姜禾 金可欣 陳怡彤 吳江源 雷張辰 汪淑華*

迄今為止，已有多種牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）從具有外胚間充質(zhì)來源的牙齒和牙周組織中分離出來，主要包括牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、脫落乳牙干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、根尖乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAP）、牙囊干細(xì)胞（dental follicle stem cells，DFSC）、唾液腺干細(xì)胞（salivary gland stem cells，SGSCs）等。研究表明［1］，牙源性MSCs 可以與生長因子產(chǎn)生協(xié)同作用，使疾病的干細(xì)胞治療產(chǎn)生更好的效果，此類以組織工程學(xué)為基礎(chǔ)的疾病治療方式，已成為目前的研究熱點(diǎn)。本文對聯(lián)合生長因子的牙源性MSCs 治療的研究進(jìn)展作如下綜述。

1 口腔疾病的干細(xì)胞治療

1.1 頜骨缺損修復(fù)

1.1.1 表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF） EGF 可通過高親和力結(jié)合細(xì)胞表面的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）并提高內(nèi)在蛋白酪氨酸激酶活性而發(fā)揮作用。EGFR 的激活可啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、遷移和侵襲等多種生物學(xué)功能［2］。作為EGF 的重要組成部分，上皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EREG）可由人顆粒細(xì)胞在促炎細(xì)胞因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的誘導(dǎo)下合成，并進(jìn)一步激活MAPK 通路［3］，EREG可以通過激活MAPK 信號通路促進(jìn)DPSCs 成骨/牙本質(zhì)分化，促進(jìn)缺損頜骨的修復(fù)。然而另一項研究表明，EREG 可以通過p38 MAPK 和ERK 信號通路抑制DPSCs 的成骨/牙本質(zhì)分化潛能，在炎癥環(huán)境下，EREG 耗竭能改善p38 MAPK 和ERK 的表達(dá)并增強(qiáng)DPSCs 的骨/牙本質(zhì)分化潛能［4］。EREG作用濃度的不同可能是造成其在不同研究中產(chǎn)生不同效果的原因。EGF 作為細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑具有誘導(dǎo)方法簡單、無毒的優(yōu)點(diǎn)［5］。但目前關(guān)于EGF 對MSCs 成骨分化的確切作用機(jī)制仍未得到詳細(xì)闡明，不同EGF 濃度、加入EGF 的時機(jī)、不同EGF 家族成員、MSCs 培養(yǎng)過程等都可能通過影響EGFR的活化程度來影響MSCs 成骨分化，并進(jìn)一步影響缺損頜骨的修復(fù)程度，為了保證調(diào)節(jié)作用的安全性、穩(wěn)定性、持久性，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

1.1.2 促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO） EPO 是一種能加速M(fèi)SCs 募集的重要生長因子，其具備多種方式改善MSCs的成骨分化，包括通過增加細(xì)胞因子的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)核因子-κB 配體信號傳導(dǎo)的受體激活因子等［6］。EPO 可以通過增加細(xì)胞增殖、遷移和分化的方式誘導(dǎo)MSCs 的成骨［7］。EPO可以通過p38 MAPK 的磷酸化增強(qiáng)PDLSC 中的骨形成，此過程中成骨基因Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）的表達(dá)有所提高［6］。EPO 治療可促進(jìn)頜骨在骨折期間的愈合，但是在健康動物中給藥時則會導(dǎo)致骨丟失［8］。此外，高劑量的EPO（50U/ml）會使細(xì)胞活力下降［9］，對于其給藥濃度也有待進(jìn)一步研究。

1.1.3 胰島素樣生長因子 胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）是一種多功能肽，對骨骼生長、修復(fù)和重塑起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［10］，其中一種多肽生長因子（即IGF-1）是IGF 軸中最重要的成員［11］。IGF-1 可以顯著促進(jìn)DPSCs、SCAP、PDLSCs 等多種牙源性MSCs 的成骨/牙本質(zhì)分化［11］。在早期成骨和晚期成骨的階段，IGF-1 都可以通過MAPK 通路上調(diào)ALP、OCN、RUNχ2和Osterix 蛋白（osterix，OSX）的表達(dá)，促進(jìn)PDLSCs 的成骨分化［10］。此外，IGF-1/IGF-1R/hsa-let-7c 軸也可以通過調(diào)節(jié)JNK 和p38 MAPK 信號通路來控制IGF-1 處理的SCAP 的成骨分化。IGF-1R 不僅可與IGF-1 結(jié)合發(fā)揮作用，其本身也可以調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化［11］。然而，全身應(yīng)用IGF-1 可能在一定程度上導(dǎo)致癌癥發(fā)病率的增高［12］。

