼是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致視力不可逆喪失的重要原因,以視神經(jīng)的進行性退化和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的不可逆喪失為特征[1]。降低眼壓是目前青光眼唯一的有效治療手段,然而部分患者在眼壓控制正常的情況下,病程仍在進展[2]。有研究表明,在遺傳性青光眼動物模型視神經(jīng)損傷前就可在視神經(jīng)中檢測到促炎性單核細(xì)胞[3-4]。除此之外,在一過性高眼壓動物模型中,視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活[4]。而抑制青光眼模型中膠質(zhì)細(xì)胞的活化,可顯著減少RGCs的死亡和軸突變性[5-6]。因此,在青光眼疾病發(fā)展過程中,除高眼壓對RGCs的機械性損傷外,神經(jīng)炎癥可能也是導(dǎo)致RGCs死亡的重要原因[7]。小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)炎癥相關(guān)的主要效應(yīng)細(xì)胞,是視網(wǎng)膜常駐免疫細(xì)胞,共同維持視網(wǎng)膜微環(huán)境的穩(wěn)定,其中小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著核心作用[8]。根據(jù)小膠質(zhì)細(xì)胞功能,可將其分為經(jīng)典激活型(M1型)和交替激活型(M2型);M1型小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有破壞性,釋放炎癥因子和活性氧,加劇組織損傷,而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為具有保護性,吞噬組織碎片,促進組織修復(fù)[9]。促進M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化能最大程度上減輕神經(jīng)毒性,促進組織恢復(fù)。載脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成的主要載脂蛋白,對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用,與神經(jīng)炎癥等密切相關(guān)[10-11]。COG1410是一種APOE受體結(jié)合域的模擬短肽,因其具有與APOE全蛋白相同的受體結(jié)合能力并且可自由透過血-腦屏障,而被用于神經(jīng)系統(tǒng)的治療研究,是一種具有轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景的中樞神經(jīng)保護劑[12-16]。目前尚未發(fā)現(xiàn)有研究探索COG1410在青光眼中的作用。本研究擬通過構(gòu)建視網(wǎng)膜缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,IR)模型,探討COG1410對視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞極化及RGCs存活的作用及其機制,以期為青光眼治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性8～10周齡C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18～23 g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供[許可證號:SYSK(鄂)2015-0027],飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)(明/暗循環(huán):12 h/12 h)清潔環(huán)境,動物飼養(yǎng)及實驗操作嚴(yán)格遵從《湖北省實驗動物管理條例》,并獲得武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)[批文號:WDRM動(福)第20190113號]。

1.1.2主要試劑及儀器 兔抗小鼠離子鈣結(jié)合銜接分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)抗體(日本W(wǎng)ako公司);大鼠抗小鼠CD16/32抗體(美國BD Pharmingen公司);羊抗小鼠CD206抗體(美國R&D Systems公司)、兔抗小鼠腦特異同源染色體/POU 結(jié)構(gòu)域蛋白3A(brain-specific homeobox/POU domain protein 3A,Brn3a)抗體(德國Synaptic Systems公司);兔抗小鼠核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB) 抗體、兔抗小鼠B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、兔抗小鼠Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)抗體(美國Cell Signaling Technology公司);驢抗兔和驢抗羊AlexaFluor 594 IgG、驢抗兔AlexaFluor 488 IgG(美國Jackson公司);驢抗大鼠AlexaFluor 647 IgG(武漢安特捷生物技術(shù)有限公司);兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP-標(biāo)記的驢抗羊IgG (武漢塞維爾生物科技有限公司);TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。CM1900冰凍切片機(德國Leica公司);FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡、BX51正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗小鼠的分組處理 采用隨機數(shù)字表法將18只小鼠分為正常對照組6只、IR 3 d組6只、IR 7 d組3只和IR 14 d組3只,其中IR 3 d組、IR 7 d組、IR 14 d組小鼠建立視網(wǎng)膜IR模型,根據(jù)分組分別于造模后3、7和14 d處死并觀察模型眼不同表型小膠質(zhì)細(xì)胞變化。采用隨機數(shù)字表法將91只小鼠分為正常對照組19只、IR組24只、生理鹽水組24只和COG1410組24只,其中IR組、生理鹽水組和COG1410組小鼠均建立右眼視網(wǎng)膜IR損傷模型,正常對照組小鼠將針頭插入前房后,維持正常眼壓1 h;剔除損傷虹膜、晶狀體及感染的小鼠。按照文獻(xiàn)中的劑量及方法給藥,COG1410組和生理鹽水組分別于造模結(jié)束后每日尾靜脈注射200 μl COG1410生理鹽水溶液(1 mg/kg)和等體積生理鹽水,連續(xù)給藥3 d[14]。

