寇 敏,徐詩(shī)音,焦魯楊,杜夢(mèng)穎,李樹(shù)奇,孔祥蕾,2,3

(1.南開(kāi)大學(xué)化學(xué)學(xué)院,元素有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071;2.南開(kāi)大學(xué)有機(jī)新物質(zhì)創(chuàng)造前沿科學(xué)中心,天津 300071;3.南開(kāi)大學(xué)化學(xué)學(xué)院,天津市生物傳感與分子識(shí)別重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300071)

自由基在涉及蛋白質(zhì)和DNA等生物分子的反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。核苷自由基在生物體內(nèi)可能引發(fā)一系列重要的反應(yīng),如氧化、還原、自由基鏈?zhǔn)降?這些反應(yīng)可以導(dǎo)致DNA和RNA的進(jìn)一步損傷,從而對(duì)細(xì)胞的正常功能和遺傳信息造成影響。近年來(lái),有研究[1-3]表明,核苷自由基是RNA/DNA損傷的關(guān)鍵中間體。以氮為中心的核苷自由基通常是暴露于γ射線或氧化劑的DNA產(chǎn)生的反應(yīng)中間體,但對(duì)其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)以及相關(guān)反應(yīng)的細(xì)節(jié)仍不清楚。為研究反應(yīng)中形成的瞬態(tài)物種,科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了多種產(chǎn)生核苷自由基的方法,然而,由于不同方法產(chǎn)生的自由基可能具有不同的位點(diǎn),因此對(duì)產(chǎn)生的自由基及其異構(gòu)體結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)確定非常重要,但也非常困難。

一般情況下,DNA電離通過(guò)氧化或還原途徑進(jìn)行,分別形成陽(yáng)離子自由基和陰離子自由基中間體。以腺嘌呤為例,目前公認(rèn)的堿基自由基形成機(jī)制有2種[4]:一種是通過(guò)氧化電離產(chǎn)生瞬態(tài)陽(yáng)離子自由基,這些陽(yáng)離子自由基通過(guò)電子或質(zhì)子轉(zhuǎn)移后進(jìn)一步反應(yīng);另一種是通過(guò)還原電離捕獲電子,形成短壽命的陰離子自由基,通過(guò)陰離子消除或溶劑質(zhì)子化轉(zhuǎn)化為自由基。在液相研究中,羥基自由基直接進(jìn)攻核苷是一種常用的方法[5-7],可以選擇性地產(chǎn)生羥基自由基,使其與核苷發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生核苷自由基。此外,一些研究人員利用其他自由基氧化劑,如硫酸根自由基[8-9]、氯自由基[10]等,在適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)核苷的氧化反應(yīng)產(chǎn)生核苷自由基,并利用瞬態(tài)吸收光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。這些方法均具有較高的選擇性和靈敏度,但需要準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)條件和選擇合適的試劑。

在凝聚相中產(chǎn)生的這些不穩(wěn)定自由基很容易與所處的環(huán)境分子(如溶劑分子)發(fā)生一系列反應(yīng),使它們的結(jié)構(gòu)分析更復(fù)雜。利用氣相中的離子分子不受溶劑和抗衡離子效應(yīng)干擾的優(yōu)勢(shì)[11-12],科學(xué)家們?cè)跉庀嘀袑?duì)相關(guān)自由基進(jìn)行研究,通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算結(jié)果,能夠從分子水平上更加清晰地獲得它們的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)信息。近年來(lái),隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,尤其是串聯(lián)質(zhì)譜法以及電噴霧電離(ESI)[13]的廣泛應(yīng)用,使氣相自由基的相關(guān)研究取得了很大進(jìn)步。

本文將聚焦基于質(zhì)譜技術(shù)的堿基自由基與核苷自由基的氣相研究,詳細(xì)介紹它們的產(chǎn)生方式、研究方法以及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展。

1 氣相中堿基核苷自由基的產(chǎn)生方法

傳統(tǒng)的電子轟擊電離(EI)雖然可以用來(lái)產(chǎn)生核苷自由基離子,但受產(chǎn)率的影響,難以進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)研究。為揭示核苷自由基的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),研究人員開(kāi)發(fā)了一些新的自由基產(chǎn)生方法,如利用堿基與金屬離子和相關(guān)配體形成的配合物通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離(CID)產(chǎn)生自由基離子[14-15],使用不同的前體分子并結(jié)合各種離子活化技術(shù)在氣相中制備多種類型的自由基離子等,示于圖1。

