吳祝華 宋 娟 朱樹林 趙 邢 楊學(xué)祥 任嘉紅 陳鳳毛

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南京 210037；2.湖州師范學(xué)院 湖州 313000；3.江蘇省句容市磨盤山林場(chǎng) 句容 212445；4.江蘇省句容市句容林場(chǎng) 句容 212424；5.長(zhǎng)治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系 長(zhǎng)治 046011）

植物促生微生物 ( plant growth promoting microbes,PGPM)可通過(guò)直接或間接作用促進(jìn)植物生長(zhǎng)并維系植物健康(Msimbiraet al., 2020)。PGPM 直接促生作用是指通過(guò)固氮、解磷和鐵螯合等機(jī)制增強(qiáng)土壤中養(yǎng)分元素的有效性，或提高細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素和乙烯等植物激素的含量；間接促生作用是指通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制減少或抑制病原物生長(zhǎng)改變土壤微生物群落，從而激活植物防御機(jī)制，提高植物抗逆性(Waniet al., 2019)。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是一類重要的PGPM，在全球范圍內(nèi)均有分布(Williset al., 2013)。AMF-宿主植物-土壤之間通過(guò)AMF 的菌絲網(wǎng)進(jìn)行交流，不僅可以在宿主植物群體間，甚至可以在宿主植物和其他植物之間形成龐大的聯(lián)接網(wǎng)絡(luò)，使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分在植物群體間得到充分利用(Chenet al., 2018)。AMF 還可通過(guò)外部菌絲體釋放的分泌物與其他土壤微生物進(jìn)行互作，促進(jìn)植物對(duì)礦物質(zhì)元素（氮、磷、鉀等）的吸收；提高宿主植物對(duì)部分病原菌（鏈霉菌、黃單胞菌、白粉菌等）的防御；增強(qiáng)宿主植物對(duì)干旱、鹽和溫度等非生物脅迫的抗性(Chenet al., 2018)。前期研究表明摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）能夠提高植物的耐脅迫性，增強(qiáng)植物幼苗中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)(Song,et al.,2010)

楓香（Liquidambar formosana）是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土彩葉樹種，樹干通直，枝葉繁茂，秋季葉色絢麗；其木材質(zhì)地堅(jiān)硬，結(jié)構(gòu)均勻，且抗壓、耐腐蝕，是制造家具、農(nóng)具、樂器、膠合板和包裝材料等的理想用材(江聶等, 2008)。楓香樹冠高大，落葉量大，可增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、優(yōu)化土壤結(jié)構(gòu)、改善林地生境，因此也具有重要的生態(tài)價(jià)值。加強(qiáng)對(duì)楓香的栽培管理，對(duì)發(fā)展闊葉樹人工造林、開發(fā)鄉(xiāng)土樹種具有重要意義。

有關(guān)楓香根際微生物，前人研究表明，天然林中楓香根際可形成叢枝菌根，根際土壤中的AMF 孢子多樣性豐富，球囊霉屬為優(yōu)勢(shì)菌群（宋娟等，2021）；從楓香根際土壤中分離和鑒定了有效解磷菌黏質(zhì)沙雷氏菌 （Serratia marcescenssubsp.marcescens)與爭(zhēng)論產(chǎn)堿菌（Variovorax paradoxus)，且均顯示出良好的溶磷特性（宋娟等，2020 ；Ting,et al., 2010）。關(guān)于楓香葉色變化的研究目前主要集中于楓香轉(zhuǎn)色期其葉色變化與環(huán)境之間的關(guān)系方面(王冬雪 等, 2019), 而接種PGPM 對(duì)楓香葉色呈現(xiàn)與根際微生物群落的影響研究，目前鮮見報(bào)道。

本研究利用在楓香根際接種PGPM 優(yōu)良菌株黏質(zhì)沙雷氏菌NJ2D 與摩西斗管囊霉BJ04，研究PGPM對(duì)土壤理化性質(zhì)和楓香葉色的影響；并利用高通量Illumina MiSeq 技術(shù)，研究不同微生物菌株處理下楓香林土壤的微生物PGPM 群落組成結(jié)構(gòu)和多樣性特征，以了解施加外源PGPM 對(duì)宿主植物根際土壤中微生物群落聚集的影響，從而改善土壤質(zhì)量并促進(jìn)彩葉樹種葉色呈現(xiàn)，為微生物菌肥的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省句容市句容林場(chǎng)(119°14'57.76"E， 32°5' 06.40"N)，該地為典型的亞熱帶季風(fēng)氣候。年均氣溫15.1 ℃，平均相對(duì)濕度78%，年均降水量1 018.6 mm，年均日照時(shí)間2 116 h，土壤類型為酸性棕壤。