1.2.2小鼠視網(wǎng)膜IR模型的制作 按照文獻(xiàn)[17-18]中的方法構(gòu)建IR損傷動物模型,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠(40 mg/kg),使用碘伏棉球消毒眼周,以5%復(fù)方托吡卡胺滴眼液擴瞳,0.01%丙美卡因滴眼液進行表面麻醉。待瞳孔散大后使用生理鹽水裝置連接32G針頭,顯微鏡下將針頭小心地插入前房,灌注開始可見眼球膨大、紅光反射消失,維持100 mmHg眼壓1 h,小心退出針頭,角膜和結(jié)膜出現(xiàn)水腫,即為造模成功。操作過程中避免損傷虹膜及晶狀體組織,造模過程中避免生理鹽水外漏。

1.2.3免疫熒光染色法觀察各組小膠質(zhì)細(xì)胞的分布情況 正常對照組和IR 3 d組各任意選取3只小鼠,在異氟烷氣體麻醉狀態(tài)下行頸椎脫臼法處死,摘取眼球,1 ml注射器針頭于角膜上戳一小孔,室溫下4%多聚甲醛固定1 h,顯微鏡下去除眼前節(jié)及玻璃體,置于30%蔗糖溶液中4 ℃過夜,使用OCT包埋劑包埋,沿視盤制成14 μm厚冰凍切片。取冰凍切片,用含5%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)于室溫封閉2 h,抗Iba1抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,PBS洗滌3次,每次10 min;AlexaFluor 488 IgG二抗(1∶500)室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,每次10 min,再使用DAPI室溫染核10 min,抗熒光淬滅劑封片,正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4免疫熒光染色法觀察視網(wǎng)膜組織M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞及RGC數(shù)量 取正常對照組14只、IR 3 d組14只、IR 7 d組3只、IR 14 d組3只、生理鹽水組11只、COG1410組11只小鼠,在異氟烷氣體麻醉狀態(tài)下行頸椎脫臼法處死,摘取眼球,室溫下4%多聚甲醛固定1 h,顯微鏡下去除眼前節(jié)及玻璃體,完整地取出視網(wǎng)膜。取分離的視網(wǎng)膜用含5%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的PBS于4 ℃封閉過夜;置于Iba1抗體(1∶1 000)與CD16/32抗體(1∶100)行雙重免疫熒光標(biāo)記;置于Iba1抗體(1∶1 000)與CD206抗體(1∶20)行雙重免疫熒光標(biāo)記;Brn3a抗體(1∶1 000)標(biāo)記RGCs,4 ℃孵育72 h,PBS洗滌3次,每次20 min;置于相應(yīng)AlexaFluor 594 IgG(1∶500)、AlexaFluor 488 IgG(1∶500)、AlexaFluor 647(1∶300)二抗中室溫孵育2 h,PBS洗滌3次,每次20 min。在距視盤1/2～2/3處將視網(wǎng)膜剪成四葉草形狀并進行鋪片,吸干多余水分,抗熒光淬滅劑封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡在200倍視野下觀察,每瓣即為1個象限,每個象限任意選取2個視野,自RGCs層到色素上皮層共掃描5個層面,應(yīng)用ImageJ軟件對視網(wǎng)膜全層小膠質(zhì)細(xì)胞進行計數(shù),以CD16/32+Iba1+細(xì)胞數(shù)量/Iba1+細(xì)胞數(shù)量百分比(%)來表示M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例,CD206+Iba1+細(xì)胞數(shù)量/Iba1+細(xì)胞數(shù)量百分比(%)來表示M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例。使用正置熒光顯微鏡在400倍視野下觀察,每一象限任意選取3個視野,應(yīng)用ImageJ軟件對Brn3a陽性染色細(xì)胞進行計數(shù),以IR組、生理鹽水組和COG1410組存活的RGC數(shù)目與正常對照組RGC數(shù)目的比值來表示RGC存活率。

