黃安瀛，陳銘秋，林 彥，盧萬鴻，王楚彪，燕 青，羅建中＊

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院速生樹木研究所，廣東 湛江 524300；2.西南林業(yè)大學(xué)，云南 昆明 650224；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實驗站，廣東 湛江 524013)

隨著木材需求的日益增加、生態(tài)文明建設(shè)推進(jìn)及國際木材保護(hù)性貿(mào)易政策實施力度的不斷加強(qiáng)，木材供應(yīng)與需求間矛盾日趨嚴(yán)峻，可持續(xù)經(jīng)營已成為我國林業(yè)發(fā)展的重要要求[1-2]。尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis），是尾葉桉（Eucalyptus urophyllaS.T.Blake） 與巨桉（Eucalyptus grandisW.Mill ex Maiden）的雜交種，融合了親本速生豐產(chǎn)、樹干通直等特點(diǎn)，還具有適應(yīng)性好、抗逆性強(qiáng)、病蟲害少等優(yōu)點(diǎn)，在我國南方已廣泛作為紙漿、造紙、纖維板等生產(chǎn)原材料[3]。良種尾巨桉的大面積種植，可以降低本土木材在市場供應(yīng)上的壓力，減少我國對進(jìn)口木材的依賴性，對我國森林資源的培育、木材供應(yīng)的安全均具有保障作用[4]。

我國桉樹新品種的開發(fā)主要采用“有性改良，無性利用”的模式，即在獲得優(yōu)異的有性改良個體后，通過組織培養(yǎng)來擴(kuò)繁、利用。組織培養(yǎng)（組培）具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但作為決定其成敗的分化、增殖及生根等過程均受多種因素影響，由各種因素導(dǎo)致的無法分化出根或生根質(zhì)量差等，直接影響后續(xù)移栽存活率[5-7]。植物生根過程中細(xì)胞需經(jīng)歷脫分化、再分化等階段，部分植物由于細(xì)胞內(nèi)信號傳遞限制，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)受阻，次生代謝物質(zhì)抑制等問題導(dǎo)致生根率低、生根質(zhì)量差、移栽難以成活等問題[8]。因此，提升組培苗生根率，提高不定根質(zhì)量在植株無性繁殖方面具有十分重要的意義。目前對尾巨桉生根已有較多研究，主要是通過改變外源生長調(diào)節(jié)劑來促進(jìn)其脫分化與再分化，常用到的生長調(diào)節(jié)劑有吲哚乙酸（IBA）、萘乙酸（NAA）及ABT1。研究表明：DH32-26、DH32-28、DH32-29 等尾巨桉的最適生根培養(yǎng)基中添加的生長素以IBA 與ABT1 為主，當(dāng)IBA 的濃度在0.2～0.3 mg·L-1，ABT1 濃度為0.3～1.5 mg·L-1時，誘導(dǎo)獲得的最佳生根率均在95% 以上[9-11]。以IBA 及NAA 為主的常規(guī)生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)生根研究中，當(dāng)IBA 與NAA 的濃度分別為1 mg·L-1與0.2 mg·L-1時生根率最高可達(dá)82.5%[12]，然而，盡管許多研究中試驗材料及生長調(diào)節(jié)劑種類相同，最佳配方的濃度及成分卻不盡相同。此外，ABT1生根粉作為復(fù)合配方，目前僅清楚NAA 含量20%，IBA 含量30%，其余成分未知，難以定量分析各成分對生根影響。

植物難以生根應(yīng)主要受自身基因與代謝物影響，不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)基也會對其造成不同程度的影響。以幾種表型較優(yōu)但生根能力不同的尾巨桉無性系為材料，通過研究不同生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度、無性系、培養(yǎng)基類型對4 個尾巨桉無性系組培苗生根的影響程度，判斷這幾個因素對其不同生根階段的影響大小，分析其中的主效因子，為難生根木本植物的根系發(fā)育調(diào)控研究提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗的尾巨桉無性系均由中國林科院速生樹木所遺傳育種團(tuán)隊自主研發(fā)，為對5 年生雜交子代測定林中長勢優(yōu)良的個體環(huán)割、組培而成。取來自同一雜交組合的4 個無性系（EC262、EC264、EC269和EC272）繼代增殖瓶苗，進(jìn)行不同培養(yǎng)基、生長調(diào)節(jié)劑處理，以研究其生根差異。

