摘 要 當(dāng)前中國(guó)微生物菌劑市場(chǎng)供需關(guān)系整體表現(xiàn)為供略大于求，隨著農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展和環(huán)保意識(shí)的提高，微生物菌劑的市場(chǎng)需求將逐漸釋放。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BER1是一株具有多種功能的菌株（保藏編號(hào)：CCTCC NO：23398；專(zhuān)利號(hào)：ZL 202111563541.1），在防治土傳病害、促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和作物生長(zhǎng)方面有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。為進(jìn)一步推進(jìn)BER1菌株的產(chǎn)業(yè)化，探究其高密度發(fā)酵培養(yǎng)基及在田間的應(yīng)用效果，以BER1菌株發(fā)酵液中的活菌數(shù)和孢子數(shù)作為評(píng)估指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，研究該菌株的最佳發(fā)酵配方和最適發(fā)酵條件，分析該菌株在促進(jìn)水稻生長(zhǎng)和產(chǎn)量方面的潛力。結(jié)果：BER1菌株最適發(fā)酵配方為蛋白胨8 g·L-1、豆粕粉42.109 g·L-1、葡萄糖5 g·L-1、玉米淀粉40 g·L-1、酵母浸粉3 g·L-1、三水磷酸氫二鉀2 g·L-1、七水硫酸鎂0.5 g·L-1、硫酸錳0.294 g·L-1、碳酸鈣3 g·L-1、氯化鈉2 g·L-1；最適發(fā)酵條件為接種量1%、pH值7、發(fā)酵溫度32 ℃、轉(zhuǎn)速220 r·min-1、發(fā)酵時(shí)間32 h。優(yōu)化后發(fā)酵液中活菌數(shù)達(dá)31.94×109 CFU·mL-1，孢子數(shù)達(dá)30.95×109 CFU·mL-1，較優(yōu)化前分別提高了55.80%、55.72%。將配方優(yōu)化后的菌液以10%的添加量添加到普通有機(jī)肥中，能顯著提升水稻的葉綠素含量、株高、每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，理論產(chǎn)量較對(duì)照組增加了152.73 kg/667 m2。結(jié)論：優(yōu)化后的貝萊斯芽孢桿菌BER1發(fā)酵工藝能顯著提高活菌數(shù)和孢子數(shù)，將之按10%添加量添加到普通有機(jī)肥中，能顯著提高水稻的多項(xiàng)農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞 貝萊斯芽孢桿菌；單因素試驗(yàn)；響應(yīng)面優(yōu)化；水稻；增產(chǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S144 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.23.005

多數(shù)芽孢桿菌具有抗菌譜廣、生長(zhǎng)迅速、易于分離培養(yǎng)、強(qiáng)大的抗逆性、高度的生物安全性等特點(diǎn)[1]，是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)芽孢桿菌屬細(xì)菌，具有抑菌活性好、抗菌譜廣等特點(diǎn)[3-4]，在海洋、河流沉積物、土壤、植物根際及植物組織中均能被分離出來(lái)[5]。同時(shí)，這類(lèi)菌株對(duì)人畜和環(huán)境無(wú)害，具有豐富的代謝產(chǎn)物、良好的抗菌活性和抗應(yīng)激能力[6]及卓越的促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力，被認(rèn)為是一種全新的生防菌種[7]。

微生物制劑是化學(xué)農(nóng)藥和肥料的綠色有效替代品[8-9]。在實(shí)際田間應(yīng)用中，芽孢桿菌類(lèi)微生物制劑若要發(fā)揮防病或促生作用，需要確保其在長(zhǎng)途運(yùn)輸及儲(chǔ)存期間存活，同時(shí)需要在差異環(huán)境中發(fā)揮功能。芽孢形態(tài)是芽孢桿菌類(lèi)細(xì)菌的一種休眠狀態(tài)，具有耐熱和抵御逆境的能力[10]，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中又會(huì)受到外源營(yíng)養(yǎng)物的刺激，快速?gòu)?fù)蘇并維持高活性功能[8]，微生物制劑中芽孢含量決定了產(chǎn)品的儲(chǔ)存期及活性。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對(duì)芽孢的產(chǎn)生和發(fā)酵過(guò)程至關(guān)重要[11-12]。諸如玉米粉、葡萄糖、豆餅粉、魚(yú)粉等成分在發(fā)酵培養(yǎng)基中的比例會(huì)直接影響發(fā)酵液中的活菌數(shù)量和孢子數(shù)量[13]。因此，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和工藝，可以增加芽孢桿菌的有效活菌數(shù)和孢子數(shù)量，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