1.2.5實時熒光定量PCR法檢測各組視網(wǎng)膜TNF-α、IL-1β mRNA的表達(dá)情況 取正常對照組、IR組、生理鹽水組和COG1410組小鼠各5只,于IR造模后3 d處死,在無RNA酶條件下分離小鼠視網(wǎng)膜,按照說明書提取RNA,并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green 試劑盒(南京諾唯贊生物科技公司)進行逆轉(zhuǎn)錄PCR,IL-1β上游引物為5'-GGCAGCTACCTGT GTCTTTC-3',下游引物為5'-CGAGGCTTTTTTGTTGTT CA-3';TNF-α上游引物為5'-AGACCCTCACACTCAGA TCA-3',下游引物為5'-GTAGACAAGGTACAACCCAT-3';β-actin上游引物為5'-GAAGTCCCTCACCCTCCCAA-3',下游引物為5'-GGCATGGACGCGACCA-3'。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火及延伸30 s,反應(yīng)循環(huán)40次。熔解曲線程序:95 ℃解鏈15 s,逐漸降溫至60 ℃維持1 min,升溫至95 ℃維持15 s。以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-△△Ct計算IL-1β、TNF-α mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.6TUNEL染色法觀察各組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞 取正常對照組、IR組、生理鹽水組、COG1410組各3只小鼠,在異氟烷氣體麻醉狀態(tài)下行頸椎脫臼法處死,摘取眼球,1 ml注射器針頭于角膜上戳一小孔,室溫下4%多聚甲醛固定1 h,顯微鏡下去除眼前節(jié)及玻璃體后置于30%蔗糖溶液中,4 ℃過夜,使用OCT包埋劑包埋,制成14 μm厚冰凍切片。參照TUNEL試劑盒說明書,將冰凍切片置于4%多聚甲醛室溫固定30 min,PBS洗滌3次,每次10 min;使用含0.5% TritonX-100的PBS溶液室溫孵育5 min,PBS洗滌3次,每次10 min;使用TUNEL檢測液于37 ℃避光孵育1 h,PBS洗滌3次,每次10 min;DAPI室溫孵育10 min,抗熒光淬滅劑封片。使用激光掃描共聚焦顯微鏡于200倍視野下觀察,連續(xù)取6個視野進行拍照,采用ImageJ軟件對凋亡細(xì)胞進行計數(shù)。

1.2.7Western blot法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜NF-κB、Bax、Bcl2蛋白表達(dá)水平 取正常對照組、IR組、生理鹽水組和COG1410組小鼠各5只,于IR造模后3 d取模型眼,置于冰上剖取視網(wǎng)膜組織,迅速置于裂解液中,使用超聲裂解儀進行裂解(超聲能量25%,超聲5 s停3 s,共5個循環(huán)),離心后收集上清,BCA蛋白定量法測定總蛋白濃度;取蛋白進行10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜并于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,分別置于抗NF-κB抗體(1∶1 000)、抗Bax抗體(1∶1 000)、抗Bcl2抗體(1∶500)、抗GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜;充分漂洗后,將膜置于相應(yīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、驢抗羊IgG中室溫孵育1 h;充分漂洗后,參照化學(xué)發(fā)光試劑盒于化學(xué)發(fā)光儀下顯影。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參照,計算各目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 正常對照組與IR 3 d組小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞分布比較

各組Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞主要分布在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層;與正常對照組比較,IR 3 d組的Iba1表達(dá)明顯增強(圖1)。

