韋全想,吳彬彬,劉露,2*,張晶林,徐瑞

(1.亳州學(xué)院 生物與食品工程系 安徽 亳州 236800;2.養(yǎng)生型配制酒亳州市重點實驗室,安徽 亳州 236800)

紅曲是我國傳統(tǒng)微生物發(fā)酵產(chǎn)物。早在《天工開物》中已有記載:紅曲具有殺菌和抑菌作用,在魚肉上涂紅曲可以延緩它的變質(zhì)。紅曲霉以其卓越的防腐效果;能發(fā)酵生產(chǎn)天然紅色素[1]、降低膽固醇等作用而備受關(guān)注[2]。在食品加工生產(chǎn)中,很多廠家為了減少細(xì)菌污染,使用化學(xué)制品作為防腐劑來抑制細(xì)菌增長[3-4],但隨著科學(xué)研究的深入,關(guān)于防腐劑的危害逐漸被揭示出來。

應(yīng)用紅曲[5]的天然抑菌作用能減少食品在加工和儲藏的過程中微生物所帶來的污染,它既不會破壞食品的營養(yǎng)成分和風(fēng)味,也不會降低食品的營養(yǎng)價值和質(zhì)地[6]。紅曲米既可以作為中藥,又可以充當(dāng)食品,是一種在亞洲國家常用的食品著色劑和膳食材料。紅曲主要應(yīng)用于釀酒行業(yè)、肉制品、食品、調(diào)味品[7]、中藥制品等多方面[8]。近幾年來,科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn),紅曲具有降血壓、降膽固醇[9]、降血糖、健腦、抗焦慮[10]等功效,因此紅曲保健食品已成為國內(nèi)外的研究熱點和廣泛關(guān)注點[11-12]。

山楂在中國擁有十分悠久的藥用和食用歷史。中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為山楂擁有散瘀行氣、降脂化濁、健胃消食的作用,還能用作于胃腕脹滿、高脂血癥、肉食積滯、瀉痢腹痛、淤血經(jīng)閉、心腹刺痛、產(chǎn)后瘀阻、疝氣疼痛等,是經(jīng)過衛(wèi)生部批準(zhǔn)的“藥食兩用”中藥。國內(nèi)外研究表明,從山楂中分離得到的物質(zhì)達(dá)150多種,主要有黃烷酮及其聚合物類、黃酮類、有機(jī)酸類[13-14],還有甾體類和三萜類等[15]。

山楂或者紅曲米都具有降血脂活性物質(zhì),市面上存在山楂酒及紅曲米酒,各具風(fēng)味和保健作用,占有一定的市場份額?，F(xiàn)將山楂和紅曲米兩者結(jié)合,以東京根霉曲作為糖化發(fā)酵劑,以黃酒的發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵,通過響應(yīng)面法進(jìn)行釀造工藝參數(shù)的優(yōu)化,開發(fā)一款具有降血脂活性的山楂紅曲米酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅曲米(深圳市泓福有限公司),山楂粉(北京同仁堂(亳州)有限公司),白砂糖(安琪酵母股份有限公司);東京根霉曲(廣西博白縣英橋綜合加工廠),釀酒高活性感酵母(黃酒)(安琪酵母股份有限公司),胰蛋白酶1∶250(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司),胃蛋白酶1∶3000(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司);甘氨膽酸鈉(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司),鹽酸(太倉滬試試劑有限公司),氫氧化鈉(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司),硫酸分析純(煙臺市雙雙化工有限公司),0.01mol/L的pH=6.3的磷酸緩沖液(合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)。

所需配制的試劑:鹽酸(0.01 mol/L)、胃蛋白酶溶液(10 g/L)、胰蛋白酶溶液(10 g/L)、甘氨膽酸鈉溶液(0.4 mmol/L)、氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)、60%的硫酸溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

ZXSD-B1430全自動恒溫培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司;K-8D恒溫水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司;UV-6100紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;ZWF-10恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海喬躍電子有限公司。

TDZ4-WS高速離心機(jī),長沙平凡儀器儀表有限公司;P-901PH酸度計,上海佑科儀器儀表有限公司;DWT-1單盤微量天平,上海雙旭電子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點

(1)蒸米:將稱取好的紅曲米放到水中浸泡12 h,將米泡軟。再倒入電飯鍋中加入蒸餾水,蓋上蓋子,打開開關(guān),等到鍋中冒出蒸汽,再將紅曲米倒出,攤開,晾涼。

