邵正中 舒雄 管娟

絲蛋白（silk fibroin，SF）是從動(dòng)物絲中提取的天然蛋白質(zhì)，主要包括蠶絲蛋白和蛛絲蛋白。SF 材料的體內(nèi)生物相容性?xún)?yōu)于一般的合成生物高分子如聚酯［1-2］。同時(shí)，典型純SF 材料如SF 水凝膠比其他天然蛋白質(zhì)如膠原、明膠的力學(xué)性能更優(yōu)、降解更慢［1-2］。因此，SF材料是組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前，蛛絲蛋白作為組織工程材料的研究相對(duì)較少，聚焦于桑蠶絲來(lái)源的SF 材料研究頗多。大量研究表明，通過(guò)化學(xué)和物理交聯(lián)等方法可以在寬范圍內(nèi)調(diào)節(jié)SF生物材料的力學(xué)性能和生物學(xué)性能以適配不同的應(yīng)用需求［3-4］。在軟骨、骨修復(fù)領(lǐng)域，SF生物材料也體現(xiàn)出巨大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景［5-6］。

一、絲蛋白

目前，廣泛采用從桑蠶絲中提取SF 的方法［7］。將脫膠蠶絲溶解于高濃度的溴化鋰溶液中，經(jīng)透析獲得SF水溶液，進(jìn)而制備出海綿、支架、薄膜、模塑體和水凝膠等形式豐富的SF基材。近年來(lái)，前沿的3D打印技術(shù)又實(shí)現(xiàn)了SF基材的復(fù)雜微結(jié)構(gòu)和個(gè)性化定制［8］。桑蠶絲SF 包含輕鏈和重鏈兩種分子，分子量分別為28 kD 和391 kD，輕鏈的序列結(jié)構(gòu)缺少重復(fù)片段，以無(wú)規(guī)構(gòu)象為主，不形成結(jié)晶結(jié)構(gòu)，而重鏈氨基酸序列包含大量GAGAGS 重復(fù)片段（G 為甘氨酸，A 為丙氨酸，S 為絲氨酸），這是SF 形成特征β-折疊構(gòu)象和晶態(tài)結(jié)構(gòu)的主要片段［4］。蛛絲蛋白種類(lèi)繁多，不同的蛛絲蛋白氨基酸序列差別很大，其中重復(fù)片段相對(duì)少，代表性重復(fù)片段主要為連續(xù)丙氨酸殘基，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可參閱文獻(xiàn)［9］。在SF基材制備過(guò)程中，最核心的分子結(jié)構(gòu)變化是SF分子由無(wú)規(guī)則、螺旋構(gòu)象（亦稱(chēng)Silk Ⅰ構(gòu)象）向β-折疊構(gòu)象（亦稱(chēng)Silk Ⅱ構(gòu)象）轉(zhuǎn)變。剪切應(yīng)力、超聲和某些試劑如醇類(lèi)能加速β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。β-折疊構(gòu)象的尺寸、含量、取向和分布等是影響SF 基材力學(xué)性能的重要因素。此外，SF 分子量、固含量、水含量等也顯著影響其力學(xué)性能。SF水凝膠是近年來(lái)備受關(guān)注的SF基材，其彈性模量范圍為數(shù)千帕至數(shù)兆帕，獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)是不采用化學(xué)交聯(lián)、僅通過(guò)提高SF 濃度至8%以上就能實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度［4］。SF材料的體內(nèi)降解周期為幾周至幾年，其β-折疊特征是重要影響因素。約95%孔隙率的SF支架可以在大鼠皮下模型4 周內(nèi)完全吸收［10］，而高強(qiáng)度或高固含量的SF 水凝膠在體內(nèi)半年內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定吸收很慢。SF 材料中分子相對(duì)分子量較高，易形成β-折疊物理交聯(lián)結(jié)構(gòu)，相比明膠等生物大分子材料體現(xiàn)更優(yōu)異的力學(xué)性能，同時(shí)其體內(nèi)生物相容性?xún)?yōu)異、降解周期可調(diào)，因此宜用作結(jié)構(gòu)性植入物。在免疫反應(yīng)方面，桑蠶絲無(wú)免疫原性，被歐盟認(rèn)定為非動(dòng)物制品［1］，其縫線一直是外科手術(shù)必備縫線之一。SF 材料會(huì)在植入初期引起機(jī)體的輕微炎癥反應(yīng)，之后伴隨著材料降解，能夠?qū)崿F(xiàn)完整功能性修復(fù)［2］。