圖1 各組視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞分布情況 (AlexaFluor 488 ×400,標(biāo)尺=50 μm) 細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞呈綠色熒光,各組中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)叢狀層、外叢狀層均可見Iba1陽性染色,其中IR組的Iba1熒光強度明顯高于正常對照組 IR:缺血-再灌注;DAPI:4',6-二脒基-2-苯基吲哚;Iba1:離子鈣結(jié)合銜接分子1;GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;IPL:內(nèi)叢狀層;OPL:外叢狀層

2.2 IR造模后不同時間點小鼠視網(wǎng)膜M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變化

隨著IR造模后時間的延長,小膠質(zhì)細(xì)胞由靜息態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài),表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目增多,細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆印Ｕφ战M、IR 3 d組、IR 7 d組、IR 14 d組的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為(4.25±0.57)%、(65.26±10.43)%、(13.68±0.39)%和(8.05±0.36)%,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為(4.50±0.20)%、(11.47±0.24)%、(14.38±0.92)%和(9.37±0.50)%,總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.83、57.62,均P<0.001)。IR 3 d組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯高于正常對照組,IR 3 d組、IR 7 d組、IR 14 d組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例明顯高于正常對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)(圖2)。

圖2 IR造模后各不同時間小鼠視網(wǎng)膜組織中M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較 A:各組視網(wǎng)膜組織M1型小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200,標(biāo)尺=25 μm) CD16/32陽性染色為紅色熒光(Alexa Fluor 647),Iba1陽性染色為綠色熒光(Alexa Fluor 488),融合圖中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞呈黃色熒光;正常對照組中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞較少,IR 3 d組、IR 7 d組和IR 14 d組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多,其中IR 3 d組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目最多 B:各組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞百分比比較 F=29.83,P<0.001.與正常對照組比較,aP<0.001(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=3) C:各組視網(wǎng)膜組織M2型小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200,標(biāo)尺=25 μm) CD206陽性染色為紅色(Alexa Fluor 594),Iba1陽性染色為綠色(Alexa Fluor 488),融合圖中M2型小膠質(zhì)細(xì)胞呈黃色;正常對照組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較少,IR 3 d組、IR 7 d組、IR 14 d組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增多,其中IR 7 d組的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目最多 D:各組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞百分比比較 F=57.62,P<0.001.與正常對照組比較,aP<0.01,bP<0.001(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=3) Iba1:離子鈣結(jié)合銜接分子1;IR:缺血-再灌注

2.3 各處理組小鼠視網(wǎng)膜組織M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目比較

IR損傷后3 d,正常對照組、IR組、生理鹽水組、COG1410組視網(wǎng)膜組織M1型小膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為(4.25±0.57)%、(65.26±10.43)%、(63.01±4.93)%和(33.13±4.46)%,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞比例分別為(4.50±0.20)%、(11.47±0.24)%、(11.75±0.17)%和(38.93±4.26)%,總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.33、50.82,均P<0.05),其中IR組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較正常對照組明顯增多,COG1410組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較IR組明顯減少,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較IR組明顯增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

圖3 各處理組小鼠視網(wǎng)膜組織中M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較 A:各組視網(wǎng)膜組織M1型小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200,標(biāo)尺=25 μm) CD16/32陽性染色為紅色熒光(Alexa Fluor 647),Iba1陽性染色為綠色熒光(Alexa Fluor 488),融合圖中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞呈黃色熒光;正常對照組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較少,IR組、生理鹽水組M1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較正常對照組明顯增多,COG1410組M1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較IR組、生理鹽水組明顯減少 B:各組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞百分比比較 F=23.33,P<0.05.與IR組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=3) C:各組視網(wǎng)膜組織M2型小膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光染色(×200,標(biāo)尺=25 μm) CD206陽性染色呈紅色熒光(Alexa Fluor 594),Iba1陽性染色呈綠色熒光(Alexa Fluor 488),融合圖中M2型小膠質(zhì)細(xì)胞呈黃色熒光,正常對照組、IR組、生理鹽水組的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較少,COG1410組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目較IR組、生理鹽水組明顯增多 D:各組M2型小膠質(zhì)細(xì)胞百分比比較 F=50.82,P<0.05.與IR組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=3) Iba1:離子鈣結(jié)合銜接分子1;IR:缺血-再灌注