(2)裝瓶:將每組需要加入的紅曲米、山楂粉、根霉曲、白砂糖的量計算好后一一稱取,裝到滅菌后的大三角瓶內(nèi)攪拌。注意不要粘到瓶壁,可能會造成實驗誤差。

(3)酵母活化:稱量好的安琪黃酒活性干酵母轉(zhuǎn)移到小燒杯內(nèi),按照要求倒入20倍左右的蒸餾水,用玻璃棒攪拌均勻。用保鮮膜封住燒杯的口,用皮筋扎緊,放到恒溫水浴鍋內(nèi),溫度調(diào)到38℃,恒溫活化15～30min。

(4)加酵母:裝瓶后,用移液管吸取一定量的活化后的酵母,轉(zhuǎn)移到分好組的大三角瓶內(nèi),玻璃棒攪拌均勻。

(5)封口:用封口膜包住瓶口,用皮筋扎緊。

(6)發(fā)酵:將攪拌均勻的材料放到全自動恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃發(fā)酵培養(yǎng)3 d。

(7)過濾:取出發(fā)酵好的酒,用紗布和脫脂棉過濾出發(fā)酵液,裝到貼好標(biāo)簽的瓶子保存。

(8)澄清:取出過濾后的發(fā)酵液,裝到離心管內(nèi)稱重。然后,將離心管放到離心機(jī)內(nèi),轉(zhuǎn)速為4000 r/min,離心30 min,離心后倒出上清液,保存上清液,即為成品酒。

1.3.2 感官評價方法 選取10人,從香氣、滋味、色澤、組織和狀態(tài)進(jìn)行感官評價。并找專業(yè)人員10人進(jìn)行感官評分,滿分為100分。見表1。

表1 山楂紅曲米酒感官評價標(biāo)準(zhǔn)

表1 不同山楂粉、紅曲米比例的實驗數(shù)據(jù)

1.3.3 計算公式 關(guān)于膽酸鹽結(jié)合實驗的計算公式與方法:將對照品溶液作為測試對象,進(jìn)行紫外測定,并帶入回歸方程中得到甘氨膽酸鈉溶液的濃度,帶入公式(1)計算膽酸鹽結(jié)合能力。

(1)

式中:C0為空白溶液的膽酸鹽濃度;C1為樣品溶液的膽酸鹽溶液。

關(guān)于膽酸鹽結(jié)合率與感官品評的綜合值計算方法:將膽酸鹽結(jié)合率與感官品評指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化為0-1之間的均一值,采用含Hassan方法[16],分別進(jìn)行轉(zhuǎn)換求得其歸一值,如公式(2):

Dmax=(di-dmin)/(dmax-dmin)

(2)

膽酸鹽結(jié)合率與感官品評分值的權(quán)重值分別為0.4和0.6,將各指標(biāo)的歸一值與權(quán)重相加,得到該樣品的綜合值(Y),公式(3)如下:

綜合值(Y)=膽酸鹽結(jié)合率歸一值×0.4+感官品評分值×0.6

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同山楂、紅曲米的比例對山楂紅曲米酒的影響 將山楂與紅曲米的比例梯度設(shè)置為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10,糖的添加量和發(fā)酵時間不變,分別是3%和3d,紅曲米稱量100 g,各組數(shù)據(jù)如表2所示。

由圖1可知,山楂、紅曲米的比例對酒液的降血脂活性的影響較明顯,隨著山楂添加量升高結(jié)合率升高,到達(dá)最高點后,再呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。采用歸一值,將感官品評結(jié)合降血脂活性合成綜合值。當(dāng)山楂粉與紅曲米的配料比例達(dá)到1∶4時,其綜合值為0.9356,此比例下膽酸鹽結(jié)合率為61.02%,感官評價分值為86.5分。其中膽酸鹽結(jié)合能力為次優(yōu)值,感官品評分值為最優(yōu)值。綜合來看,山楂粉與紅曲米的配料比例為1∶4時結(jié)果最優(yōu)。

圖1 山楂與紅曲米的比例對綜合值的影響

2.1.1.1 不同山楂、紅曲米的比例對降血脂活性的影響 由體外降血脂膽酸鹽的結(jié)合實驗得到的實驗數(shù)據(jù)可得,不同的山楂、紅曲米的比例的發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對降血脂活性具有較大的影響。由圖2可知,在山楂、紅曲米的比例為(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10)的情況下,隨著紅曲米的占比的增加,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在山楂、紅曲米的比例為1∶2時,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)膽酸鹽結(jié)合率是最高的。

