張有為，黃 晨，黃廷銳，唐德志＊＊

（1.陜西省寶雞市中心醫(yī)院 寶雞 721008；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032）

雌激素缺乏是絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥（PMOP）的首要病因。對PMOP 的預(yù)防可采用雌激素替代療法，但長期服用雌激素可明顯增加患者發(fā)生癌癥的危險性[1-2]。因此，尋找一種既有效又安全的雌激素類藥物是當(dāng)前本領(lǐng)域的研究熱點。大量文獻報道，植物雌激素可促進成骨細胞的增殖和分化，抑制骨吸收，誘導(dǎo)骨形成[3-6]。異補骨脂素屬于呋喃香豆素類化合物，為植物雌激素之一[7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，異補骨脂素具有促進骨代謝的作用，但其機制尚不清楚[8-9]。本實驗旨在探討異補骨脂素對成骨細胞增殖和分化的影響，并利用BMP2 體外條件性基因敲除技術(shù)從基因和蛋白的水平揭示其作用機理，為異補骨脂素用于臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供全面、可靠的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞和實驗動物

前成骨細胞株OCT1 細胞和BMP2loxp/loxp小鼠由美國羅切斯特大學(xué)骨科系陳棣教授饋贈。

1.1.2 實驗藥物

異補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品由上海藥品檢疫局購買，純度達到95%以上；BMP2 純化蛋白由浙江華東基因技術(shù)研究所購買，純度超過90%。

1.1.3 實驗試劑

胎牛血清（PAA 公司），a-MEM 干粉培養(yǎng)基（CALBIOCHEM 公司），0.25%含EDTA 的胰蛋白酶（PAA 公司），青-鏈霉素（PAA 公司），G-418 抗體（CALBIOCHEM 公司），二甲基亞砜DMSO（SIGMA 公司），MTT（SIGMA 公司），TRIZOL（晶美生物），Quant Reverse Transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIANGEN 公司），高質(zhì)純化DNA膠回收試劑盒（GENMEN公司），兔抗鼠Runx2 單克隆抗體，兔抗鼠Osx 單克隆抗體，兔抗鼠β-actin 單克隆抗體和羊抗兔HRP 多克隆抗體（Cell signaling 公司），Ad-GFP 和Ad-Cre 腺病毒（上海吉凱生物公司）等。

1.1.4 實驗設(shè)備

細胞培養(yǎng)箱（熱能公司），SW-CJ-2FD超凈工作臺（AIRTECH 公司），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），倒置相差顯微鏡（Olympus 公司），AF100 制冰機（SCOTMAN 公司），高速離心機（Eppendorf公司），MK-Ⅲ型酶標(biāo)儀（Dynex 公司），DU 800/VIS 紫外分光光度計（Beckonman 公司），Rotor Gene 3000 熒光PCR 儀（基因公司），Odyssey遠紅外掃描儀（LI-COR公司）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復(fù)蘇培養(yǎng)

取出裝有OCT1細胞的凍存管，按常規(guī)方法進行細胞活性復(fù)蘇，計數(shù)細胞，按1×105·mL-1的密度接種于無菌培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換1 次培養(yǎng)液后再繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3-4 天換1 次液。細胞培養(yǎng)液采用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青-鏈霉素和300 μg·mL-1的G-418抗體的a-MEM培養(yǎng)基。

1.2.2 分組方法

①正常對照組，普通培養(yǎng)液；②異補骨脂素低劑量組，濃度為10 μg·mL-1；③異補骨脂素中劑量組，濃度為30 μg·mL-1；④異補骨脂素高劑量組，濃度為60 μg·mL-1；⑤陽性對照組，BMP2純化蛋白50 ng·mL-1。

1.2.3 MTT法觀察細胞增殖情況

取經(jīng)常規(guī)胰蛋白酶消化后的傳代細胞，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞密度為1×104·mL-1左右。將細胞移入一塊96孔培養(yǎng)板中，每孔200 mL，然后放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h 后，更換無血清培養(yǎng)液，使細胞生長同步化。于第2 天吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，按上述分組方法分別給藥，每組8個復(fù)孔，每孔200 μL含藥無血清細胞培養(yǎng)液。之后，再放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板進行MTT 法檢測。先往每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg·mL-1），放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄去上清液，每孔加入DMSO 180 μL，充分震搖混勻，使結(jié)晶完全溶解，立即上酶標(biāo)儀測定OD 值，波長為490 nm，以同時做的單純培養(yǎng)液為空白對照孔。