2.4 各處理組小鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs存活率比較

視網(wǎng)膜鋪片Brn3a免疫熒光染色顯示,COG1410組RGCs數(shù)量多于IR組(圖4A)。正常對照組、IR組、生理鹽水組和COG1410組的RGCs存活率分別為(100.00±4.58)%、(54.30±9.69)%、(56.09±7.69)%和(77.60±8.10)%,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.77,P<0.05),其中IR組RGCs存活率明顯低于正常對照組和COG1410組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01);IR組和生理鹽水組的RGCs存活率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4B)。

圖4 各處理組小鼠視網(wǎng)膜RGCs情況 A:Brn3a免疫熒光染色觀察視網(wǎng)膜RGCs情況(Alexa Fluor 594 ×400,標(biāo)尺=50 μm) 正常對照組Brn3a陽性細(xì)胞數(shù)量多且排列緊密,IR組及生理鹽水組Brn3a陽性細(xì)胞數(shù)量較正常對照組減少,排列疏松,COG1410組的Brn3a陽性細(xì)胞數(shù)量較IR組和生理鹽水組增多 A1:正常對照組 A2:IR組 A3:生理鹽水組 A4:COG1410組 B:各組小鼠視網(wǎng)膜RGCs存活率比較 F=30.77,P<0.05.與IR組比較,aP<0.01,bP<0.001(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=5) RGC:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞;IR:缺血-再灌注

2.5 各處理組視網(wǎng)膜TNF-α和IL-1β mRNA相對表達(dá)量比較

IR組、生理鹽水組、COG1410組TNF-α mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.34、0.92±0.13、0.30±0.06;IL-1β mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.33、1.03±0.39、0.32±0.16,總體比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.52、6.47,均P<0.05),其中,COG1410組TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)量較IR組明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖5)。

圖5 各組視網(wǎng)膜TNF-α和IL-1β mRNA相對表達(dá)量比較 A:TNF-α mRNA相對表達(dá)量比較 F=12.52,P<0.05.與IR組比較,aP<0.01 B:IL-1β mRNA相對表達(dá)量比較 F=6.47,P<0.05.與IR組比較,aP<0.05(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=5) TNF:腫瘤壞死因子;IL:白細(xì)胞介素;IR:缺血-再灌注

2.6 各處理組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色結(jié)果顯示,COG1410組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層和外核層細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于IR組和生理鹽水組(圖6A)。正常對照組、IR組、生理鹽水組、COG1410組的凋亡細(xì)胞數(shù)目分別為(4.33±0.47)、(148.30±13.40)、(170.67±36.43)和(67.00±11.05)個/mm2,總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.72,P<0.001),其中與正常對照組比較,IR組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞明顯高于正常對照組和COG1410組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);IR組與生理鹽水組凋亡細(xì)胞數(shù)目比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖6B)。

圖6 各組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較(×400,標(biāo)尺=50 μm) A:各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞TUNEL染色 凋亡細(xì)胞呈綠色熒光(TUNEL),細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(DAPI),正常對照組視網(wǎng)膜各層未見凋亡細(xì)胞,IR組、生理鹽水組凋亡細(xì)胞明顯增多,主要集中在外核層,其他層散在可見,COG1410組凋亡細(xì)胞數(shù)量較IR組和生理鹽水組減少 B:各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較 F=28.72,P<0.001.與IR組比較,aP<0.05,bP<0.001(單因素方差分析,Bonferroni檢驗,n=3) TUNEL:原位末端標(biāo)記法;DAPI:4'-6-二脒基-2-苯基吲哚;IR:缺血-再灌注;GCL:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層;INL:內(nèi)核層;ONL:外核層;IR:缺血-再灌注

2.7 各處理組小鼠視網(wǎng)膜NF-κB、Bax、Bcl2蛋白表達(dá)比較

各組視網(wǎng)膜NF-κB、Bax蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl2比值總體比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=13.02、7.94、7.58,均P<0.01),其中與正常對照組比較,IR組NF-κB、Bax蛋白相對表達(dá)量和Bax/Bcl2比值均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與IR組比較,COG1410組NF-κB、Bax蛋白相對表達(dá)量及Bax/Bcl2比值均明顯降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);IR組與生理鹽水組NF-κB、Bax蛋白相對表達(dá)量以及Bax/Bcl2比值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)(圖7,表1)。各組Bcl2蛋白相對表達(dá)量總體比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.78,P>0.05)。