二、SF軟骨修復(fù)的生物材料

1. 關(guān)節(jié)軟骨組織的特點(diǎn)：關(guān)節(jié)軟骨是一種特殊的承重組織，在膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)或肩關(guān)節(jié)處提供無(wú)摩擦運(yùn)動(dòng)。關(guān)節(jié)軟骨是由透明軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨組成，是一個(gè)具有不同成分、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的復(fù)合體。透明軟骨主要由Ⅱ型膠原、糖胺聚糖和水組成。鈣化軟骨是介于透明軟骨和軟骨下骨之間的鈣化薄層組織，比鄰近的透明軟骨更致密，適合傳遞和分散負(fù)荷，同時(shí)可阻止血管從軟骨下骨層向軟骨層遷移，避免軟骨層纖維化。軟骨下骨具有不同于其他骨組織的獨(dú)特結(jié)構(gòu)、生物學(xué)和力學(xué)性質(zhì)。面向關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)設(shè)計(jì)植入物時(shí)，應(yīng)綜合考慮透明軟骨、鈣化軟骨和軟骨下骨的特性［11］。目前軟骨修復(fù)與再生的治療策略包括微骨折、自體軟骨細(xì)胞移植和異體或自體軟骨移植［12］。軟骨損傷修復(fù)失敗會(huì)誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA），進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)關(guān)節(jié)功能的退化［13］，這也是OA 臨床發(fā)病率高的一個(gè)重要原因。雖然上述治療策略在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但仍存在修復(fù)效果不理想和供體來(lái)源有限等問(wèn)題。SF 生物材料可以加工成水凝膠、多孔海綿或支架和微載體等，其宏觀和微觀結(jié)構(gòu)在骨及軟骨修復(fù)中起到了關(guān)鍵作用。因此，配合臨床策略構(gòu)建理想的SF 生物材料體系，有望實(shí)現(xiàn)軟骨快速高質(zhì)量修復(fù)并減少誘發(fā)OA。

2.SF 水凝膠軟骨修復(fù)生物材料：SF 水凝膠是通過(guò)SF 分子的物理或化學(xué)作用形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)負(fù)載大量水得到的軟材料，模擬了天然細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的微環(huán)境，具有優(yōu)異的細(xì)胞親和性。Cui 等［14］提出了一種快速細(xì)胞相容的光交聯(lián)工藝，采用辣根酶催化酪氨酸殘基共價(jià)交聯(lián)獲得了SF 水凝膠，與軟骨細(xì)胞親和性極佳，加速了軟骨修復(fù)。理想的軟骨生物材料應(yīng)與天然軟骨的基本力學(xué)性能相匹配，還應(yīng)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗疲勞特性。Huang等［15］用膽固醇或β-環(huán)糊精對(duì)SF 進(jìn)行改性，制備的SF 水凝膠具有高機(jī)械強(qiáng)度、高韌性和顯著抗疲勞性能。

3.SF 支架軟骨修復(fù)生物材料：SF 支架多孔/海綿也廣泛應(yīng)用于軟骨組織工程。相比SF 水凝膠，SF 支架的多孔結(jié)構(gòu)對(duì)于小分子的流通性更好，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)甚至是細(xì)胞的輸運(yùn)；同時(shí)，SF 多孔支架能夠結(jié)合定向、多層和梯度等微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)更多功能。Feng 等［16］構(gòu)建了3 種具有隨機(jī)孔、徑向孔和軸向排列孔結(jié)構(gòu)的SF/膠原復(fù)合支架，取向排列孔結(jié)構(gòu)的骨軟骨再生效果更好。Yang 等［17］采用溫度梯度導(dǎo)引熱誘導(dǎo)相分離技術(shù)將SF 與去細(xì)胞軟骨ECM 相結(jié)合，制備了具有軸向孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架，促進(jìn)了軟骨的再生。通過(guò)功能性涂層修飾SF 支架的穩(wěn)定表面，可以進(jìn)一步提高骨軟骨的修復(fù)效果［18］。微載體也可以認(rèn)為是凝膠或者支架的一種形式，通過(guò)負(fù)載藥物或因子并控制釋放，促進(jìn)細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)和增殖并促進(jìn)組織修復(fù)。SF 微載體負(fù)載TGF-β等軟骨特異性生長(zhǎng)因子，促進(jìn)成軟骨細(xì)胞的歸巢、粘附和生長(zhǎng)，能夠解決損傷部位細(xì)胞不足的問(wèn)題。Galuzzi 等［19］比較了三種不同組分微載體對(duì)于軟骨細(xì)胞的活性，證明SF/海藻酸鹽微載體中的軟骨細(xì)胞活力最高，分泌的ECM最多。