1.2 供試材料和培養(yǎng)基

本研究所用解磷菌黏質(zhì)沙雷氏菌（菌株NJ2D）由筆者前期分離自南京中山陵天然楓香林根際土樣中，菌株保藏號(hào)為CCTCC M 2012261，保存于南京林業(yè)大學(xué)林草學(xué)院森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。摩西斗管囊霉（菌株BJ04）由中國(guó)北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供。楓香為句容林場(chǎng)長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的7 年生楓香苗。使用前需將-20 ℃的甘油保存菌在牛肉膏蛋白胨（NA）固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 次。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土樣采集

對(duì)楓香進(jìn)行單接菌（NJ2D、BJ04）與雙接菌（NJ2D+BJ04）處理。將NJ2D 菌株活化后接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30 ℃，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h 制成發(fā)酵液。將發(fā)酵液離心5 min（4 ℃，6 000 r·min-1），用無(wú)菌生理鹽水潤(rùn)洗菌體2～3 次后，再用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌懸液，制成菌劑菌體濃度約為7×10～8×108cfu·mL-1，備用。將準(zhǔn)備好的NJ2D、BJ04 菌劑分別采用灌根法和直接施加菌劑法施入，NJ2D 菌懸液與BJ04 菌劑分別按每株100 g 施用量施于楓香根部附近，然后覆土、澆水,統(tǒng)一管理。設(shè)4 個(gè)處理，分別為：?jiǎn)谓臃NNJ2D、單接種BJ04、雙接種NJ2D+BJ04（各施100g·株-1，共施200g·株-1）和空白對(duì)照（CK），每個(gè)處理20 個(gè)重復(fù)。處理2 個(gè)月后，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采集楓香根際（地表下15～25 cm 深） 的土壤0.5 kg，采集樣品分別裝入自封袋并做好標(biāo)記，篩除植物殘枝、石頭等雜質(zhì)后，置于低溫保存箱送至實(shí)驗(yàn)室。其中一部分土樣保存在-80 ℃超低溫箱，用于微生物測(cè)序分析（保存時(shí)間不超過(guò)3 天），另一部分土樣風(fēng)干后保存在4 ℃冰箱，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土樣風(fēng)干后過(guò)2 mm 孔徑的土壤篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。使用pH 計(jì)(Mettler Toledo，美國(guó)) 測(cè)定土壤pH (Xionget al., 2015)。采用抗壞血酸—鉬藍(lán)法測(cè)定有效磷含量(Olsen, 1954)。土樣在550 ℃下燃燒后，對(duì)有機(jī)質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定(Rosellet al., 2001)。使用凱氏定氮法測(cè)定全氮含量(Pageet al., 1982)。通過(guò)將新鮮土樣在105 ℃下烘干，用質(zhì)量分析法測(cè)定土壤含水率(Denget al., 2016)。采用氫氧化鈉熔融—鉬銻比色法測(cè)定土壤全磷含量(Renet al., 2016)。使用酸溶解原子吸收法(原子吸收光譜儀，Thermo Fisher Scientific，美國(guó))測(cè)量土壤全鉀含量。

1.5 葉色參數(shù)的測(cè)定

于2021 年11 月下旬楓香葉色充分顯色（樹葉葉色基本一致）之時(shí)，選擇天氣晴朗之日進(jìn)行葉色參數(shù)測(cè)定。每處理隨機(jī)選擇3 單株，每株樹采摘充分顯色葉3 片。葉色參數(shù)采用全自動(dòng)測(cè)色儀CM-2300D (廣東柯尼卡美能達(dá)公司)測(cè)定，每處理測(cè)定9 枚葉片，在每片葉正面中脈兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定，記錄表征葉片顏色的L*、a*、b* 值，其中，L* 表示光澤明亮度，L* 值越大，亮度越高；a* 值表示紅綠色差，a* 值越大，紅色越深，a* 值越小，綠色越深；b* 值表示黃藍(lán)色差，b* 值越大，黃色越深，b* 值越小，藍(lán)色越深。

1.6 葉綠素、類胡蘿卜素和花青素含量的測(cè)定

楓香葉片葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量的測(cè)定采用Porrade 等（1989）的方法，花青素含量測(cè)定采用Colanero 等（2018）的方法。