圖7 各組別小鼠視網(wǎng)膜中NF-κB、Bax、Bcl-2蛋白Western blot電泳圖 IR組NF-κB、Bax蛋白電泳條帶灰度強于其他組 NF-κB:核因子κB;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶;IR:缺血-再灌注

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,APOE主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌,其與神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相互作用而被脂質(zhì)化,形成高密度脂蛋白,運輸脂質(zhì)至神經(jīng)元,從而維持中樞系統(tǒng)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[10]。在缺血性腦損傷動物模型中,APOE可減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng),具有神經(jīng)保護的潛力[19]。然而,外源性APOE相對分子質(zhì)量較大,無法通過血-腦屏障,因而難以實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化。COG1410是一種衍生于APOE受體結(jié)合域的模擬短肽,其相對分子質(zhì)量較小,具有與APOE全蛋白相同的受體結(jié)合能力,并且可自由透過血-腦屏障,被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究[20]。血-眼屏障和血-腦屏障對物質(zhì)的轉(zhuǎn)運具有相似性[21-22],為探討COG1410全身給藥是否對青光眼具有神經(jīng)保護作用提供了可能。在創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷的動物模型中,尾靜脈注射COG1410對RGC及視功能表現(xiàn)出良好的保護作用[15]。本研究通過尾靜脈注射COG1410,探討其對IR損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞及RGCs的作用及機制。

視網(wǎng)膜IR是常見的青光眼及視網(wǎng)膜缺血缺氧疾病的研究模型[23]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞,是組織面對刺激、感染時的第一道防線。小膠質(zhì)細(xì)胞受刺激可活化為M1型或M2型,M1型小膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子,加重神經(jīng)炎癥,同時炎癥因子又可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞進一步向M1型極化;而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬組織碎片,加速炎癥消退,促進組織愈合,發(fā)揮抗炎作用[24]。當(dāng)視網(wǎng)膜血流中斷,視網(wǎng)膜代謝發(fā)生紊亂,血流再灌注時產(chǎn)生自由基和炎性細(xì)胞因子,激活小膠質(zhì)細(xì)胞趨向于M1表型,M2表型小膠質(zhì)細(xì)胞可釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,在損傷后重建神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用,隨著時間的延長,炎癥反應(yīng)逐漸消退,小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變,以促進后期神經(jīng)功能恢復(fù)[25]。本研究結(jié)果也顯示,正常視網(wǎng)膜只有少量M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞,而IR損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活,其中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞在IR損傷后3 d增多最為顯著,隨后出現(xiàn)逐漸回落,而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞在損傷后7 d增多最為顯著,并隨時間的推移逐漸減少,提示M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的激活主要發(fā)生在IR損傷的早期階段,而M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的激活主要發(fā)生在中晚期階段。因此,通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化以改善視網(wǎng)膜炎癥微環(huán)境可能成為治療青光眼及視網(wǎng)膜缺血缺氧疾病的新方向。

表1 各組小鼠視網(wǎng)膜中NF-κB、Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2蛋白相對表達(dá)量比較(x±s)Table 1 Comparison of the relative expressions of NF-κB,Bax,Bcl-2,and Bax/Bcl-2 proteins in mice retinas among different groups (x±s)組別樣本量NF-κBBaxBcl-2Bax/Bcl-2正常對照組50.56±0.060.55±0.060.76±0.050.72±0.05IR組50.94±0.06a0.78±0.05a0.65±0.061.25±0.16a生理鹽水組50.90±0.05a0.81±0.04a0.70±0.071.19±0.12aCOG1410組50.58±0.06bc0.57±0.05bc0.86±0.090.68±0.07bcF值13.027.941.787.58P值<0.001<0.01>0.05<0.01 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與IR組比較,bP<0.05;與生理鹽水組比較,cP<0.05(單因素方差分析,Bonferroni檢驗法) NF-κB:核因子κB;Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2;Bax:Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白;IR:缺血-再灌注 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with IR group,bP<0.05;com-pared with saline group,cP<0.05 (One-way ANOVA,Bonferroni test) NF-κB:nuclear factor κB;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2-associated X protein;IR:ischemia-reperfusion