圖1 氣相中堿基、核苷和核苷酸陽(yáng)離子自由基的形成方法Fig.1 Formation methods of cationic free radicals of base, nucleoside, and nucleotide in gas phase

1.1 EI源直接產(chǎn)生

最早,研究人員采用高能電子撞擊電離(EI)技術(shù)產(chǎn)生核苷堿基的自由基陽(yáng)離子,示于圖1a。由于含氮的核苷堿基是富電子體,在初期形成核酸自由基時(shí),電子空穴主要集中在堿基上,產(chǎn)生以堿基為中心的自由基。在氣相中,核苷堿基的電離能量從低到高依次為鳥(niǎo)嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、尿嘌呤(U)[16-18]。有關(guān)核苷構(gòu)建模塊的報(bào)道大多數(shù)是基于高能電子碰撞電離方法研究堿基自由基陽(yáng)離子的碎裂途徑[19-20],然而,由于方法本身的局限性,缺乏對(duì)自由基深入的研究。

1.2 三元過(guò)渡金屬配合物

O’Hair等[21]研究表明,一些核苷自由基陽(yáng)離子可以通過(guò)ESI形成的三元金屬配合物離子[M(L3)(N)]2+(M:Cu(Ⅱ),Pt(Ⅱ);L:dien,tpy,Nu:A,dA,G,dG,C,dC)的碰撞誘導(dǎo)解離引發(fā)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生,示于圖1b[21]。隨后,研究人員先后研究了脫氧胞苷-脫氧鳥(niǎo)苷配對(duì)、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤[22-25]。以三聯(lián)吡啶(terpy)作為配體,將ESI產(chǎn)生的[M(Ⅱ)(L3)N]2+(m/z211)作為前體離子,通過(guò)CID方法可以在其串聯(lián)質(zhì)譜圖上觀察到胸腺嘧啶自由基陽(yáng)離子(m/z126),示于圖2。

圖2 [Cu(terpy)(thymine)]2+·離子的CID質(zhì)譜圖[24]Fig.2 Collision-induced dissociation mass spectrum of [Cu(terpy)(thymine)]2+·[24]

1.3 引入自由基引發(fā)劑

注:a.MS2m/z 570;b.MS3m/z 416;c.MS4m/z 291圖3 多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜顯示A+·的形成過(guò)程[26]Fig.3 Formation process of A+· by multistage tandem mass spectrometry[26]

1.4 電荷基團(tuán)標(biāo)記法

圖4 m/z 414.5處(12++DBCE)的ETD-MS2質(zhì)譜圖(a),插圖為m/z 469處1+·的CID-MS3質(zhì)譜圖;m/z 394.5處(22++DBCE)的ETD-MS2質(zhì)譜圖(b),插圖為m/z 429處2+·的CID-MS3質(zhì)譜圖[28]Fig.4 ETD-MS2 spectrum of (12++DBCE) at m/z 414.5 (a), the inset shows the CID-MS3 spectrum of 1+· at m/z 469; ETD-MS2 spectrum of (22++DBCE) at m/z 394.5 (b), the inset shows the CID-MS3 spectrum of 2+· at m/z 429[28]

1.5 紫外光解離法

光解離法通過(guò)使用光能將分子激發(fā)到激發(fā)態(tài)進(jìn)而生成自由基[33-34]。該方法具有靈活性和可擴(kuò)展性,通過(guò)調(diào)整激光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和脈沖寬度等參數(shù),可以有效控制核苷自由基的產(chǎn)生?？紫槔僬n題組[35]通過(guò)在傅里葉變換離子回旋共振(FT-ICR)分析池中對(duì)鋰離子化或鈉離子化的2-碘代核苷陽(yáng)離子進(jìn)行UV照射,使其發(fā)生C—I鍵均裂,進(jìn)而產(chǎn)生核苷及配對(duì)核苷自由基陽(yáng)離子,示于圖1f。將鋰離子化或鈉離子化的2-碘代核苷陽(yáng)離子選擇出來(lái),然后引入紫外激光,在紫外光解離-串聯(lián)質(zhì)譜(UVPD-MS2)圖中可以觀察到相應(yīng)的腺苷自由基陽(yáng)離子[36],示于圖5。該方法可以通過(guò)在不同位置靈活地引入C—I 鍵來(lái)制備不同自由基異構(gòu)體。