圖2 山楂與紅曲米的比例對膽酸鹽結(jié)合率的影響

2.1.1.2 不同山楂、紅曲米的比例對感官的影響 由各位專業(yè)人員打分綜合起來的數(shù)據(jù)可得,不同的山楂、紅曲米配比發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對感官品評結(jié)果也具有一定的影響,見圖3。在山楂、紅曲米的比例為1∶4的情況下,山楂紅曲米酒的口感最好。

2.1.2 不同糖的添加量對山楂紅曲米酒的發(fā)酵的影響 將糖添加量的等梯度設(shè)置為1%、3%、5%、7%、9%,保持山楂、紅曲米的比例和發(fā)酵時間設(shè)置的值不變,分別是1∶4和3 d,紅曲米100 g,各組數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 不同糖的添加量的實驗數(shù)據(jù)

由圖2可知,由于山楂的比例較高酸度較大,因而對酒的口感上帶來不容忽視的影響,且由于白砂糖的添加會影響結(jié)合律的變化。大概的變化規(guī)律是,在一定范圍內(nèi)先升高后降低。但結(jié)合率的變化范圍不算很大,且感官品評的分值差距明顯。故利用糖的添加量來調(diào)節(jié)整體風(fēng)味。采用歸一值,將感官品評結(jié)合降血脂活性合成綜合值,當(dāng)糖的添加量達(dá)到7%,其綜合值為0.8237(圖4),此比例下膽酸鹽結(jié)合率為61.01%,感官評價分值為90.5分。其中膽酸鹽結(jié)合能力為次優(yōu)值,感官品評分值為最優(yōu)值。綜合來看糖的添加量為7%的比例為最優(yōu)結(jié)果。

圖4 糖的添加量對綜合值的影響

2.1.2.1 不同糖的添加量對降血脂活性的影響 由處理過后的實驗數(shù)據(jù)可知,添加不同糖量發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對降血脂活性的影響一般。如圖5,不同糖的添加量發(fā)酵的酒液中含有的降血脂活性物質(zhì)含量較相近,區(qū)別不是很大。在糖的添加量為1%、3%、5%、7%、9%的情況下,隨著糖量的增加,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在糖的添加量為5%,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合率是最高的。

圖5 糖的添加量對膽酸鹽結(jié)合率的影響

2.1.2.2 不同糖的添加量對感官的影響 由各位專業(yè)人員打分綜合起來的數(shù)據(jù)可得,不同糖的添加量的發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對感官品評結(jié)果具有很大的影響(圖6)。圖6說明糖的添加量使發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒的口感差異大,風(fēng)格特征明顯。當(dāng)糖的添加量為7%時,山楂紅曲米酒的口感最好。

2.1.3 不同發(fā)酵時間對山楂紅曲米酒的發(fā)酵的影響 本實驗研究的是不同發(fā)酵時間對山楂紅曲米酒發(fā)酵的影響。將發(fā)酵時間等梯度設(shè)置,分別是2、3、4、5、6 d。山楂、紅曲米的比例和糖的添加量的值是不變的,分別是1∶4和7%。本實驗的紅曲米稱量的是100 g,各組數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 不同發(fā)酵時間的實驗數(shù)據(jù)

由圖7可知,發(fā)酵時間也是紅曲米酒的重要因素之一,對于感官和結(jié)合率都有影響。發(fā)酵時間不足,香氣、色澤、口感、狀態(tài)都大打折扣。發(fā)酵時間過長降血脂活性有所下降,且風(fēng)味也會發(fā)生較大改變,總體上是朝著不利方面變化。由圖7可知,結(jié)合率的變化不大,但總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢。

圖7 發(fā)酵天數(shù)對綜合值的影響

采用歸一值,將感官品評結(jié)合降血脂活性合成綜合值,當(dāng)控制其他條件不變時,將發(fā)酵天數(shù)設(shè)置為3 d,其綜合值為1,此時間下膽酸鹽結(jié)合率為57.34%,感官評價分值為87.5分。其中膽酸鹽結(jié)合能力為最優(yōu)值,感官品評分值為最優(yōu)值。綜合來看發(fā)酵時間為3 d時為最優(yōu)。