1.7 土壤DNA 提取、PCR 和Illumina 測(cè)序

選用 MoBio PowerMax Soil DNA isolation kit（MoBio Laboratories，Inc.，美國(guó)）試劑盒提取土壤微生物基因總DNA。將提取的總DNA 用于細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落的分析。真菌18S 核糖體RNA 基因通過(guò)巢式PCR 反應(yīng)擴(kuò)增。第1 輪擴(kuò)增引物為：F， 5′-GC ATATCAATAAGCGGAGGA-3′； R， 5′_-GTCGTTTAA AGCCATTACGTC-3′。第2 輪PCR 擴(kuò)增引物引物為：F，5′_-TTGAAAGGGAAACGATTGAAGT-3′ ；R，5′-_TAC GTCAACATCCTTAACGAA-3′。 細(xì)菌 16S rRNA 基因擴(kuò)增引物為338 F（5′- ACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′）和 806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）(Caporasoet al., 2012)。這些引物均包含特有的一組8個(gè)核苷酸的條形碼序列。PCR 擴(kuò)增體系為：12.5 uL 2×TaqPlus Master Mix，3 uL BSA（2 ng·μL-1），1uL 上下游引物和30 ng DNA 模版。PCR 重復(fù)3 次，16S V3、V4和18S（ITS1、ITS2）的PCR 擴(kuò)增程序條件如下：94 ℃5 min，30 個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，和72 ℃ 60 s；72 ℃ 7 min 4 ℃保存。而AMF PCR 擴(kuò)增分為2 個(gè)步驟，第1 輪PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 5 s，58 ℃ 6 s，72 ℃ 10 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。第2 輪PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 5 s， 58 ℃ 6 s，72 ℃ 10 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。獲得的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓊脂糖凝膠電泳后，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences）凝膠回收試劑盒純化，切膠回收PCR 產(chǎn)物。將每個(gè)樣品等比例混合后，利用Illumina公司Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（艾維可生物科技有限公司，中國(guó)）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用QIIME（ Version 1.8，http://qiime.org）(Caporasoet al., 2012)去除＜ 200 bp 片段和低質(zhì)量序列（average quality scores ＜ 20 reads）獲得高質(zhì)量的細(xì)菌、真菌序列。使用UPARSE 根據(jù)97%的相似度對(duì)所有樣本進(jìn)行聚類(Edgar, 2013)，并利用UCHIME 軟件鑒定并去除嵌合體序列。使用（Silva）數(shù)據(jù)庫(kù)（Release128 http://www.arb-silva.de）進(jìn)行細(xì)菌物種注釋(Quastet al., 2012)。另外，使用UNITE 數(shù)據(jù)庫(kù)（Release7.0 http://unite.ut.ee/index.php）對(duì)真菌進(jìn)行分類(K?ljalget al., 2013)。利用QIIME（V1.8， http://qiime.org/）計(jì)算出可用于分析物種復(fù)雜性的Alpha 多樣性指數(shù)，包括Chao、Shannon 和observed species 指數(shù)。使用one-way ANOVA、Excel 2007 和SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及真菌群落、細(xì)菌群落與土壤環(huán)境因子和葉色素含量間的Pearson 相關(guān)性分析。利用R 軟件（V 4.0.5）進(jìn)行韋恩圖和功能的熱圖作圖。利用linear discriminant analysis effect size（LefSe）分析方法設(shè)定顯著差異的線性判別式分析（line discriminant analysis, LDA）值為4.0，尋找不同處理間豐度差異顯著物種。其他基礎(chǔ)繪圖運(yùn)用Origin 2018 繪制。利用Canoco（Version 4.5）軟件對(duì)環(huán)境因子和微生物群落多樣性進(jìn)行主成分（PCA）分析。利用psych R 包對(duì)復(fù)雜微生物群落中的共生模式進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，在Cytoscape 軟件（V 3.6.1）中進(jìn)行可視化操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生微生物對(duì)楓香根際土壤理化性質(zhì)的影響

處理組與對(duì)照楓香根際土樣全氮、全磷和全鉀含量見表1。與對(duì)照（CK）相比，NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 處理的楓香苗根際土壤全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)、有效磷含量、含水率和pH 均顯著提高(P＜ 0.05)。與CK 和其他處理組相比，NJ2D+BJ04 處理?xiàng)飨愀H的土壤全氮、有機(jī)質(zhì)含量和土壤含水率均顯著提高 (P＜0.05)。BJ04 處理的楓香根際土壤全鉀和有效磷含量均顯著高于其他各處理組(P＜ 0.05)。此外，NJ2D 處理的楓香苗根際土壤pH 顯著高于其他各處理(P＜0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，接種菌劑 NJ2D、BJ04 可以有效提高土壤養(yǎng)分，以雙接種效果最好。

表1 促生微生物對(duì)楓香根際土壤理化性質(zhì)的影響（n=3）①Tab.1 Soil physicochemical properties in the rhizosphere of Liquidambar formosana grown in field soil as affected by the inoculated microorganism

2.2 促生微生物對(duì)楓香葉色表型參數(shù)的影響

不同接菌處理?xiàng)飨愕娜~色參數(shù)變化見圖1。不同處理之間，楓香葉片的光澤明亮度L* 值呈明顯變化（ “+”表示偏明亮，“-”表示偏暗），單接種 NJ2D處理?xiàng)飨忝绲腖*逐漸提高，并達(dá)到最大值。相反，單接種 BJ04 處理?xiàng)飨忝绲腖*值較CK 則顯著降低(P＜0.05)(圖1b)。與 CK 相比，楓香葉片的色相紅綠色差a*值（“+”表示偏紅，“-”表示偏綠）在接菌處理后呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)(圖1c)。單接種 BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 處理?xiàng)飨忝绲腷* 值（“+”表示偏黃，“-”表示偏藍(lán)），與CK 相比呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，表明CK 組和單接種NJ2D 處理組的b*值較高，楓香葉色變黃的程度加深(圖1d)。以上結(jié)果表明，菌劑NJ2D、BJ04 對(duì)楓香葉色表型參數(shù)產(chǎn)生了顯著影響。