此外，芽孢桿菌類(lèi)生物制劑的抗菌效果還受活菌數(shù)量和抑菌活性物質(zhì)含量的影響。因此，研究人員不僅需要關(guān)注高活性菌株的篩選，還需要探究其在不同發(fā)酵條件下的生長(zhǎng)狀況，開(kāi)發(fā)高活性發(fā)酵配方和工藝，這不僅有助于優(yōu)化微生物制劑的促生和防病效果[14]，還為推動(dòng)芽孢桿菌類(lèi)生物制劑的大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持[15-16]。

在生物防治病害領(lǐng)域，優(yōu)質(zhì)菌種及其在田間應(yīng)用過(guò)程中高活性功能的維持，是制約芽孢桿菌類(lèi)生物制劑發(fā)展的重要因素之一。加強(qiáng)功能菌種的篩選、改良及優(yōu)化現(xiàn)有的發(fā)酵工藝對(duì)突破這一限制十分重要[2]。本研究以現(xiàn)有的高活性貝萊斯芽孢桿菌BER1為研究對(duì)象，該菌株分離自健康番茄的根際土壤，本身具有優(yōu)越的定殖能力和抑制多種病原真菌、細(xì)菌的能力。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)BER1的培養(yǎng)基組分（碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽）和發(fā)酵條件（接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化，旨在提升發(fā)酵后的活菌數(shù)和孢子數(shù)。同時(shí)在田間進(jìn)行了水稻促生長(zhǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)，為該菌株的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和推廣提供實(shí)質(zhì)性的技術(shù)支持，以及為實(shí)現(xiàn)綠色生物農(nóng)藥代替化學(xué)農(nóng)藥提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

1.1.1" 供試菌株

功能菌株BER1由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)（蘇州）有機(jī)循環(huán)研究院于健康番茄根際土壤中分離得到與保存，并于2021年9月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（保藏編號(hào)CCTCC No： 23398）。

1.1.2" 供試培養(yǎng)基及其發(fā)酵工藝

NB培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，葡萄糖10 g·L-1，酵母浸粉1 g·L-1，pH值7.2，121 ℃滅菌30 min。

LB肉湯培養(yǎng)基（g·L-1）：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH值7.2，121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵工藝：接種量1%，pH值7，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，發(fā)酵時(shí)間28 h。

1.2" 活菌數(shù)及芽孢數(shù)檢測(cè)方法

采用稀釋涂布平板法測(cè)定活菌數(shù)和芽孢數(shù)。具體方法：將發(fā)酵液分別稀釋106、107、108倍后，取100 μL涂布于LB平板上，每個(gè)濃度涂3個(gè)板，24 h后計(jì)算活菌數(shù)。同時(shí)將稀釋后的發(fā)酵液在80 ℃水浴中維持10 min，按照活菌檢測(cè)方法涂板檢測(cè)芽孢數(shù)[17]。

1.3" 菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

接種BER1菌種于LB肉湯培養(yǎng)基中（裝液量200 mL·L-1），30 ℃、200 r·min-1條件下發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 h取樣，每次取樣3 mL。用比濁法測(cè)定菌液在600 nm 下的吸光值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體的濃度（OD600）為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)[14]。