本研究通過尾靜脈注射COG1410觀察其對視網(wǎng)膜IR損傷的作用,發(fā)現(xiàn)與單純造模組相比,視網(wǎng)膜IR造模后3 d COG1410組M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著減少,M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目顯著增加,表明COG1410可促進部分小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型極化。此外,有研究證明,與正常對照組相比,視網(wǎng)膜IR造模后3 d組織中IL-1β、TNF-α炎癥因子表達(dá)明顯增加[26]。本研究結(jié)果顯示,尾靜脈注射COG1410后,視網(wǎng)膜組織中炎癥通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB以及炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)均減少。NF-κB是經(jīng)典的促炎轉(zhuǎn)錄因子,幾乎存在于所有的細(xì)胞及組織類型中,未受刺激時以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)受到病原微生物、炎癥因子等刺激后,NF-κB轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核內(nèi),與特定炎癥相關(guān)基因的啟動子結(jié)合,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄[27-28]。NF-κB在小膠質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)揮重要作用,NF-κB可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄大多數(shù)促炎因子,被視為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞極化的標(biāo)志物,是調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2平衡的一個關(guān)鍵氧化還原信號機制[29-30]。本研究結(jié)果證實,COG1410可抑制視網(wǎng)膜組織中NF-κB及其下游IL-1β、TNF-α炎癥因子的表達(dá),減輕視網(wǎng)膜IR后的炎癥反應(yīng)。

RGCs是視網(wǎng)膜上唯一的投射神經(jīng)元,可處理和傳遞視覺信號,是大腦視覺形成的中心環(huán)節(jié)[31-32]。RGCs的損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[33]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常對照組相比,視網(wǎng)膜IR損傷后3 d RGCs的存活率明顯降低,而尾靜脈注射COG1410可有效減少RGCs的丟失;進一步檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況發(fā)現(xiàn),IR損傷后3 d,GCL層、INL層和ONL層均可見凋亡細(xì)胞,注射COG1410可明顯減少視網(wǎng)膜各層神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞凋亡發(fā)過程中,Bax在線粒體外膜積聚并透化線粒體膜,促使凋亡因子從線粒體中釋放入胞質(zhì),激活下游caspase最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;Bcl-2可抑制Bax與Bak的激活,阻止Bax在線粒體膜上的孔道形成,抑制細(xì)胞凋亡,Bax與Bcl-2之間的平衡決定細(xì)胞最終的命運[34-35]。在本研究中,COG1410組視網(wǎng)膜中Bax蛋白表達(dá)及Bax/Bcl2比值均較IR組降低,Bcl-2無明顯變化,表明COG1410可有效減少神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)COG1410治療可促進M1型小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化,抑制視網(wǎng)膜NF-κB及下游炎癥因子表達(dá),減輕視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng),同時抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),促進RGCs存活。本研究存在以下幾點局限:(1)M1/M2型小膠質(zhì)細(xì)胞是由人為劃分的2種極端極化的小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài),實際上小膠質(zhì)細(xì)胞是一個由M1至M2連續(xù)變化的過程,不同表型之間存在交叉重疊,特異性抗體有待進一步發(fā)掘;(2)雖然先前的研究結(jié)果證實COG1410可通過血-腦屏障,但尾靜脈注射并非眼部用藥的常規(guī)給藥方式,其他給藥方式有待進一步探索。COG1410作為APOE的模擬肽,有關(guān)其在脂質(zhì)代謝方面的作用及機制也值得進一步探究,將會作為我們下一步的研究重點。

利益聲明所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明趙茹:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫;羅晉媛:實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù);賀濤:參與實驗設(shè)計、論文指導(dǎo);邢怡橋:實驗設(shè)計、論文審閱及定稿