1.2.4 實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)

細胞加藥培養(yǎng)48 h 后取出，分別倒盡培養(yǎng)液，采用TRIzol法提取細胞總mRNA。提取后用紫外分光光度計選擇波長260 nm 和280 nm 檢測樣本OD 值（即光吸收值），以超純水作為空白對照調(diào)零，測得樣本A260/A280 比值在1.8-2.0，證明RNA 抽提成功，并用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測總RNA 的完整性。逆轉(zhuǎn)錄后進行進行兩步法擴增。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，擴增儀中95℃ 10 min，再擴增（95℃變性20 s，62℃退火5 s，72℃復(fù)性25 s）40 個 循環(huán)，72℃延 伸10 min。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后，用Rotor Gene6.0 軟件自動進行絕對定量分析，以每一樣體所含目的基因的拷貝數(shù)和其β-actin 內(nèi)參基因的拷貝數(shù)的比值表示目的基因的表達量。其引物序列及參照物β-actin 引物序列由大連寶生物公司合成，引物序列見表1。

表1 Real time RT-PCR檢測所檢測的基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測

細胞加藥培養(yǎng)48 h 后取出，分別倒盡培養(yǎng)液，裂解細胞，提取蛋白并定量。將每組蛋白溶液調(diào)整至相同濃度，經(jīng)煮沸變性后，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，振蕩漂洗干凈后，分別加入兔抗鼠BMP2、Osx 和β-actin 單克隆一抗，4℃過夜。次日取出，振蕩漂洗干凈后，加入羊抗兔HRP 多克隆二抗，孵育1 h，振蕩漂洗干凈后，在Odessey 遠紅外掃描儀上檢測蛋白條帶，保存圖像。

1.2.6 BMP2體外條件性敲除實驗

從出生3 天的BMP2loxp/loxp小鼠中分離原代顱骨成骨細胞，然后以1×106個·mL-1的密度接種到六孔培養(yǎng)板上進行培養(yǎng)。利用A d-GFP 或Ad-Cre（病毒滴度：4×108pfu·mL-1）感染2 天后，用或不用異補骨脂素（最佳濃度）分別干預(yù)48 h，部分細胞用來抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用Real-time PCR 反應(yīng)檢測BMP2、Runx2 和Osterix（Osx）等基因表達，操作方法和步驟同前所述。部分細胞用10%福爾馬林固定，加入含0.5 mg·mL-1對硝基苯磷酸的AMP 緩沖液（0.5 mol·L-1甲基二戊烷，2-丙胺醇，2 mmol·L-1氯化鎂，pH=10.3）染色30 min，直到顏色變化以檢測堿性磷酸酶活性。

1.2.7 統(tǒng)計分析

計數(shù)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。借助SPSS 11.0 軟件包，多樣本之間進行One-Way ANOVA 分析，兩兩樣本之間進行t檢驗。檢驗水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

倒置顯微鏡下觀察，在給藥培養(yǎng)48 h 后，各組細胞的數(shù)量及形態(tài)與正常組相比均無明顯異常。見圖1。

圖1 大體觀察（×10）

2.2 MTT法檢測結(jié)果

在給藥培養(yǎng)48 h后（見表2），異補骨脂素能促進成骨細胞的增殖，但以低劑量（10 μg·mL-1）組最明顯（P＜0.05），而中劑量（30 μg·mL-1）組和高劑量（60 μg·mL-1）組作用不明顯（P＞0.05）；陽性對照組BMP2 純化蛋白亦能明顯促進成骨細胞的增殖（P＜0.05）。