圖1 接種促生菌對(duì)楓香葉色變化與葉片色素含量的影響Fig.1 Leaf color and pigments of L.formosana affected by the inoculated microorganism

接種NJ2D、BJ04 還對(duì)楓香葉片葉綠素含量產(chǎn)生不同程度的影響（圖1e）。與CK 相比， NJ2D 和NJ2D+BJ04 處理?xiàng)飨愕娜~綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素值顯著降低（P＜ 0.05）；單接種BJ04 則顯著提高了楓香葉片的葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素含量（P＜ 0.05）（圖1e）；此外，單接種BJ04 可顯著提高楓香葉片中的類胡蘿卜素含量（圖1f）；單接種NJ2D 和接種NJ2D+BJ04 處理的類胡蘿卜素含量分別下降了20.15% 和14.67%（圖1f）；雙接種NJ2D+BJ04 的楓香葉片中花青素含量較對(duì)照組顯著增加（P＜ 0.05），而單接種 NJ2D、BJ04 菌劑的楓香葉片中花青素含量較對(duì)照CK 顯著降低（P＜ 0.05）（圖1g）。

2.3 促生微生物對(duì)楓香根際微生物多樣性的影響

采用Illumina MiSeq 對(duì)CK 和處理組楓香根際土壤樣品測(cè)序共獲得2 界、36 門 、98 綱 、140 目 、296科、482 屬、1 380 種的土壤細(xì)菌，及1 綱、3 目、3 科、9 屬、68 種的土壤AMF。高通量測(cè)序結(jié)果（圖2a）顯示，NJ2D、BJ04、NJ2D+BJ04 和CK 之間共有OTUs 個(gè)數(shù)為2 731 個(gè)；CK、NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 特有OTUs 分別有385、261、242 和151 個(gè)。此外，由圖2c可以看出，對(duì)照組和處理組共有OTUs 為204 個(gè)；CK、BJ04、NJ2D、NJ2D+BJ04 各處理組特有OTUs 分別有8、6、1、6 個(gè)。處理后，特有OTUs 減少了，可能是接種微生物增進(jìn)了功能菌群，減少了無(wú)關(guān)菌種數(shù)群。

圖2 接種促生菌對(duì)楓香根際土壤細(xì)菌多樣性的影響Fig.2 The soil bacterial diversity in L.formosana rhizosphere affected by the inoculated microorganism

對(duì)照與處理組楓香根際微生物多樣性見表2。NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 處理?xiàng)飨愕腃hao1 多樣性指數(shù)值相似，而CK 組顯著低于處理組(P＜ 0.05)。此外，CK 組的Shannon 多樣性指數(shù)也最小。而對(duì)于AMF，根際Chao1 指數(shù)最高的是CK ，表明CK 組楓香根際的群落豐富度指數(shù)較處理組大。Shannon 指數(shù)最高的是BJ04 組，最低的是NJ2D 組，表明BJ04 組根際AMF 的群落多樣性最大，NJ2D 組際AMF 的群落多樣性最小。

表2 楓香根際土壤微生物多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of the soil microbes in the rhizosphere under L.formosana relative to variety

2.4 促生微生物對(duì)楓香根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

楓香根際土壤細(xì)菌在門水平的豐度分析如圖2所示，相對(duì)豐度排在前5 位的是放線菌門（Actinobacteria，29.77%～35.72%）、變形菌門（Proteobacteria，24.74%～35.30%）、綠彎菌門（Chloroflexi，6.38%～15.68%）、酸桿菌門（Acidobacteria，6.49%～10.77%）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，6.08%～9.45%）。其中，與CK 相比，NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 處理組中的變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度明顯升高。在NJ2D 處理組中芽單胞菌門和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度相對(duì)較高（圖2b），而藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）為BJ04 處理組中的主要門。此外，疣微菌門（Verrucomicrobia）和Saccharibacteria 菌門主要出現(xiàn)在NJ2D+BJ04 中。最后，與處理組相比，CK 組群落中的酸桿菌門、綠彎菌門和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對(duì)豐度最高（圖2b）。