1.4" 外加不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

以1.1.2中的NB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置單因素試驗(yàn)，分別加入35 g·L-1的碳源：蔗糖（Sucrose）、果糖（Fructose）、半乳糖（Galactose）、甘露糖（Mannose）、玉米淀粉（Corn Starch）；38 g·L-1的氮源：豆粕粉（Bean flour）、玉米漿（Corn milk）、硫酸銨[（NH4）2SO4]、氯化銨（NH4Cl）、硝酸鈉（NaNO3）；0.25 g·L-1的無(wú)機(jī)鹽：碳酸鉀（K2CO3）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、硫酸錳（MnSO4）、氯化鎂（MgCl2）。按1.1.2初始發(fā)酵工藝測(cè)定不同碳源和氮源條件下細(xì)菌總活菌數(shù)和孢子數(shù)，確定最佳碳源和氮源。

1.5" 不同接種量、pH、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速和時(shí)間對(duì)菌體的影響

分別配置上述優(yōu)化的培養(yǎng)基100 mL，以接種量0.5%、1%、2%、3%、4%、5%；pH值：6.4、6.8、7.2、7.6、8.0；溫度：30、32、34、36、38、40 ℃；轉(zhuǎn)速：150、180、200、220、280 r·min-1；發(fā)酵時(shí)間：20、24、28、32、36、40 h為指標(biāo)；設(shè)置單因素試驗(yàn)，測(cè)定不同培養(yǎng)條件下細(xì)菌總活菌數(shù)和孢子數(shù)，以確定最佳初始接種量、pH值、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速和時(shí)間。

1.6" 孢子狀態(tài)結(jié)晶紫染色法

將培養(yǎng)一段時(shí)間的BER1發(fā)酵液用接種環(huán)蘸取一些，涂片、干燥及加熱固定后，滴加結(jié)晶紫染色液（碧云天，C0121），靜置3～5 min，水洗、干燥后在100倍油鏡顯微鏡下鏡檢，觀察菌體和芽孢狀態(tài)[18]。

1.7" Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

對(duì)篩選得到的最佳碳源玉米淀粉（A）和最佳氮源豆粕粉（B），以及發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳無(wú)機(jī)鹽硫酸錳含量（C）為自變量，以BER1孢子數(shù)量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)（BBD），以評(píng)估它們對(duì)BER1總體產(chǎn)孢量的綜合影響。試驗(yàn)因素與水平編碼如表1所示。

1.8" 水稻田間促生試驗(yàn)

1.8.1" 含BER1菌種的生物有機(jī)肥制備

根據(jù)常州市沐源農(nóng)業(yè)科技有限公司制備生物有機(jī)肥的工藝，將優(yōu)化后的發(fā)酵配方發(fā)酵的生防菌BER1菌懸液按10% （V/W）的量添加到充分腐熟的有機(jī)肥（CF）（以豬糞與菜粕有機(jī)肥按質(zhì)量比1∶1混合制成。豬糞肥含有機(jī)質(zhì)521 g·kg-1、N 39 g·kg-1、P2O5 42 g·kg-1、K2O 13 g·kg-1、水分27.2%；菜粕有機(jī)肥含有機(jī)質(zhì)438 g·kg-1、N 48g·kg-1、P2O5 39 g·kg-1、K2O 6.2 g·kg-1，水分25.8%）中，通過(guò)二次堆置陳化7 d制成生物有機(jī)肥（BF）。

1.8.2" 生物有機(jī)肥BF對(duì)田間水稻生長(zhǎng)的影響

為研究含生防菌BER1的生物有機(jī)肥對(duì)田間水稻產(chǎn)量的影響，試驗(yàn)于2022年5月10日在江蘇省蘇州市臨湖鎮(zhèn)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻生態(tài)農(nóng)場(chǎng)臨湖基地（31.12°N，120.45°E）進(jìn)行。設(shè)置2個(gè)處理組：生物有機(jī)肥處理組BF和普通有機(jī)肥組CF，3次重復(fù)，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積為100 m2 （10 m×10 m），試驗(yàn)地塊周邊設(shè)置保護(hù)行，各小區(qū)用田埂和薄膜隔開(kāi)，防止竄水竄肥。在水稻移栽前將BF和CF肥作為基肥使用，每小區(qū)用量為50 kg肥料。并在水稻的不同生長(zhǎng)階段（分蘗期、拔節(jié)期、揚(yáng)花期、灌漿期和黃熟期），分別使用葉綠素儀和直尺來(lái)檢測(cè)水稻的葉綠素含量和株高。同時(shí)在收獲期測(cè)定了水稻的根系長(zhǎng)度、每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量及理論產(chǎn)量等[19]，全面評(píng)估生物有機(jī)肥對(duì)水稻產(chǎn)量的影響。