表2 成骨細胞增殖情況

2.3 實時熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果

結(jié)果顯示（見表3），異補骨脂素能促進成骨細胞BMP2 mRNA 的表達，以低劑量組（10 μg·mL-1）最明顯（P＜0.05），中劑量組（30 μg·mL-1）次之（P＜0.05）；陽性對照組BMP2 純化蛋白亦可以顯著增加成骨細胞BMP2 mRNA 的表達（P＜0.05）。異補骨脂素低劑量（10 μg·mL-1）和 中 劑 量（30 μg·mL-1）能 明 顯 促 進成骨細胞Runx2 mRNA 的表達（P＜0.05），而高劑量（60 μg·mL-1）組成骨細胞Runx2 mRNA 表達量比正常對照組偏低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。陽性對照組BMP2 純化蛋白亦可以顯著增加成骨細胞BMP2 mRNA 的表達（P＜0.05）。異補骨脂素低劑量組（10 μg·mL-1）和中劑量組（30 μg·mL-1）能明顯促進成骨細胞Osx mRNA 的表達（P＜0.05），而高劑量（60 μg·mL-1）組成骨細胞Osx mRNA 表達量比正常對照組偏低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。陽性對照組BMP2純化蛋白亦可以顯著增加成骨細胞BMP2 mRNA的表達（P＜0.05）。

2.4 Western blot檢測結(jié)果

結(jié)果顯示（見圖2），異補骨脂素低劑量（10 μg·mL-1）和中劑量（30 μg·mL-1）能增加成骨細胞中Runx2蛋白的表達，分別提高了2.18倍和1.25倍；陽性對照BMP2 純化蛋白也能增加成骨細胞中Runx2 蛋白的表達，提高了2.75倍。

圖2 各組Runx2、Osx蛋白表達量的比較

異 補 骨 脂 素 低 劑 量（10 μg·mL-1）、中 劑 量（30 μg·mL-1）和高劑量（60 μg·mL-1）均可提高Osx 蛋白的表達量，分別提高了2.03 倍、1.79 倍和1.88 倍；陽性對照BMP2 純化蛋白也能增加成骨細胞中Osx 蛋白的表達，提高了3.08倍。

2.5 BMP-2體外條件性敲除實驗結(jié)果

為進一步研究異補骨脂素誘導(dǎo)成骨細胞分化的作用機理，從Bmp2loxp/loxp小鼠中分離培養(yǎng)顱蓋骨成骨細胞，用Ad-Cre 慢病毒體外將BMP2 基因敲除（Ad-GFP做為野生型對照）。Real-time PCR 反應(yīng)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)Ad-Cre 慢病毒干預(yù)后成骨細胞中BMP2 的表達顯著降低，BMP2 基因敲除效率達80%以上，說明BMP2基因敲除成功，如圖3所示。之后分別給予最佳濃度（10 μg·mL-1）的異補骨脂素干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異補骨脂素可明顯促進Ad-GFP 處理的野生型對照組成骨細胞中Runx2（圖4）和Osx（圖5）基因的表達，分別提高了7.2倍和5.9倍。但這種作用在BMP2缺失的成骨細胞中部分消失，僅僅提高了4.6 倍和3.2 倍。通過堿性磷酸酶（ALP）染色，發(fā)現(xiàn)異補骨脂素可明顯促進Ad-GFP 處理的野生型對照組成骨細胞中ALP 染色強表達，而這種作用在BMP2 缺失的成骨細胞中部分減弱（圖6）。上述結(jié)果均表明異補骨脂素促進成骨細胞分化具有BMP2部分依賴性。

圖3 BMP2基因敲除效率

圖4 異補骨脂素促進Runx2基因表達部分依賴于BMP2

圖5 異補骨脂素促進Osx基因表達部分依賴于BMP2

圖6 異補骨脂素促進ALP表達部分依賴于BMP2

3 討論

成骨細胞在骨代謝的體外研究中非常重要，為研究具有刺激骨形成藥物及作用機理提供重要的細胞模型。動物成骨細胞一般來源于胎鼠或新生鼠的顱骨，這些細胞所處的分化時期不同，性質(zhì)不完全相同[10]。本實驗中，選用的OCT1細胞株是從過表達骨鈣素轉(zhuǎn)基因小鼠的顱蓋骨中分離獲得的成骨細胞，生長旺盛、性質(zhì)穩(wěn)定，可以大量滿足實驗研究的需要[11]。