進(jìn)一步分析和比較屬水平上的細(xì)菌、AMF 的相對(duì)豐度值（圖2d、2e、3a、3b）。楓香根際細(xì)菌屬（圖2d）主要包括熱酸菌屬（Acidothermus，2.45%～4.97%）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas，3.15%～3.79%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.72%～3.71%）、嗜熱光合細(xì)菌屬（Roseiflexus， 1.64%～2.57%）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.24%～1.57%）。單接種NJ2D 處理組中，鏈霉菌屬（Streptomyces，3.70%）和慢生根瘤菌屬（1.57%）為優(yōu)勢(shì)屬（圖2e）。而單接種BJ04 處理組中嗜熱光合細(xì)菌屬（2.57%）和羅河桿菌屬（Rhodanobacter，2.12%）為優(yōu)勢(shì)屬。雙接種NJ2D+BJ04 處理組中，Jatrophihabitans（1.53%）為優(yōu)勢(shì)屬，而Haliangium屬（0.76%）的相對(duì)豐度值低于其他各處理組（圖2e）。從AMF 屬水平上看（圖3a），楓香根際AMF 的優(yōu)勢(shì)屬為球囊霉屬（Glomus，18.37%～43.25%）、根生囊霉屬（Rhizophagus，2.37%～11.37%）、多氏囊霉屬（Dominikia，1.52%～6.67%）、 卡氏囊霉屬（Kamienskia，4.57%～0.02%）、巨孢囊霉屬（Gigaspora，1.51%～0.02%）、硬囊霉屬（Sclerocystis，0.59%～0.01%）和近明球囊霉屬（Claroideoglomus，0.460%～0.001%）。其中，球囊霉屬（43.25%）和卡氏囊霉屬（2.14%）在CK 組中的相對(duì)豐度較高，而多氏囊霉屬在雙接種NJ2D+BJ04 處理組中的相對(duì)豐度（6.67%）較高（圖 3b）。綜上可以看出，不同處理?xiàng)l件下楓香根際土壤樣品中的細(xì)菌、AMF組成較為相似，但其相對(duì)豐度值之間存有較大差異。

圖3 接種促生菌對(duì)楓香根際土壤AMF 多樣性的影響Fig.3 The soil AMF diversity in the rhizosphere of L.formosana affected by the inoculated microorganism

為進(jìn)一步分析不同處理下細(xì)菌菌群的差異。通過(guò)LefSe 分析對(duì)細(xì)菌物種相對(duì)豐度進(jìn)行比較。根據(jù)線性判別式分析（line discriminant analysis, LDA)計(jì)算結(jié)果來(lái)判斷差異顯著性的高低，LDA 的值越高，差異顯著性越高，對(duì)LDA ≥ 3 的細(xì)菌進(jìn)行分析（圖4a），找出組間具有顯著差異的物種（Biomarker）。單接種NJ2D處理?xiàng)飨忝绺H共有11 個(gè)特征細(xì)菌，分別是紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、g__Pseudolabrys、f_288_2、根瘤菌科（Rhizobiaceae）、溶桿菌屬（Lysobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、橙色桿孢囊菌（Virgisporangium）、g_Pedomicorbium、百脈根根瘤菌（s_Rhizobium_etli）。單接種BJ04 的楓香苗根際特征細(xì)菌為f_Acidimicrobiaceae。雙接種NJ2D+BJ04 的楓香苗根際特征細(xì)菌為g_Caenimonas（圖4a）。

圖4 不同接菌處理下楓香根際細(xì)菌（a）和真菌（b）的差異性分析Fig.4 Difference in bacterial (a) and fungal (b) populations in the rhizosphere of L.formosana under different inoculation conditions

利用LefSe 對(duì)不同處理下真菌菌群的差異進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)差異豐富的分類學(xué)分支（a= 0.01，LDA Score ≥ 3.0）（圖4b），可以找出組間具有顯著差異的物種（biomarker），以及顯著影響組間差異性的物種或群落。由圖4 中可知，單接種BJ04 楓香苗根際的差異物種主要為球囊霉屬種（s_Glomus_sp_rp65、s_Glomus_sp_rp10 與s_Glomus_ sp_DQF05），硬囊霉屬、彎絲硬囊霉屬（s_Sclerocystis_sinupsa）。而CK 組中只有1 個(gè)特征真菌為球囊霉屬的s_Glomus_sp_3_ZHNL_2013a。單接種NJ2D 和雙接種NJ2D+BJ04的楓香根際真菌群落組間無(wú)顯著差異物種（圖4b）。