1.2 試驗方法

選取生長調(diào)節(jié)劑種類、濃度、培養(yǎng)基及無性系為4 個因素，設(shè)計4 因素4 水平正交試驗（表1）。預(yù)實驗中IBA 與NAA 濃度超過5 mg·L-1時4 個無性系均無法生根，故設(shè)濃度范圍1～4 mg·L-1。其中試驗組合中的A、B、C、D 分別代表培養(yǎng)基類型、IBA 濃度、NAA 濃度、無性系4 個因素，1、2、3、4 代表各因素不同處理水平。

表1 正交試驗設(shè)計的因素與水平Table 1 Factors and levels for orthogonal design

1.3 培養(yǎng)基配置

選取1/2 MS 培養(yǎng)基、大量元素培養(yǎng)基、WPM、N6 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，大量元素培養(yǎng)基配方參照王楚彪[13]提出的根誘導(dǎo)最適配方。培養(yǎng)基中添加15 g·L-1蔗糖、0.5 mg·L-1的半胱氨酸及7 g·L-1的卡拉膠，pH 值為5.8，121 ℃、20 min 高壓滅菌后取出加濾膜過濾后的植物生長調(diào)節(jié)劑。

1.4 接種與培養(yǎng)

選取繼代培養(yǎng)20～25 d，高度在4 ± 0.5 cm，生長健壯的叢生苗，剪取2 cm 以上帶頂芽部分進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗[14]。暗培養(yǎng)7 d 后轉(zhuǎn)光照培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，光照時長12 h，溫度28 ℃，濕度80%～90%。

1.5 測定方法

每周對植物的生長情況進(jìn)行一次檢測，以評估根系的生長狀態(tài)。培育30 d 后，參考張沛建[15]的分析方法，統(tǒng)計各個試驗組生根情況，以生根率、平均根長、最長根長與根數(shù)等作為評價標(biāo)準(zhǔn)。生根性狀評分參考王藝[16]等方法評估，基部只有一級根及二級根，根系生長局限明顯的（圖1A），評定為1 分；基部一級根數(shù)少于3，存在二級及以上根的（圖1B），評定為2 分；基部一級根數(shù)大于3，有二級根及以上根，根系發(fā)育較好的（圖1C），評定為3 分；基部根系發(fā)育較為完善，存在三級以上側(cè)根，扎入培養(yǎng)基基質(zhì)較為扎實的（圖1D），評定為4 分。公式計算獲得最終分?jǐn)?shù)，

圖1 生根性狀評分示例Fig.1 The example of rooting trait scoring

其中：N1、N2、N3、N4 均為相應(yīng)評分的苗數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2016 對獲得的不同試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，并利用SPSS 21.0 進(jìn)行方差分析,進(jìn)行多重對比研究（Duncan 法）[17]。

2 實驗結(jié)果

2.1 尾巨桉生根情況

2.1.1 生根過程 4 個尾巨桉無性系組培苗均屬于綜合生根類型，總生根數(shù)為158 株，其中皮質(zhì)生根數(shù)為114（72.2%），愈傷生根數(shù)為44（27.8%）。大量元素培養(yǎng)基中皮質(zhì)生根植株比例最高，達(dá)到86%，相對而言，皮質(zhì)生根的幼苗葉片及植株生長更健壯（圖1C），而愈傷生根的根系通常側(cè)根發(fā)育更加健全，根系的擴(kuò)展能力強(qiáng)，與培養(yǎng)基基質(zhì)結(jié)合更加緊密，但與莖段的連接性較差，葉片及植株生長受限（圖1D）。

尾巨桉無性系生根大致分為4 個階段：（1）0～7 d，莖末端出現(xiàn)小型愈傷團(tuán)（圖2A）；（2）7～10 d，愈傷組織陸續(xù)出現(xiàn)小根點(diǎn)（圖2B ）；（3）10～15 d，小根點(diǎn)不斷膨大且數(shù)量不斷增加（圖2C）；（4）15～30 d ，不定根長度快速抽長，出現(xiàn)二級及以上側(cè)根（圖2D）；（5）30 d以上，不定根數(shù)量趨于穩(wěn)定，根長持續(xù)伸長，側(cè)根持續(xù)生長 。

圖2 皮質(zhì)生根不定根形成過程Fig.2 The formation of adventitious roots of E.urophylla x grandis

愈傷生根過程的主要差異體現(xiàn)于7～15 d，愈傷組織不出現(xiàn)小根點(diǎn)，而是持續(xù)膨大約3～5 倍，形成愈傷球。在此階段，從愈傷球中抽出根的組培苗最終會形成愈傷生根，剩余停留在愈傷階段的植株則會緩慢至停止生長。