1.1.4 轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） TGF-β 是一種與膜內(nèi)骨形成聯(lián)系密切的多功能細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、骨折修復(fù)、骨骼發(fā)育以及細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用［13］。其中TGF-β3 在TGF-β 家族中占據(jù)重要的地位，已在體內(nèi)用于修復(fù)頜骨、再生組織和愈合傷口，同時還能促進(jìn)基質(zhì)形成和維持牙源性MSCs 的特性［3］。TGF-β3 可激活特異性Ⅰ型、Ⅱ型受體并與之相互作用，將信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶1（transforming growth factor activated kinase 1，TAK1），并由此進(jìn)一步激活MAPK 激酶3/6（MAPK kinase 3/6，MKK3/6），磷酸化的MKK3/6 又能激活下游的p38 MAPK，后者可直接進(jìn)入細(xì)胞核，上調(diào)成骨相關(guān)基因RUNχ2的表達(dá)，促使牙源性MSCs成骨分化［1］。已有研究證實，TGF-β3 能通過p38 MAPK 通路誘導(dǎo)PDLSCs 和DPSCs 的成骨分化［3］。TGF-β 與骨形態(tài)蛋白聯(lián)合后，雙向調(diào)控成骨細(xì)胞分化的作用會更加持久，TGF-β不僅可作為理想細(xì)胞因子應(yīng)用于軟骨組織工程，也可以通過軟骨內(nèi)骨化途徑促進(jìn)頜骨修復(fù)，在未來的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

1.1.5 成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF） FGF 是一系列在各種生物學(xué)過程中具有旁分泌、自分泌和內(nèi)分泌功能的蛋白質(zhì)［14］。有研究表明，經(jīng)堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）處理激活的ERK1/2 信號可抑制WNT/β- catenin 通路，降低MSCs 標(biāo)志物基質(zhì)細(xì)胞抗原1（stromal cell antigen 1，STRO-1）、CD146、CD73 和CD90 的表達(dá)水平，導(dǎo)致SHED 的成骨缺陷［15］。然而，bFGF 與IGF-1 協(xié)同作用時則可正向刺激MSCs 的增殖和分化，促進(jìn)頜骨的重建修復(fù)［16］。對于FGF2，其既可以作為正調(diào)節(jié)因子促進(jìn)成骨，也可以作為負(fù)調(diào)節(jié)因子抑制成骨。作為正調(diào)節(jié)因子時，F(xiàn)GF2 可通過JNK 信號通路促進(jìn)人牙髓來源的MSCs 的成骨分化，也可通過ERK 和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路促進(jìn)MSCs 的分化［17］。FGF-21 通過多調(diào)信號通路保持機(jī)體的骨穩(wěn)態(tài)［18］，而FGF-23 則在調(diào)節(jié)維生素D、磷酸鹽和鈣代謝過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其代謝軸對骨骼健康的維持和全身礦物質(zhì)的平衡具有重要作用［19］。但是，較低濃度的FGF-21 和FGF-23 可能與妊娠期糖尿病的病理生理有關(guān)，其雖然不是妊娠期糖尿病的基本因素，但仍可能對妊娠期機(jī)體的代謝造成不利影響［20］。

1.1.6 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） VEGF 是骨形成和愈合過程中調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵生長因子，其在骨整合中有兩個作用：增強(qiáng)血管生成和響應(yīng)Ti 表面特性在成骨細(xì)胞樣細(xì)胞成熟中的自分泌/旁分泌作用［21］。在骨折或骨缺損區(qū)域，VEGF 通過參與新生血管的形成，趨化MSCs 向損傷區(qū)域集合并產(chǎn)生成骨分化，修復(fù)缺損的頜骨［22］。使用VEGF 的靶向補(bǔ)充劑來預(yù)防或治療臨床上存在的頜骨愈合缺陷時，將需要臨床證據(jù)來證明VEGF 水平與骨骼健康之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)，以及更好地了解在其他生長因子、干細(xì)胞和骨基質(zhì)蛋白合成的背景下VEGF 如何發(fā)揮作用。

1.2 牙周組織再生 由菌斑微生物引起的牙周病常導(dǎo)致牙齒松動、脫落，慢性牙周炎是常見的牙周病之一，會引起的骨和結(jié)締組織損傷，并抑制機(jī)體的成骨作用。治療此類牙周組織破壞性、炎癥性疾病的最終目的是實現(xiàn)牙周的重建與再生。牙源性MSCs 可達(dá)成高效、低風(fēng)險修復(fù)牙周組織的目的，與靶組織也高度相似。而TGF-β、bFGF 等生長因子可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化［23-24］。因此，由生長因子介導(dǎo)的牙源性MSCs 治療，有著廣闊的應(yīng)用前景，有望成為牙周組織重建與再生的一種新型治療策略。然而，目前如FGF2 等生長因子在體內(nèi)的半衰期較短，注射3d 后在注射部位僅存留不到10%，還需要更多臨床實驗研究，實現(xiàn)牙周再生的長期高效治療［23］。