2.5 土壤理化性質(zhì)、葉色素與微生物多樣性的相關(guān)性分析

人工接種微生物會(huì)影響微生物的組成和分布，通過(guò)主成分分析（principal component analysis，PCA）檢驗(yàn)土壤理化性質(zhì)、葉色素與細(xì)菌群落的相關(guān)性，結(jié)果（圖5a）中紅色射線表示土壤性質(zhì)和葉色素，箭頭的長(zhǎng)度代表的是其影響程度，射線間的夾角代表相關(guān)程度。圖中第1 坐標(biāo)軸解釋了細(xì)菌群落組成和土壤性質(zhì)、葉色素間總變異的37.45%，第2 坐標(biāo)軸解釋了細(xì)菌群落組成和土壤性質(zhì)、葉色素間總變異的48.96%。分別基于這2 種距離使用置換多元方差分析（PERMANOVA），進(jìn)行999 次置換后發(fā)現(xiàn)，研究區(qū)樣品兩兩之間均有著顯著差異（P＜ 0.05）。圖中單接種BJ04 處理組與雙接種NJ2D+BJ04 處理組細(xì)菌群落組成相似度較高，而單接NJ2D 處理組與BJ04 處理組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似（圖5a）。此外，CK 組與雙接種NJ2D+BJ04 處理組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在PCA 圖中的位置比較分散，距離較遠(yuǎn)。NJ2D、BJ04 的接種處理使得楓香根際的細(xì)菌群落組成發(fā)生了變化，說(shuō)明NJ2D、BJ04 會(huì)對(duì)楓香根際的細(xì)菌群落產(chǎn)生影響。另外，PCA 結(jié)果（圖5a）表明，土壤pH、TP 和AP 含量與單接種NJ2D 處理組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），土壤TK 含量與葉綠素和類胡蘿卜素含量呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），土壤TN與花青素含量呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）。

圖5 接種促生菌對(duì)楓香根際土壤微生物群落組成與環(huán)境因子、葉色素間的PCA 分析Fig.5 PCA of soil microbial community composition, environmental factors and leaf pigments in rhizosphere of L.formosana by inoculating microorganism

對(duì)楓香根際AMF 群落而言，主成分分析表明，PCA1、PCA2 分別解釋了樣本間33.15%和48.97%的變異來(lái)源，第一、二兩軸的累積貢獻(xiàn)率達(dá)82.12%。CK 組、單接種黏質(zhì)沙雷氏菌NJ2D、摩西斗管囊霉BJ04 菌劑的處理組之間的點(diǎn)距離較近，說(shuō)明3 個(gè)樣地的AMF 群落構(gòu)成相似；而CK 組和單接種摩西斗管囊霉BJ04 處理組與雙接種NJ2D+BJ04 處理組之間距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明雙接種NJ2D+BJ04 處理組與CK 組和單接種摩西斗管囊霉BJ04 處理組之間的AMF 群落結(jié)構(gòu)差異較大（圖5b）。利用置換多元方差分析（PERMANOVA），發(fā)現(xiàn)研究區(qū)樣品兩兩之間均有著顯著性差異（P＜ 0.05）,進(jìn)一步佐證了樣本組間群落結(jié)構(gòu)差異的顯著性。此外，本研究結(jié)果顯示，土壤TN、土壤水分含量、土壤有機(jī)質(zhì)以及楓香葉片中花青素的含量與雙接種NJ2D+BJ04 菌劑處理組的AMF 群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），土壤 TK、TP、AP、葉片中葉綠素和類胡蘿卜素值與單接種摩西斗管囊霉BJ04 處理組中的AMF 群落結(jié)構(gòu)呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05）（圖5b）。

為了進(jìn)一步明確不同接種處理土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)、葉色素間的的相關(guān)性，對(duì)土壤微生物群落與土壤理化因子和葉色素間進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析，結(jié)果表明土壤pH 與類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量和chao1（AMF）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜ 0.05）（P＜ 0.01）（表3）。有效磷與類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b 和總?cè)~綠素呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（P＜ 0.01）；土壤有機(jī)質(zhì)與土壤全氮呈極顯著正相關(guān)（P＜ 0.01）（表3）；而土壤含水率、土壤全鉀對(duì)楓香葉色素、微生物多樣性間無(wú)顯著性影響。說(shuō)明楓香葉色含量和微生物多樣性對(duì)土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)、土壤總鉀、土壤有效磷和土壤含水量有響應(yīng)，其中楓香葉色和微生物多樣性受土壤pH 和土壤有效磷的影響最大（表3）。

表3 不同接種處理下土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)、葉色素間的Pearson 相關(guān)性分析①Tab.3 Correlation analysis of soil microbial community, soil chemical and physical properties, and leaf pigments, as determined by Pearson correlation analysis

3 討 論

3.1 對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

氮和磷是最常見的限制植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的營(yíng)養(yǎng)元素(Güsewell, 2004)。鉀可以調(diào)節(jié)植物根系的吸水能力，是促進(jìn)植物生長(zhǎng)重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一(Wanget al., 2013)，能夠有效提高植物對(duì)水分脅迫的耐受性。本研究中，單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04菌劑后的楓香根際土壤當(dāng)中的TN、TP、有機(jī)質(zhì)、AP、水分含量和pH 均有所增加。其中，單接種BJ04 后楓香根際土壤的TK 含量增加最多。NJ2D 經(jīng)鑒定為沙雷氏菌屬（Serratiasp）。前人研究表明黏質(zhì)沙雷氏菌是一種高效的磷酸鹽溶解菌(Misraet al., 2012)，其促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制之一是增強(qiáng)其固氮、固磷的能力(Selvakumaret al., 2008 , Islamet al., 2010)。 此外，有研究認(rèn)為，AMF 通過(guò)其根外菌絲可以有效提高植物對(duì)水分和根際營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而幫助其生長(zhǎng)(Augéet al., 2014)。由于單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑能夠顯著提高楓香苗根際土壤養(yǎng)分，可對(duì)楓香的生長(zhǎng)起到促生長(zhǎng)作用。此外，筆者通過(guò)微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)， NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04會(huì)影響到楓香根際的微生物群落結(jié)構(gòu)，土壤微生物群落能夠驅(qū)動(dòng)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和土壤養(yǎng)分循環(huán)(Xuet al., 2019)。NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 處理組的楓香根際土壤細(xì)菌群落多樣性的Chao1 指數(shù)較CK 組高。由此推斷NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑可在一定程度上提高土壤肥力。