2.1.2 不同處理對尾巨桉組培苗生根效果的影響

4 個尾巨桉無性系的根系發(fā)育情況如下表（表2），不同處理組合對無性系的生根情況影響不同，方差分析結(jié)果表明：植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度、培養(yǎng)基類型及無性系均對植株生根的效果均具有極顯著影響。4 個無性系在不同處理下均可生根，生根率在7.5%～55%之間，其中，T2 及T6 的生根率顯著高于其它處理，其根數(shù)也同樣高于大部分處理，然而根長與生根性狀卻與這兩種生根情況的關(guān)聯(lián)性不大。各處理下4 個尾巨桉的平均根數(shù)介于1～3.27 之間，平均根長在1.95～5.02 cm 之間，最長根長在2.17～7.03 cm 之間, 生根性狀評分介于27.78%～75.75%之間。

表2 各因素對尾巨桉生根的影響Table 2 Effects of different treatments on rooting of E.urophylla×E.grandis

2.2 不同處理對尾巨桉生根效果的極差分析

2.2.1 尾巨桉組培苗生根率及平均根數(shù)極差分析

結(jié)合4 個尾巨桉無性系的生根率（表3）及平均根數(shù)極差分析（表4）表明，無性系間差異是這兩種生根效果的最主要差異來源。其中，通過生根率的極差分析結(jié)果可見，無性系對生根的影響遠(yuǎn)大于其余3 種因素，其極差達(dá)到24.5，而其余3 種因素均在7～8 之間；此外，這4 種因素在處理水平間均存在極顯著差異，其中，無性系的4 個處理中的K3（EC269）的生根率（3.5）在極顯著水平低于其余無性系（11.5～28.0）。

表3 尾巨桉生根率極差分析Table 3 Range analysis of the rooting rate of rooting for E.urophylla×E.grandis

表4 尾巨桉平均根數(shù)極差分析Table 4 Range analysis of the mean number of rooting for E.urophylla × E.grandis

平均根數(shù)中幾種因素的極差較為接近，極差的范圍在1.75～3.50 間。從結(jié)果而言無性系的影響最大（3.50），其次是培養(yǎng)基類型（2.17）及NAA濃度（2.00）。此外，培養(yǎng)基類型、NAA 濃度的不同處理水平間存在0.01 水平的極顯著差異，無性系間存在0.05 水平的顯著差異，IBA 各處理間則無顯著差異。

2.2.2 尾巨桉組培苗平均根長、最長根長及生根性狀評分率極差分析 對4 個尾巨桉無性系平均根長（表5）、最長根長（表6）及生根性狀評分率（表7）的極差分析結(jié)果表明，所有因素的影響都達(dá)到顯著或極顯著水平，但各因素的重要性與生根率、平均根數(shù)中不盡相同。平均根長的極差結(jié)果顯示，培養(yǎng)基類型對平均根長的影響最大，極差為7.15，且處理K2（大量元素）及K3（N6）在極顯著水平上均高于其余處理。而無性系、NAA 濃度、IBA 濃度的極差分別為4.55、3.07 和2.20，重要性依次遞減；同時，在平均根長中，除無性系間存在顯著差異外，其余均為極顯著差異。

表5 尾巨桉平均根長極差分析Table 5 Range analysis of the longest root length of rooting for E.urophylla × E.grandis

表7 尾巨桉生根性狀評分率極差分析Table 7 Range analysis of the root effective traits rate of rooting for E.urophylla × E.grandis

對于最長根長，各因素的影響大小排序與平均根長的相同（表6），也是培養(yǎng)基類型影響最大，極差為9.06 ， 且處理K2 （ 大量元素）及K3（N6）的平均值分別為18.48 和18.75，極顯著地高于其余處理。而無性系、NAA 濃度、IBA 濃度的極差分別為7.26、5.09 和3.17，重要性依次遞減。

生根性狀評分率（表7）也是判定植株根系發(fā)育的重要指標(biāo)。極差分析結(jié)果表明，培養(yǎng)基類型是在這個方面影響最大的因素，其極差為1.59，顯著大于無性系的0.43、NAA 濃度的0.30、IBA 濃度的0.22。4 個因素中，也僅培養(yǎng)基類型間的差異達(dá)到極顯著水平，其他因素內(nèi)的差異均不顯著。