1.9" 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA，p＜0.05表示具有顯著性差異），采用Design-Expert 13.0軟件設(shè)計(jì)組合試驗(yàn)和利用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)圖1數(shù)據(jù)，將貝萊斯芽孢桿菌BER1的生長(zhǎng)過(guò)程分為4個(gè)階段：0～6 h為遲緩期，6～20 h為對(duì)數(shù)期，20～28 h為穩(wěn)定期，28～36 h為衰亡期。穩(wěn)定期內(nèi)，菌體的600 nm波長(zhǎng)吸光值維持在1.8。在發(fā)酵20 h后，生長(zhǎng)速率為0，菌體產(chǎn)量達(dá)最高點(diǎn)。然而，衰亡期養(yǎng)分枯竭，營(yíng)養(yǎng)失衡，有害代謝產(chǎn)物積累，導(dǎo)致菌體細(xì)胞衰退和自溶，出現(xiàn)負(fù)生長(zhǎng)現(xiàn)象。因此，選擇培養(yǎng)18 h的菌液作為種子液接種到含不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，以探究培養(yǎng)基組分對(duì)活菌數(shù)和孢子數(shù)的影響。

2.2" 不同碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株BER1活菌數(shù)和孢子數(shù)的影響

由表2可知，當(dāng)玉米淀粉和蔗糖作為外源碳源時(shí)，菌株活菌數(shù)和孢子數(shù)顯著高于其他碳源，其中活菌數(shù)和芽孢數(shù)高于18×109 CFU·mL-1，其次為甘露糖＞果糖＞半乳糖。綜合考慮玉米淀粉、蔗糖的市場(chǎng)價(jià)格和活菌數(shù)量，選擇玉米淀粉作為BER1的外源碳源。由不同外源氮源的篩選結(jié)果可知，當(dāng)以豆粕粉為氮源時(shí)，菌株活菌數(shù)和孢子數(shù)最高，分別達(dá)21×109 CFU·mL-1和20.3×109 CFU·mL-1；其次為玉米漿，菌株活菌數(shù)和孢子數(shù)分別為19.2×109 CFU·mL-1和17.8×109 CFU·mL-1；而氯化銨最低，僅為11.2×109 CFU·mL-1和10×109 CFU·mL-1。綜合考慮，以豆粕粉作為菌株BER1的外源氮源。當(dāng)以硫酸錳作為外源無(wú)機(jī)鹽源時(shí)，菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)顯著高于其他外源無(wú)機(jī)鹽，分別為21.2×109 CFU·mL-1和20.4×109 CFU·mL-1；以磷酸二氫鉀為外源無(wú)機(jī)鹽時(shí)，菌株活菌數(shù)和孢子數(shù)最低。綜上，以硫酸錳作為菌株BER1的發(fā)酵培養(yǎng)基的外源無(wú)機(jī)鹽。

2.3" 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株BER1活菌數(shù)和孢子數(shù)的影響

由表3可知，在1%接種量下，BER1菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)達(dá)到最高值，分別為23.1×109 CFU·mL-1和21.9×109 CFU·mL-1。隨著接種量的增加，這些數(shù)值呈下降趨勢(shì)，表明過(guò)高的接種量不利于活菌數(shù)和孢子數(shù)的生成。因此，確定接種量為1%。

由表4可知，在pH值為7.2時(shí)，BER1菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)達(dá)到最高值，分別為21.75×109 CFU·mL-1和21×109 CFU·mL-1。過(guò)高或過(guò)低的pH均會(huì)抑制菌株的生長(zhǎng)和孢子的生成，因此確定初始pH值為7.2。