注:a.c.分別為質(zhì)量選擇后的母離子m/z 400.00、415.98;b.d.分別為m/z 400.00、415.98對(duì)應(yīng)的紫外光解離質(zhì)譜圖(280 nm,照射5 s)圖5 [IAde+Li]+(a,b)和[IAde+Na]+(c,d)的質(zhì)譜圖[36]Fig.5 Mass spectra of [IAde+Li]+ (a,b)和[IAde+Na]+ (c,d)[36]

1.6 中和-再電離質(zhì)譜法

2 氣相中堿基核苷自由基結(jié)構(gòu)的研究方法

對(duì)于在氣相中產(chǎn)生與DNA相關(guān)的自由基離子,可以在質(zhì)譜儀中進(jìn)行質(zhì)量選擇,并利用串聯(lián)質(zhì)譜和光解離光譜等方法進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)、反應(yīng)性和動(dòng)力學(xué)。對(duì)目標(biāo)自由基離子進(jìn)行選擇后,可以采用不同的離子活化方法進(jìn)行活化,并進(jìn)一步利用串聯(lián)質(zhì)譜研究裂解通道和產(chǎn)物。目前,離子活化手段主要有CID、紅外多光子光解離光譜(IRMPD)以及紫外-可見(jiàn)光解離(UV-VisPD),采用可調(diào)諧激光可進(jìn)一步獲得自由基離子的IRMPD光譜或UVPD光譜。另外,還有一些結(jié)合質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜研究離子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的方法,如與相關(guān)物種的反應(yīng)質(zhì)譜[4,37-38]、光電子能譜(PES)[39-45]以及離子碰撞橫截面(CCS)測(cè)量[46-51]等,示于圖6。其中,PES在自由基研究中的應(yīng)用較廣泛,但主要集中于小分子自由基,如丙烯自由基和苯胺自由基等[40-41,44];基于離子遷移的CCS測(cè)量已逐漸增多,但只有少數(shù)研究涉及若干陽(yáng)離子自由基[46-51],這是因?yàn)樽杂苫牟环€(wěn)定性導(dǎo)致其在遷移過(guò)程中可能伴隨CCS改變。

圖6 基于不同串聯(lián)質(zhì)譜方法的堿基與核苷自由基的結(jié)構(gòu)研究Fig.6 Structural study of free radicals of bases and nucleosides based on different tandem mass spectrometry methods

由于目前大部分商品化質(zhì)譜儀不提供IRMPD和UVPD光譜的功能,為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo),需要對(duì)其進(jìn)行改造。這要求所選擇的質(zhì)譜儀應(yīng)具備較強(qiáng)的多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜能力或多種活化手段,以便能夠產(chǎn)生相應(yīng)的自由基離子。其中,基于離子阱的用于串聯(lián)MSn-UVPD光譜學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)裝置主要有2種[52]:1種是基于Thermo LTQ質(zhì)譜儀改造的,以實(shí)現(xiàn)將紫外光束引入線性離子阱中,改造的主要方法是在用于產(chǎn)生陰離子的輔助化學(xué)電離源的插入塊中鉆出直徑為1 mm的孔,并使用1塊在入射光束路徑位置上有1個(gè)密封石英窗的鋁板取代化學(xué)電離源的背面真空法蘭,示于圖7a;另1種是基于Bruker amaZon質(zhì)譜儀改造的,將紫外光束引入3D離子阱中,在環(huán)形電極上鉆出2個(gè)直徑1 mm的孔(分別在頂部中心和底部中心),將改裝后的環(huán)形電極正上方的真空法蘭更換為紫外線窗口法蘭,同時(shí)將2個(gè)反射鏡固定在改裝后的環(huán)形電極下方,示于圖7b。

注:a.改造后的Thermo LTQ質(zhì)譜儀;b.改造后的Bruker amaZon質(zhì)譜儀;c.實(shí)驗(yàn)裝置示意圖;d,e.實(shí)驗(yàn)裝置實(shí)物圖,PG表示脈沖發(fā)生器,SC表示快門(mén)控制器圖7 通過(guò)引入可調(diào)諧激光,可獲取MSn-UVPD光譜的儀器裝置(a,b)[52];通過(guò)向FT-ICR質(zhì)譜儀引入可調(diào)諧激光,可獲取MSn-UVPD和IRMPD光譜的儀器裝置(c～e)[35] Fig.7 Instrument setups for obtaining MSn-UVPD spectra by introducing tunable lasers (a, b)[52]; instrument setup for obtaining MSn-UVPD and IRMPD spectra by introducing tunable lasers in a FT-ICR mass spectrometer (c-e)[35]