3.2 對(duì)葉色表型參數(shù)的影響

與其他處理相比，單接BJ04 處理組中的葉綠素和類胡蘿卜素含量相對(duì)較高，表明接種BJ04 可影響植物的活力，提高植物的抗逆性。Stahl 等(2005)發(fā)現(xiàn)葉綠素是影響植物顏色的主要因素，這可能是因?yàn)楹}卜素容易被葉綠素掩蓋。因此，單接種BJ04 處理組葉片在深秋時(shí)候仍呈現(xiàn)深綠色，可能是因?yàn)閱谓臃NBJ04 處理組楓香葉片的葉綠素含量最高所致。植物葉片顏色的變化與其葉片花青素的含量密切相關(guān)(Liet al., 2018)。花青素是植物重要的次生代謝物，可賦予植物呈現(xiàn)橙色、紅色、品紅、紫色和藍(lán)色(Huet al.,2015)。在本研究中，雙接種NJ2D+BJ04 處理組的花青素含量高于其他各組，而該組的葉綠素含量較低，且雙接種NJ2D+BJ04 處理組的楓香葉子顏色要比其他各組更紅。上述研究可能在一定程度上解釋了楓香深秋葉色變化差異的原因，為通過(guò)接種微生物 來(lái)培育更豐富的觀賞植物葉片顏色 提供了理論依據(jù)。另外，由于花青素具有幫助植物抵抗生物和非生物脅迫：如高光強(qiáng)、熱環(huán)境條件、水分脅迫和營(yíng)養(yǎng)缺乏、草食動(dòng)物的攻擊和植物滲透平衡的調(diào)節(jié)的能力(Qiet al.,2011)。因此，筆者進(jìn)一步推測(cè)雙接種NJ2D+BJ04 具有減輕植物生物和非生物脅迫的潛力。

3.3 對(duì)根際微生物多樣性的影響

在根際微生物群落方面，PCA 分析表明，接種外源菌株NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 對(duì)楓香人工林區(qū)楓香根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，并且處理組的細(xì)菌α 多樣性顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05），接種后細(xì)菌群落快速發(fā)生了改變。有研究指出，土壤細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)對(duì)干擾的反應(yīng)比其他微生物更為靈敏(Denget al., 2016)，并且干擾和擾動(dòng)可能會(huì)增加細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間的相似性(Petsch, 2016)，因此，單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑處理組中特有的OTU 較少。值得注意的是，黏質(zhì)沙雷氏菌NJ2D 處理組和CK 組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯不同，這可能是因?yàn)镹J2D 的加入使其在楓香根際形成了不受阻礙的競(jìng)爭(zhēng)類群，從而與CK 組之間形成了差異顯著的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑明顯影響到楓香根際AMF 群落的Chao1 指數(shù)。與對(duì)照相比，各處理均未顯著增加楓香根際土壤中的AMF Chao1 指數(shù)，這可能是因?yàn)榻臃N的外源菌株競(jìng)爭(zhēng)力不如土壤中原有的內(nèi)源AMF， NJ2D、BJ04 的接種處理僅僅可能只是調(diào)節(jié)植物選擇其特定AMF 的一個(gè)誘導(dǎo)劑，證明寄主植物在對(duì)其根際AMF 群落的選擇時(shí)起到了主導(dǎo)性作用(Guyonnetet al., 2017)，AMF 菌株在侵染過(guò)程中具有專一性和共生特性(Bonfanteet al., 2010)。雙接種NJ2D+BJ04 菌劑的處理組與CK 組相比其引起楓香根際AMF 群落結(jié)構(gòu)的差異性更顯著，表明其對(duì)AMF 群落結(jié)構(gòu)的影響程度更大。這可能是因?yàn)殡p接種NJ2D+BJ04 菌劑對(duì)土壤中全氮、有機(jī)質(zhì)含量和土壤含水率的影響較大。