從表5中可知，在32 ℃溫度下，BER1菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)分別為24.75×109 CFU·mL-1和22.7×109 CFU·mL-1。隨著溫度的升高，活菌數(shù)和孢子數(shù)受到不利影響，因此選擇發(fā)酵溫度為32 ℃。

根據(jù)表6的數(shù)據(jù)，不同的轉(zhuǎn)速對(duì)活菌數(shù)和孢子數(shù)有不同的影響，當(dāng)轉(zhuǎn)速為220 r·min-1時(shí)，菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)最高，分別為25.65×109 CFU·mL-1和24.4×109 CFU·mL-1，因此將其發(fā)酵轉(zhuǎn)速選定為220 r·min-1。

表7數(shù)據(jù)表明，在發(fā)酵32 h后，菌株的活菌數(shù)和孢子數(shù)達(dá)到最高值，分別為22.65×109 CFU·mL-1和22.3×109 CFU·mL-1。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)和孢子數(shù)并未顯著提高，因此選擇發(fā)酵時(shí)間為32 h。

2.4" 菌株BER1發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

基于上述配方優(yōu)化結(jié)果，選取豆粕粉35～45 g·L-1，玉米淀粉30～40 g·L-1和 MnSO4濃度0.2～0.4 g·L-1，3個(gè)影響因素，采用Design-Expert 13進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行方差分析導(dǎo)出結(jié)果（表8），得到菌株孢子數(shù)（CFU·mL-1） Spore Number=25.96+2.7A+7.2B-2.05C+2.7AB+1.05AC+1.15BC-6.33A2-2.73B2-4.08C2的回歸方程?？梢钥闯?，P值為 0.000 3，小于0.05，達(dá)到極顯著水平，失擬項(xiàng)差異不顯著，相關(guān)系數(shù)為0.965 4，說(shuō)明實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值具有較好的擬合度，試驗(yàn)誤差較小。CV值為10.51，該模型R2Adj相關(guān)系數(shù)為0.920 9，響應(yīng)面變化可由該模型解釋?zhuān)遗c實(shí)際情況擬合較好，可用于試驗(yàn)分析預(yù)測(cè)。A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2均為差異極顯著（p＜0.01），其余項(xiàng)差異不顯著。根據(jù)F值大小，可以得出試驗(yàn)各因素對(duì)菌株孢子數(shù)值影響的順序?yàn)椋河衩椎矸郏径蛊煞郏綧nSO4。運(yùn)用Design-Export 13軟件分析可得菌株的最適條件：豆粕粉為42.109 g·L-1，玉米淀粉為40 g·L-1，MnSO4濃度為 0.294 g·L-1，預(yù)測(cè)值為31.594×109 CFU·mL-1，在該條件下進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果分別為33.29×109、32.33×109、30.81×109 CFU·mL-1，平均值為32.143×109 CFU·mL-1，與預(yù)測(cè)值相近，表明優(yōu)化結(jié)果可靠（見(jiàn)圖2）。

2.5" 菌株BER1發(fā)酵條件優(yōu)化前后對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果，利用所得的最佳發(fā)酵配方及發(fā)酵條件進(jìn)行連續(xù)3批發(fā)酵試驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果如圖3A所示，優(yōu)化后菌株發(fā)酵液的活菌數(shù)和孢子數(shù)分別達(dá)到了31.94×109 CFU·mL-1和30.95×109 CFU·mL-1，相比于優(yōu)化前分別提升了55.80%和58.72%。同時(shí)通過(guò)結(jié)晶紫鏡檢發(fā)現(xiàn)（圖3B），優(yōu)化后的發(fā)酵液中100%全部變?yōu)檠挎郀顟B(tài)，而優(yōu)化前僅存在近50%的芽孢，表明優(yōu)化后產(chǎn)品會(huì)更加穩(wěn)定，貨架期延長(zhǎng)。