為了能夠在同一臺(tái)質(zhì)譜儀上同時(shí)獲得目標(biāo)離子的紅外及紫外光解離質(zhì)譜與光譜,孔祥蕾課題組[35]將2束可調(diào)諧激光引入到1臺(tái)磁場(chǎng)強(qiáng)度為7.0 T的FT-ICR質(zhì)譜儀分析池中,示于圖7c、7d。其中,1臺(tái)是紫外-可見(jiàn)OPO激光器,可用于產(chǎn)生堿基自由基陽(yáng)離子或核苷自由基陽(yáng)離子,也可用于研究紫外光解離質(zhì)譜與光譜;另1臺(tái)是可調(diào)諧紅外激光器,輸出波長(zhǎng)范圍為2 700～3 800 cm-1,可以對(duì)自由基離子的紅外光解離光譜進(jìn)行研究。該裝置雖然不具備ETD功能,但可以實(shí)現(xiàn)IRMPD、UVPD、CID等3種離子活化方法的任意結(jié)合,并共同作用于同一離子[11-12,35-36]。

3 氣相中堿基核苷自由基結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展

近年來(lái),科學(xué)家們基于以上自由基的產(chǎn)生方法和結(jié)構(gòu)研究手段[22-32,36-38],并結(jié)合理論計(jì)算[53-54],對(duì)核苷自由基離子的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性進(jìn)行了較全面的研究。核酸中的核苷是由嘌呤或嘧啶堿基與核糖或脫氧核糖縮合而成,一般來(lái)說(shuō),核糖分子中的碳原子(C1)與嘧啶分子中的氮原子(N1)或嘌呤分子中的氮原子(N9)之間形成糖苷鍵,稱為核糖核苷。為方便文章閱讀,對(duì)堿基及糖環(huán)上的原子進(jìn)行編號(hào),示于圖8。

圖8 堿基及糖環(huán)上的原子編號(hào)Fig.8 Reference numbers for the atoms on base and sugar rings

3.1 腺嘌呤以及腺苷自由基

Turecek等[25]利用三元過(guò)渡金屬配合物通過(guò)碰撞誘導(dǎo)解離形成腺嘌呤(A)和9-甲基腺嘌呤的陽(yáng)離子自由基,提出了腺嘌呤可能存在的異構(gòu)體,并通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜和基于理論計(jì)算的振動(dòng)光譜證明了離子化的嘌呤核堿基在氣相中傾向于形成經(jīng)典互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu);為了研究氫原子與腺苷結(jié)合位點(diǎn),該課題組利用固定電荷基團(tuán)標(biāo)記法在氣相中產(chǎn)生帶有固定電荷基團(tuán)的腺苷自由基,通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜、氘標(biāo)記和UV/Vis作用光譜對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,發(fā)現(xiàn)帶電荷標(biāo)記的自由基在波長(zhǎng)200～600 nm處有紫外吸收;同時(shí)還考慮了H原子結(jié)合在N1、C2、N3、N7、和C8這5種情況,通過(guò)開(kāi)展氘標(biāo)記實(shí)驗(yàn),得出H原子僅結(jié)合在N1、N3和N7位點(diǎn)上;進(jìn)一步與分子動(dòng)力學(xué)、從頭計(jì)算和激發(fā)態(tài)計(jì)算相結(jié)合,明確此處產(chǎn)生的腺苷自由基為N7氫原子加合物。Gerbaux等[4]利用NRMS方法產(chǎn)生腺嘌呤自由基,并將電噴霧電離、氣相離子化學(xué)和碰撞電子轉(zhuǎn)移相結(jié)合,發(fā)現(xiàn)N1氫原子加合物最穩(wěn)定,被認(rèn)為是DNA放射性損傷的初始中間體之一。

為了揭示堿金屬離子與腺苷自由基的相互作用,孔祥蕾課題組[36]利用紫外光解離法產(chǎn)生鋰離子化和鈉離子化的腺苷自由基,示于圖9,通過(guò)將紅外多光子解離與理論計(jì)算相結(jié)合,確定了2種自由基最穩(wěn)定的異構(gòu)體,它們具有金屬離子三配位模式的共同特征。對(duì)于這2種自由基物種而言,最低能量的異構(gòu)體都經(jīng)歷了氫轉(zhuǎn)移,但考慮到C—I均裂后直接形成的自由基具有一些相似的光譜特性,不能排除存在經(jīng)直接均裂后生成的自由基異構(gòu)體。