與對(duì)照組相比，單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑處理組中的酸桿菌門、綠彎菌門和浮霉菌門的相對(duì)豐度值下降，而變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度值增加。有研究指出，變形菌門可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)(Mendeset al., 2013)，放線菌門常常出現(xiàn)在富營(yíng)養(yǎng)化土壤當(dāng)中(Yanget al., 2017)，變形菌門和放線菌門具有一些共同的特征：包括分解有機(jī)物和對(duì)植物根際病原菌的抑制功能(Yanget al., 2017)。綠彎菌門常常在極端、壓力的生境條件下出現(xiàn)，如干旱、貧瘠和高溫的土壤條件下(Yamadaet al., 2009)。在寡營(yíng)養(yǎng)的土壤條件下，酸桿菌門更容易富集(Leffet al., 2015)。此外，酸桿菌門與土壤pH 呈負(fù)相關(guān)(Cat?oet al., 2014)。經(jīng)單接種NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 菌劑處理后可有效增加楓香根際變形菌門和放線菌門的數(shù)量，表明菌劑NJ2D、BJ04 和NJ2D+BJ04 具有改善土壤營(yíng)養(yǎng)條件和抑制植物根際病原菌的潛力。擬桿菌門（Bacteroidetes）通常與土壤pH 呈正相關(guān)(Jeanbilleet al.,2016)，且擬桿菌門更適宜在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的生境條件生存。浮霉菌門在與植物競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是磷時(shí)候被認(rèn)為是生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌(Polletet al., 2014)。筆者發(fā)現(xiàn)， NJ2D 處理組的pH 以及NJ2D 處理組中的擬桿菌門的豐度均高于CK 組。但是在土壤pH 值相對(duì)較低的CK 組中，其浮霉菌門的數(shù)量相對(duì)較高。上述現(xiàn)象表明，擬桿菌門豐度的增加極有可能與土壤pH 值的增加有關(guān)。此外， NJ2D 處理組中擬桿菌門豐度的增加也可能是其促進(jìn)楓香生長(zhǎng)的原因之一。另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)， NJ2D 處理組中的鏈霉菌屬的相對(duì)豐度較高。有研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬是一類有效的生物防治劑菌種資源(Shekharet al., 2006)。表明接種NJ2D處理的楓香幼苗對(duì)病原菌的抵抗能力在一定程度上得到提高。

球囊霉屬和根生囊霉屬是土壤當(dāng)中最為豐富的屬。CK 組中根生囊霉屬的相對(duì)豐度值高于其他各處理組。有研究發(fā)現(xiàn)根生囊霉屬通過(guò)與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、空間以及通過(guò)提高植物對(duì)逆境環(huán)境（如重金屬污染和高鹽）的耐受性來(lái)促進(jìn)寄主植物的生長(zhǎng)(Siddiqui and Akhtar, 2008)。由此可見，單接種NJ2D、BJ04 或者雙接種NJ2D+BJ04 菌劑后均可在一定程度上提高土壤養(yǎng)分，促進(jìn)楓香生長(zhǎng)。此外，雙接種NJ2D+BJ04 菌劑處理組中的球囊霉屬相對(duì)豐度值與CK 組相似，且黏質(zhì)沙雷氏菌NJ2D 和摩西斗管囊霉BJ04 處理組中球囊霉屬的相對(duì)豐度值也與CK 組相似。球囊霉屬在所有樣本中均普遍存在，這與Biermann 和Linderman(Biermann and linderman, 1983)和 Daniell 等(Daniellet al., 2001)的研究結(jié)果一致，源于球囊霉屬具有很高的產(chǎn)孢率和快速定殖的能力。一些研究發(fā)現(xiàn)，引入本地微生物可以避免土著菌株與引入的外來(lái)菌株之間的拮抗關(guān)系(Pellegrinoet al., 2011)。NJ2D 篩選自楓香根際土樣， BJ04 篩自桃樹根際中，單獨(dú)接種NJ2D、BJ04 均能夠降低楓香根際球囊霉屬的豐度值，而單接種NJ2D 引起的球囊霉屬相對(duì)豐度值變化比單接種BJ04 菌劑處理組的大，表明NJ2D 對(duì)楓香根際球囊霉屬豐度值及整個(gè)AMF 群落結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的修飾能力。

4 結(jié) 論

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)單接NJ2D、BJ04 和雙接種NJ2D+BJ04 均可以有效改善楓香根際土壤養(yǎng)分和葉色素含量。在楓香根際接種NJ2D、NJ2D+BJ04 可形成獨(dú)特的細(xì)菌、AMF 群落結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明NJ2D 和NJ2D+BJ04 外源性菌劑的接種是影響楓香根際細(xì)菌、AMF 群落結(jié)構(gòu)的重要因素。另外，土壤TN、TK、有機(jī)質(zhì)、AP、水分和pH 對(duì)楓香根際細(xì)菌、AMF 群落結(jié)構(gòu)變化的會(huì)產(chǎn)生一定的影響。以上結(jié)果為開發(fā)適合楓香生長(zhǎng)的微生物菌肥提供了理論和實(shí)踐依據(jù)。