2.6" 制備的生物有機(jī)肥對(duì)水稻生長(zhǎng)的影響

按照優(yōu)化的配方和發(fā)酵工藝制備BER1菌劑，濃度為31.94×109 CFU·mL-1，按照10%的添加量添加到充分腐熟的有機(jī)肥（CF）中，制備出生物有機(jī)肥（BF）。水稻田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），BF處理的水稻葉綠素含量、株高在各個(gè)時(shí)期顯著高于CF處理組，且BF處理的水稻根系長(zhǎng)度和有效分蘗數(shù)也高于CF處理，但是差異不顯著。表明生物有機(jī)肥作基肥對(duì)水稻各生育期的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，但并不顯著。

2.7" 制備的生物有機(jī)肥對(duì)水稻產(chǎn)量的影響

水稻收獲后對(duì)其產(chǎn)量進(jìn)行了測(cè)算（見(jiàn)圖5）。結(jié)果表明，BF處理的水稻每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)及千粒質(zhì)量均顯著高于CF處理，其中每株穗數(shù)增加了13.85%，每穗粒數(shù)增加了36.89%，千粒質(zhì)量增加了16.82%。理論產(chǎn)量BF處理組為698.4 kg/667 m2，CF處理組為519 kg/667 m2，增加了179.39 kg/667 m2。表明利用生物有機(jī)肥作基肥，能顯著促進(jìn)水稻產(chǎn)量的增加。

3" 討論與結(jié)論

植物根際土壤中存在著豐富的微生物群體，其中細(xì)菌起著關(guān)鍵作用，不僅有助于提高植物的抗病性[20]和促進(jìn)生長(zhǎng)[21]，還維護(hù)了土壤的微生態(tài)平衡[22]。在這些有益細(xì)菌中，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）被認(rèn)為是一種重要的生防細(xì)菌[23]，是一種新型生防細(xì)菌，可以從多種環(huán)境中分離得到[24]，包括水體、土壤、空氣、植物根系、植物表面和動(dòng)物腸道[2]。近年來(lái)，貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其作用包括增強(qiáng)植物的抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、維持土壤微生態(tài)平衡等。隨著國(guó)家對(duì)綠色有機(jī)農(nóng)業(yè)的要求，倡導(dǎo)減肥增效、綠色環(huán)保種植模式的可持續(xù)發(fā)展，芽孢桿菌類(lèi)生物制劑的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用將具有廣闊的市場(chǎng)，其中研究發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和優(yōu)化發(fā)酵工藝至關(guān)重要[25]。

本研究聚焦于貝萊斯芽孢桿菌BER1，其源自青枯菌田中健康番茄根際土壤，并表現(xiàn)出對(duì)自然環(huán)境的良好適應(yīng)性和顯著的生防潛力[26]。先前的研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可以通過(guò)核糖體途徑合成多肽類(lèi)化合物及抑菌蛋白等多種途徑對(duì)抗病原真菌。例如，研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌MT310對(duì)黃連根腐病菌和高粱炭疽病菌等植物病原真菌具有顯著的抑制效果[27]。類(lèi)似地，有研究表明貝萊斯芽孢桿菌對(duì)水稻稻瘟病菌表現(xiàn)出良好的抑制效果[28]，并有助于促進(jìn)水稻植株的生長(zhǎng)[29]。此外，貝萊斯芽孢桿菌SH-1417對(duì)番茄青枯病的防控效果也表現(xiàn)出色，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的菌劑防治效果可達(dá)到93.8%，同時(shí)還對(duì)煙草炭疽病菌、玉米大斑病菌等病原真菌展現(xiàn)出顯著的抑制作用[15]。