中醫(yī)學(xué)認為，腎主骨生髓，一旦腎氣衰微，腎精不足，則會發(fā)生骨質(zhì)疏松，正如《素問·痿論》中所說“骨枯髓減，發(fā)為骨痿”。腎中精氣宜充不宜虧，治療骨質(zhì)疏松癥以補腎益精為主，代表方劑如腎氣丸、左歸丸、右歸丸等，藥物有仙靈脾、補骨脂、熟地、骨碎補、杜仲、枸杞、牛膝等[12-13]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，這些補腎方藥可以提高成骨細胞的增殖率、增加ALP 活性，因而促進成骨細胞骨形成功能[14-17]。但對于這些補腎方藥中的具有促進成骨細胞增殖的有效組分尚缺乏系統(tǒng)的研究。通過本實驗發(fā)現(xiàn)，補骨脂中的有效組分異補骨脂素能明顯促進成骨細胞的增殖，并以10 μg·mL-1濃度作用最強。

1965 年，Urist[18]發(fā)現(xiàn)在脫鈣的骨基質(zhì)中存在著一種特殊的蛋白質(zhì)，能誘導(dǎo)異位成骨，后來就被命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）。迄今為止發(fā)現(xiàn)了20 多種BMP，除BMP1 外，其他BMPs均屬于TGF-β 超家族成員，可通過旁分泌和自分泌的形式誘導(dǎo)骨、軟骨及與骨有關(guān)的結(jié)締組織的形成，還能誘導(dǎo)骨源和非骨源性細胞的成骨分化[19]。在成骨細胞中，BMPs 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對骨形成起至關(guān)重要的作用。BMP2被認為是TGF-β超家族中活性最高且能單獨誘導(dǎo)成骨的因子，其高表達可以促進成骨細胞的分化[20-21]。通過本實驗發(fā)現(xiàn)，異補骨脂素能促進BMP2的表達，從而誘導(dǎo)成骨，并以低劑量（10 μg·mL-1）及中劑量（30 μg·mL-1）作用較強，而高劑量（30 μg·mL-1）作用較弱。

Runx2屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族成員，是與BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游分子Smad1 和Smad5 相互作用，從而調(diào)節(jié)成骨細胞的分化[22-24]。在沒有BMP2 作用時，Runx2 單獨表達雖然能抑制成肌細胞分化，但不能上調(diào)骨鈣素的表達，而在BMP2 作用下，過表達Runx2 誘導(dǎo)產(chǎn)生的骨鈣素水平高于BMP-2 的單獨作用，說明BMP2 和Runx2 具有協(xié)同作用。以上結(jié)果均表明Runx2 在BMP-2 激活成骨的信號途徑中起了非常重要的作用[25-26]。Runx2 是成骨細胞分化所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可協(xié)同其下游的Osx 調(diào)節(jié)成骨細胞特異性基因的表達，從而影響成骨細胞分化[27-28]。通過本實驗，發(fā)現(xiàn)異補骨脂素可以誘導(dǎo)Runx2 mRNA 和Osx mRNA 的高表達，并以低劑量（10 μg·mL-1）和中劑量（30 μg·mL-1）作用最強。

條件性基因敲除（Conditional gene knockout）是指為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法[29]。實際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶介導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。目前廣泛應(yīng)用方法就是利用Cre/LoxP 重組酶系統(tǒng)來研究小鼠特定組織器官或特定細胞中靶基因滅活所導(dǎo)致的表型。Cre 重組酶是一種位點特異性重組酶，能識別并介導(dǎo)兩個LoxP 位點（序列）之間的特異性重組，使LoxP 位點間的基因序列被刪除或重組[30]。如果將“LoxP Floxed”小鼠的細胞轉(zhuǎn)染病毒介導(dǎo)的Cre 重組酶，可產(chǎn)生靶基因發(fā)生特定方式修飾的條件性敲除細胞，這是一種體外條件性基因敲除方法。在“LoxP Floxed”小鼠或細胞，正常情況下同野生型的一樣，只有遇到Cre 重組酶時才會導(dǎo)致靶基因的突變[31]。本實驗為進一步驗證異補骨脂素通過介導(dǎo)BMP2 增加Runx2 和Osx 表達而誘導(dǎo)成骨細胞分化的作用機理，從BMP2loxp/loxp小鼠中分離培養(yǎng)顱蓋骨成骨細胞，用Ad-Cre 慢病毒體外將BMP2 基因敲除，然后給予低劑量（10 μg·mL-1）異補骨脂素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)異補骨脂素誘導(dǎo)的Runx2 和Osx 高表達呈BMP2 的依賴性。因此，本實驗結(jié)果首次證明了異補骨脂素通過促進BMP2/Runx2/Osx 信號通路的激活，從而誘導(dǎo)成骨細胞分化。