圖9 [Ade+Li-H]+·(a)和[Ade+Na-H]+·(b)的紅外實(shí)驗(yàn)光譜圖[36]Fig.9 Experimental IRMPD spectra of [Ade+Li-H]+· (a) and [Ade+Na-H]+· (b)[36]

3.2 胸腺嘧啶以及胸苷自由基

3.3 鳥(niǎo)嘌呤以及鳥(niǎo)苷自由基

對(duì)于與腺嘌呤結(jié)構(gòu)相似的鳥(niǎo)嘌呤(G)來(lái)說(shuō),Marek等[29]利用電荷標(biāo)記法在氣相中產(chǎn)生(G+H)·型鳥(niǎo)苷自由基,作者首先考慮了N1、N7、N3、O6這4種質(zhì)子化位點(diǎn),然后通過(guò)CID、UVPD和紫外-可見(jiàn)光譜與理論計(jì)算相結(jié)合,表征離子為N7-H鳥(niǎo)苷自由基互變異構(gòu)體,發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)光和近紫外區(qū)域的吸收帶是H原子結(jié)合在N7位上特異性(G+H)·型鳥(niǎo)苷自由基的特征。

3.4 胞嘧啶以及胞苷自由基

對(duì)于1+·來(lái)說(shuō),通過(guò)監(jiān)測(cè)m/z468(損失H)、358(損失胞嘧啶)、343(丟失甲基胞嘧啶)、272這4個(gè)主要的光碎片離子通道,從紫外光譜圖中觀察到最強(qiáng)的吸收在250 nm處,而在500 nm以上未觀察到光解離,示于圖10a。對(duì)于2+·來(lái)說(shuō),主要吸收帶在250、300 nm處,有m/z428(損失H)、259、203等3個(gè)主要碎片離子通道,示于圖10b。總體而言,胞苷自由基在動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)上比先前報(bào)道[27,29]的類似腺苷和鳥(niǎo)苷自由基更穩(wěn)定。

圖10 1+·(a)、2+·(b)自由基離子的紫外光解離光譜圖[28]Fig.10 Experimental UVPD spectra of 1+· (a) and 2+· (b) radical ions[28]

3.5 尿嘌呤以及尿苷自由基

3.6 鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶配對(duì)

4 總結(jié)與展望

通過(guò)不同方法產(chǎn)生和研究核苷自由基,為深入了解其形成機(jī)制、反應(yīng)性質(zhì)以及生物學(xué)功能具有重要意義。質(zhì)譜儀系統(tǒng)中的高真空為高反應(yīng)性瞬態(tài)分子和自由基等提供了惰性環(huán)境,有利于它們的生成和結(jié)構(gòu)研究。本文總結(jié)了近20年來(lái)基于質(zhì)譜技術(shù)的堿基自由基與核苷自由基的氣相研究,詳細(xì)介紹了產(chǎn)生方式、研究方法以及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展,具體信息列于表1。從產(chǎn)生方法來(lái)看,除早期使用的EI法外,目前已有多種方法被應(yīng)用,如基于堿基或核苷與CuⅡ和配體形成的三元過(guò)渡金屬配合物或通過(guò)引入自由基引發(fā)劑的CID方法,基于電荷標(biāo)記后的ETD方法,以及基于引入碳碘鍵后的UVPD法等。在結(jié)構(gòu)研究中,既可以通過(guò)基于串聯(lián)質(zhì)譜的離子活化法獲得解離碎片信息,又可以獲得重要自由基離子的紫外-可見(jiàn)或紅外光解離光譜,并與理論計(jì)算結(jié)果對(duì)比?；谝陨戏椒?許多不同堿基與核苷自由基離子的結(jié)構(gòu)得以明確,但其高活性自由基中間體的結(jié)構(gòu)表征,以及不同自由基位點(diǎn)的自由基異構(gòu)體的選擇性產(chǎn)生仍具有挑戰(zhàn)性。目前,相關(guān)自由基離子的研究主要集中于陽(yáng)離子,而對(duì)于陰離子的產(chǎn)生和研究仍然非常困難,可以進(jìn)一步利用反應(yīng)質(zhì)譜、光電子能譜以及CCS測(cè)量等方法實(shí)現(xiàn)對(duì)這些物種結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)分析。

表1 氣相中堿基與核苷自由基的產(chǎn)生以及結(jié)構(gòu)研究方法Table 1 Production and structural research methods of free radicals of bases and nucleosides in gas phase