在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)貝萊斯芽孢桿菌制劑的過(guò)程中，活菌數(shù)和芽孢數(shù)決定著產(chǎn)品的質(zhì)量和保存周期。芽孢的形成一方面取決于菌種，不同的菌種有不同的形成條件；另外芽孢的形成也受到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境因素的影響[30]，影響因子主要包括碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、初始pH等，但不同菌種對(duì)影響因子的選擇也存在一定的差異[31-32]。本研究通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌BER1的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，分析了外源添加氮源、碳源、無(wú)機(jī)鹽，以及接種量、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速等影響因素對(duì)貝萊斯芽孢桿菌BER1活菌數(shù)和孢子數(shù)的影響。結(jié)果表明外源添加玉米淀粉作為碳源，能夠提高貝萊斯芽孢桿菌BER1的活菌數(shù)和產(chǎn)孢量，這可能是由于玉米淀粉具有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、糖類(lèi)化合物，能夠與芽孢桿菌的酶系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)合[33]，對(duì)活菌數(shù)和孢子數(shù)有促進(jìn)作用。同時(shí)外源添加豆粕粉為長(zhǎng)效氮源，能夠通過(guò)與速效氮蛋白胨搭配有效促進(jìn)貝萊斯芽孢桿菌BER1菌體的生長(zhǎng)，這可能是因?yàn)槎蛊煞酆写罅康鞍踪|(zhì)、脂肪、糖類(lèi)、含磷化合物和維生素等[14]造成的。研究發(fā)現(xiàn)外源添加硫酸錳，對(duì)細(xì)菌酶活性的維持、能量代謝、抗氧化防御、生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂等具有重要的作用，因此在發(fā)酵過(guò)程中提供足夠的錳是維持芽孢桿菌健康生長(zhǎng)和高產(chǎn)量的重要因素之一[34]。對(duì)不同初始pH、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)在pH值7.2、接種量1%、發(fā)酵溫度32 ℃、轉(zhuǎn)速220 r·min-1、發(fā)酵時(shí)間32 h的條件下，貝萊斯芽孢桿菌BER1的活菌數(shù)和孢子數(shù)最高。有研究表明枯草芽孢桿菌MC4-2的最適條件為pH值6.0、轉(zhuǎn)速210 r·min-1、溫度32 ℃[35]，與本研究結(jié)果類(lèi)似，但在本研究中最適pH值為7.2，可能是由于菌株在不同長(zhǎng)期生長(zhǎng)環(huán)境下適應(yīng)性產(chǎn)生差異所致[36]。

本研究將發(fā)酵優(yōu)化后的BER1菌液與有機(jī)肥的復(fù)配，制備含生防菌的有機(jī)肥，并通過(guò)水稻田間小區(qū)試驗(yàn)驗(yàn)證了生物有機(jī)肥的促生長(zhǎng)和增產(chǎn)效果，表明在有機(jī)肥中添加了BER1后能顯著提高作物長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量。這與施用生物有機(jī)肥能夠改善土壤質(zhì)量，對(duì)作物不同時(shí)期的生長(zhǎng)都具有促進(jìn)作用，從而提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)的相關(guān)研究結(jié)論一致[37-42]。

隨著社會(huì)的發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)綠色農(nóng)業(yè)、生態(tài)農(nóng)業(yè)、有機(jī)農(nóng)業(yè)越來(lái)越重視，同時(shí)中央也對(duì)推動(dòng)我國(guó)全面發(fā)展綠色環(huán)保生態(tài)農(nóng)業(yè)做出全面部署，以微生物菌劑為代表的微生物肥料被列入國(guó)家“十四五”生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展重點(diǎn)產(chǎn)品。市場(chǎng)對(duì)微生物制劑產(chǎn)品的需求呈現(xiàn)供大于求的趨勢(shì)。本研究表明，通過(guò)添加外源碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，能顯著提高BER1發(fā)酵過(guò)程中的活菌數(shù)和孢子數(shù)，有助于提高產(chǎn)品的質(zhì)量和降低后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在有機(jī)肥中添加10% BER1發(fā)酵液，可實(shí)現(xiàn)水稻種植過(guò)程中的減肥增產(chǎn)。這符合國(guó)家宏觀層面減肥減藥、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展要求。未來(lái)我們將進(jìn)一步深入研究該菌株在不同作物根際的定殖情況及其生防機(jī)制，以更好地掌握其生態(tài)適應(yīng)性，為微生物制劑在田間大面積應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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