3 討論

3.1 不同因素對尾巨桉生根效果的影響

影響桉樹生根的原因有很多，無性系、生長調(diào)節(jié)劑濃度及培養(yǎng)基等均會對生根造成影響。本研究綜合考慮了這幾種因素對4 個尾巨桉無性系組培苗生根效果的影響，結(jié)果表明，植株生根不同階段的主要影響因子不同，在生根初始階段，主要是遺傳因素（無性系間差異）決定其生根差異，而在根系發(fā)育的后續(xù)階段，環(huán)境因素（培養(yǎng)基類型）的影響超過了遺傳因素。有研究表明，生長素與細(xì)胞分裂素是植株脫分化的必備條件，在前期預(yù)實驗中，無生長素、細(xì)胞分裂素或極高濃度（5 mg·L-1）的生長素和細(xì)胞分裂素均導(dǎo)致植株難以生根，說明一定濃度的生長素及細(xì)胞分裂素確是植物生根不可或缺的因素[18]。在本研究中，生長素及細(xì)胞分裂素雖是生根必須但其對植株生根的影響小于無性系或培養(yǎng)基類型。研究還發(fā)現(xiàn)，4 個尾巨桉無性系生根生長調(diào)節(jié)劑濃度及培養(yǎng)基適應(yīng)范圍較大，1～4 mg·L-1生長調(diào)節(jié)劑濃度及4 種培養(yǎng)基培育下均有生根現(xiàn)象，生根植株均從類根愈傷組織開始生長，皮質(zhì)生根在10 d 左右從莖側(cè)端生長出不定根幼根，剩余則發(fā)展為愈傷團(tuán)，部分可形成愈傷生根，剩余則會逐漸褐化后死亡。

3.2 不定根形成過程影響因素

植物的基因控制著植物內(nèi)源激素、信號傳導(dǎo)，次生代謝產(chǎn)物的水平，而這些產(chǎn)物又反過來控制基因重編程，進(jìn)而控制如細(xì)胞分裂，擴(kuò)大和分化等細(xì)胞過程，以此來影響植物根系的生長[19]。有研究表明，生長素IAA（Indole acetic acid）與其受體蛋白TIR1/AFB （ Transport Inhibitor Response 1/Auxin Signaling F-Box）及ARF（Auxin Response Factor）互作，在調(diào)節(jié)植物根部分生區(qū)大小及早期胚胎根形成階段，發(fā)揮了極為重要的作用[19-22]。ARF 還參與控制生長素外排因子PIN（PINFORMED）的活性[23]，該蛋白通過極性運(yùn)輸改變細(xì)胞間生長素流動的方向[24-26]，參與介導(dǎo)生長素轉(zhuǎn)運(yùn)的其它3 種轉(zhuǎn)錄因子PLT（PLETHORA），SHR（Short-Root）及SCR（SCARECROW），同樣被證實在影響細(xì)胞分裂，控制細(xì)胞增殖及大小等方面發(fā)揮重要作用[27-30]。在本研究中，生根率及根數(shù)受到遺傳因素的影響最大，因此，無法生根的植株可能在基因調(diào)控的某個模塊存在問題影響植株的脫分化或再分化過程，從而阻礙后續(xù)胚胎根的形成。此外，NAA 在生根階段的影響大于除無性系外的其余因素，研究表明：細(xì)胞分裂素通過表達(dá)水平和信號通路的修飾導(dǎo)致PIN 家族中幾種生長素外排載體基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生特異性變化，從而影響生長素外排和生長素在根尖的分布以此來調(diào)節(jié)生長素極性轉(zhuǎn)運(yùn)控制根分生組織的活性和大小[27-28]。以此推測，生根受阻可能與生長素的轉(zhuǎn)運(yùn)或與生長素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的幾種轉(zhuǎn)錄因子PIN、PLT、SHR、SCR等有關(guān)，外源添加細(xì)胞分裂素在一定程度上彌補(bǔ)遺傳因素缺陷，但補(bǔ)救能力有限。

3.3 不定根發(fā)育過程影響因素

在后續(xù)根伸長及生根性狀方面培養(yǎng)基占據(jù)了更為重要的地位，大量元素培養(yǎng)基及N6 培養(yǎng)基更適合尾巨桉生長，對比4 種培養(yǎng)基配方后發(fā)現(xiàn)，大量元素培養(yǎng)基及N6 培養(yǎng)基內(nèi)的大量元素KH2PO4高于其它兩種培養(yǎng)基約3 倍，微量元素MnSO4·4H2O及ZnSO4·7H2O 含量低于其它兩種培養(yǎng)基約4 倍。