2.1.3.1 不同發(fā)酵時間對降血脂活性的影響 由體外降血脂膽酸鹽結(jié)合實驗得到的數(shù)據(jù)可知,不同發(fā)酵時間發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對降血脂活性的影響較大。如圖 8 ,不同發(fā)酵時間發(fā)酵后的酒液中含有的降血脂活性物質(zhì)含量由各組的計算得的數(shù)據(jù)有一定的差距,差別明顯。在發(fā)酵時間為2、3、4、5、6 d的情況下,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在發(fā)酵時間為3 d時,山楂紅曲米酒中的降血脂活性物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合率最高。

圖8 發(fā)酵天數(shù)對膽酸鹽結(jié)合率的影響

2.1.3.2 不同發(fā)酵時間對感官的影響 對感官的影響由各位專業(yè)人員打分綜合起來的數(shù)據(jù)可得,不同發(fā)酵時間的發(fā)酵出來的山楂紅曲米酒對感官品評結(jié)果具有非常大的影響(圖9)。圖9說明,不同發(fā)酵時間的山楂紅曲米酒的口感差異大,各組酒在被品嘗時特征明顯。發(fā)酵時間為3 d時,山楂紅曲米酒的口感最好。

2.2 響應(yīng)面法實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

2.2.1 響應(yīng)面模型建立與分析 以影響山楂紅曲米酒發(fā)酵的三個主因素為基礎(chǔ),采取響應(yīng)面實驗優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝,見表 5、表6。

表5 影響因素水平編碼表

表6 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

表6(續(xù))

采用Design-Expert10.0軟件設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗,優(yōu)化實驗最終實驗結(jié)果見表 6 。表7則是回歸模型的方差分析。對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合,則回歸方程如下所示:Y綜合值=0.93+0.068A+0.16B-3.513E-003C-0.067AB+0.011AC+0.028BC-0.38A2-0.23B2-0.28C2。

表7 實驗?zāi)Ｐ偷姆讲罘治?/p>

由表6可知,本次的實驗數(shù)據(jù)模型的F=26.75,P<0.0001,表明該模型具有顯著性;通過對實驗數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)在全部影響因素中,A、B、A2、B2、C2項(P<0.05)對膽酸鹽結(jié)合率有顯著的影響;失擬項方面對模型進(jìn)行顯著性分析,F=2.23,P>0.1000,說明無顯著性;實驗數(shù)據(jù)的可用性取決于決定系數(shù),通過方差分析,得到相關(guān)系數(shù)R2=0.9717;調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2adj=0.9354。表明可信度較好。因此,該數(shù)據(jù)模型可以用于分析各個因素對膽酸鹽結(jié)合能力及感官評價綜合值的影響。

把山楂與紅曲米的比例、糖的添加量、發(fā)酵天數(shù)3個因素中1個因素取為零水平,另2個因素對膽酸鹽結(jié)合能力與感官品評綜合值的影響進(jìn)行分析,各因素之間的交互作用見圖10 。

圖10 山楂與紅曲米各因素之間的交互作用的響應(yīng)面圖

由Design-Expert軟件對實驗相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,得到最佳發(fā)酵工藝:山楂粉添加量與紅曲米質(zhì)量比為1∶5;糖的添加量是7.15%;發(fā)酵時間是2.639 d。此時綜合值為0.866。

3 結(jié)論

本實驗在傳統(tǒng)紅曲米酒發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上,以山楂、紅曲米為原料,以東京根霉曲及黃酒高活性酵母為糖化發(fā)酵劑,通過響應(yīng)面實驗設(shè)計優(yōu)化工藝制得山楂紅曲米酒,其最佳發(fā)酵工藝為:山楂粉、紅曲米添加的質(zhì)量配比為1∶5;糖的添加量是7.15%;發(fā)酵溫度是28℃;發(fā)酵時間是2.639d。由于實驗可操作性的限制,因此所得的最優(yōu)條件要依據(jù)實際條件來進(jìn)行修正,最終確定山楂紅曲米酒的發(fā)最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為糖的添加量為7%,發(fā)酵天數(shù)為3 d,山楂、紅曲米的比例為1∶5。此時山楂紅曲米酒膽酸鹽結(jié)合率為61.02%,感官品評得分87.5分,風(fēng)格獨特,具有很好的發(fā)酵酒風(fēng)味,色澤澄清透亮,入口酸甜爽口,香氣淡雅,有很明顯的山楂果香味和黃酒風(fēng)味。