1.3 牙髓再生 研究表明，多種生長因子可促進(jìn)MSCs 的遷移、增殖、分化，治療牙髓炎、牙髓壞死導(dǎo)致的牙髓丟失，促進(jìn)組織再生［25］。具體解釋為，根管沖洗后，牙本質(zhì)將釋放VEGF-A、VEGF-D、TGF-β1、TGF-β2 等11 種生長因子至根管［26］，牙源性MSCs 在生長因子的引導(dǎo)下得以激活。研究證實，生長因子其既可以加速內(nèi)源性干細(xì)胞向受傷部位的募集，進(jìn)而改善再生能力，也可以促進(jìn)外源性移植干細(xì)胞向受體組織動員和植入，從而促進(jìn)牙髓再生［24］。但是，目前已實現(xiàn)的牙髓組織再生僅局限在牙髓牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)、血管樣結(jié)構(gòu)的再生，并未實現(xiàn)牙髓對應(yīng)生物學(xué)功能的重建［27］。如何實現(xiàn)牙髓結(jié)構(gòu)和功能的完全再生，仍亟待探索和解決。

1.4 免疫調(diào)節(jié) NAKAO 等［28］表明，牙齦組織來源的MSCs 在腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）處理的條件下，外泌體得以表達(dá)CD73，這將進(jìn)一步誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化，使得牙周炎消退，牙周再生增強(qiáng)。OGASAWARA 等［29］證實，SHED 中含有包括IGF、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）等在內(nèi)的51 種陣列蛋白，其可抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軟骨層的增殖和基質(zhì)沉積，修復(fù)骨關(guān)節(jié)紊亂，最終得以治療顳下頜關(guān)節(jié)炎。OGATA 等［30］研究認(rèn)為，DPSC 可通過減少炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，以TGF-β 途徑誘導(dǎo)脾臟中的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）控制局部炎癥微環(huán)境，抑制細(xì)胞凋亡，改善由干燥綜合征引起的唾液分泌過低。

由此可得，在牙周炎、顳下頜關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等炎癥微環(huán)境中，適宜的牙源性MSCs 和生長因子的預(yù)處理有助于形成良性的免疫調(diào)節(jié)，抑制炎癥反應(yīng)帶來的不良影響。然而，MSCs 的體外和體內(nèi)研究結(jié)果存在一定差異，如何找到體內(nèi)外的細(xì)胞活動機(jī)制的共性仍有待進(jìn)一步研究［31］。

2 全身疾病的干細(xì)胞治療

相較于其他MSCs，牙源性MSCs 具有更強(qiáng)的自我更新和多向分化潛能，同時因其免疫原性低、取材創(chuàng)傷小等諸多優(yōu)勢，已被認(rèn)為是全身組織再生的理想干細(xì)胞來源。已有大量研究證實，結(jié)合生長因子的牙源性MSCs 治療，可應(yīng)用于脊髓損傷［32］、阿爾茲海默癥［32］、帕金森癥［33］、視網(wǎng)膜退行性疾?。?4］、糖尿?。?5］等疾病。

在科學(xué)技術(shù)和生物材料進(jìn)一步發(fā)展的大背景下，基于其優(yōu)秀的干細(xì)胞性能和臨床應(yīng)用價值，牙源性MSCs 治療全身性疾病將迎來更廣闊的應(yīng)用前景。但是，可溶性生長因子和外泌體的生物屬性和具體分子機(jī)制仍未得到系統(tǒng)全面的闡述，對其進(jìn)行更深刻的了解是加快其使用統(tǒng)一、技術(shù)普及并應(yīng)用于全身治療的必要條件。

3 小結(jié)與展望

目前，牙源性MSCs 應(yīng)用于各種組織損傷性疾病的前景較為廣闊。然而，當(dāng)前生長因子的收集過程步驟復(fù)雜，收集所得的濃度和含量也往往較低，無法達(dá)到最佳的治療效果。此外，生長因子對牙源性MSCs 的作用條件仍未得到系統(tǒng)闡述，對其作用機(jī)制的研究也尚不完善，使用不當(dāng)可能造成腫瘤、骨丟失等不良后果。目前，干細(xì)胞移植的應(yīng)用范圍也較狹窄，對牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞和生長因子進(jìn)行更深入的探究是了解其對再生醫(yī)學(xué)的功效程度的先決條件，希望未來此項技術(shù)能得到更多的研究，并在臨床上得到更全面完善的應(yīng)用。