磷和鉀是植物生長過程中不可缺少的重要物質(zhì)[29]，有研究表明：磷缺乏對擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）初生根的生長具有抑制作用，而對水稻（Oryza sativaL.）及番茄（Solanum lycopersicumMill）的初生根生長卻有促進(jìn)作用。GRAS 家族成員DELLA 及SCARECROW-LIKE 3（SCL3）均被證實在下胚軸和根伸長過程中發(fā)揮重要作用[30-31]。DELLA 可通過抑制光敏色素互作因子（Phytochrome-Interacting Factors，PIF）家族豐度阻止PIF 靶基因的表達(dá)來抑制下胚軸伸長[32]，赤霉素通過參與的GA-GID1-DELLA 途徑參與控制根系細(xì)胞及組織伸長[31]，磷缺乏導(dǎo)致擬南芥中赤霉素(Gibberellin，GA) 水平下降，GADELLA 信號通路的核心DELLA 蛋白累積，進(jìn)一步導(dǎo)致編碼其代謝酶的基因轉(zhuǎn)錄物水平發(fā)生相關(guān)變化，抑制擬南芥初生根生長[33]。而在番茄中，赤霉素在其根系處于低磷環(huán)境中時起積極作用，推測GA - PRO（PRO 為番茄中DELLA 家族成員）系統(tǒng)可能在響應(yīng)番茄磷缺乏時發(fā)揮重要作用[33]。而磷元素缺乏會導(dǎo)致蘋果分生細(xì)胞外質(zhì)體中鐵離子積累，導(dǎo)致鐵毒性從而抑制初生根生長[34-35]。

此外，赤霉素信號調(diào)節(jié)在擬南芥?zhèn)雀稚M織的側(cè)根萌發(fā)率，密度及初生根生長等方面也同樣發(fā)揮重要作用，外源施用GA 可挽救側(cè)根（LR）短表型，K+缺乏同樣通過調(diào)控GA 信號和DELLAs相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控LR 生長[36-37]。本研究推測，大量培養(yǎng)基及N6 培養(yǎng)基中充足的鉀離子及磷酸鹽可能通過赤霉素所介導(dǎo)的GA-DELLA 途徑及鐵離子累積方面，影響尾巨桉根的生長。

研究表明：在硫缺乏的情況下，水稻根能夠識別并誘導(dǎo)根產(chǎn)生獨(dú)腳金內(nèi)脂，而在其它情況則不會[38]。獨(dú)腳金內(nèi)脂被證實通過降低PIN 蛋白在木質(zhì)部薄壁組織細(xì)胞質(zhì)膜上的積累從而阻礙生長素的運(yùn)輸，并以此影響初生根的伸長及細(xì)胞增殖[39-40]。獨(dú)腳金內(nèi)脂的缺失促進(jìn)了側(cè)根的形成，說明獨(dú)腳金內(nèi)脂對根毛伸長也有一定影響[41]。這或許為本研究中，硫酸根缺乏的培養(yǎng)基反而在根系的生長上更具優(yōu)勢提供一定理論參考。綜上所述，環(huán)境因素在4 個尾巨桉無性系的發(fā)育過程中發(fā)揮極為重要的作用，高濃度的磷酸根離子和鉀離子，低濃度的硫酸根離子環(huán)境更適合4 個尾巨桉無性系組培苗不定根的產(chǎn)生，這或許與赤霉素及獨(dú)腳金內(nèi)脂兩種生長調(diào)節(jié)劑的功能相關(guān)。

4 結(jié)論

尾巨桉的生根大致分為4 個階段：0～7 d，莖末端出現(xiàn)小型愈傷團(tuán)；7～10 d，愈傷組織陸續(xù)出現(xiàn)小根點(diǎn)；10～15 d，小根點(diǎn)不斷膨大且數(shù)量不斷增加；15～30 d ，不定根長度快速抽長，出現(xiàn)二級及以上側(cè)根；30 d 以上，不定根數(shù)量趨于穩(wěn)定，根長持續(xù)伸長，側(cè)根持續(xù)生長。不同激素及培養(yǎng)基組合對不同無性系的生根情況影響不同，方差分析結(jié)果表明：植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度、培養(yǎng)基類型及無性系均對植株生根的效果均具有極顯著影響。此外，極差分析結(jié)果表明：無性系是造成4 個尾巨桉的生根率及平均根數(shù)這兩種生根效果差異的最主要來源，而平均根長、最長根長及生根性狀等生根效果則受到培養(yǎng)基類型的影響更大。