4.SF 軟骨修復(fù)生物材料的降解性能：植入物材料的降解特性直接影響軟骨修復(fù)的速度和質(zhì)量。在植入早期，生物材料要穩(wěn)定，為細(xì)胞和組織提供充足力學(xué)支持。在植入后期，生物材料需要逐漸降解以適配新生組織長(zhǎng)入［10］。體外試驗(yàn)證明多種蛋白酶都?jí)蚪到釹F 材料，并且SF 材料的降解速率主要由其β-折疊晶區(qū)含量決定［20］。另有研究證明冷凍凝膠法制備的物理化學(xué)雙交聯(lián)SF 支架的β-折疊晶區(qū)尺寸可以被調(diào)控，從而獲得不同的體內(nèi)降解速率［21-22］。此外，引入蛋白酶抑制劑等也可以調(diào)節(jié)SF 材料的降解速率，正如Pritchard 等［23］通過(guò)制備了一種摻入蛋白酶抑制劑的SF 支架，通過(guò)減緩降解實(shí)現(xiàn)了藥物的長(zhǎng)時(shí)間緩釋。

三、SF基骨修復(fù)生物材料

1. 骨組織的特點(diǎn)：骨組織與軟骨等結(jié)締組織不同，其70%的質(zhì)量來(lái)自羥基磷灰石礦物相，膠原蛋白有機(jī)質(zhì)只占30%。骨組織是人體中除牙齒外最堅(jiān)硬的組織，其壓縮模量最高可達(dá)20 GPa。人體骨骼的主要功能包括：（1）支撐身體并與肌肉、韌帶等組織連成整體；（2）為運(yùn)動(dòng)提供支撐；（3）保護(hù)重要臟器和組織；（4）為骨髓提供保護(hù)，維持造血功能；（5）維持人體礦物質(zhì)代謝平衡［24］。骨重建是指舊骨的吸收和新骨的沉積，這一過(guò)程貫穿生物體的整個(gè)生命進(jìn)程，由成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞主導(dǎo)，而意外、疾病或老化引起的骨損傷，其修復(fù)和再生機(jī)制與一般的骨重建不同，免疫機(jī)制會(huì)主導(dǎo)骨損傷修復(fù)過(guò)程［25］。當(dāng)前臨床骨損傷的主要治療手段包括自體骨移植、異體骨移植和人工骨植入。而自體骨的骨源/骨量受限、異體骨可能存在免疫排斥反應(yīng)。因此，利用組織工程技術(shù)和人工骨植入材料修復(fù)骨缺損，是骨科臨床未來(lái)的重要方向［26］。與此同時(shí)，尋求安全有效的理想骨植入材料仍面臨挑戰(zhàn)。

2. 仿生礦化/復(fù)合SF 基骨支架：前述不同形態(tài)、微觀形貌的SF軟骨生物材料也可以結(jié)合骨組織特異性細(xì)胞或者干細(xì)胞或者相關(guān)藥物/生物因子，應(yīng)用于骨組織工程。早期發(fā)現(xiàn)純SF 支架植入物可以應(yīng)用于骨缺損修復(fù)，并體現(xiàn)優(yōu)異的再生效果［27］。盡管通過(guò)調(diào)整純SF 支架的微觀形貌特征、固含量能夠提升其力學(xué)性能，進(jìn)而增加與骨細(xì)胞和組織相容性，但是，純SF 支架材料的力學(xué)和生物學(xué)性能與骨組織相差較遠(yuǎn)。有研究采用共混、礦化等方式，在組成上采用有機(jī)/無(wú)機(jī)復(fù)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然骨的成分仿生［28］。通過(guò)共混引入羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）、生物玻璃等生物礦物相證明了SF 復(fù)合體系的模量和強(qiáng)度比純SF 支架更加適配天然骨組織，并促進(jìn)骨傳導(dǎo)［29-30］。羥基磷灰石納米顆粒與SF 溶液預(yù)先混合會(huì)得到被SF 包覆的雜化顆粒，改善了與SF 復(fù)合的界面性能，HAp-SF 復(fù)合材料的壓縮模量達(dá)3.2 GPa，成型性能優(yōu)異，復(fù)合材料骨釘在兔骨骨定模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的骨傳導(dǎo)效應(yīng)和新骨生成［31］。最近的研究表明絲蛋白和無(wú)機(jī)納米顆?；祀s水凝膠具有可注射性，提供了便于原位修復(fù)骨組織的材料［32］。通過(guò)礦化方法在SF多孔結(jié)構(gòu)中引入羥基磷灰石促進(jìn)了體外或體內(nèi)成骨蛋白和基因的表達(dá)［33］，在結(jié)合了骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）后，更適合間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)新骨生成［34］。靜電紡絲制備的SF微纖無(wú)紡布在引入了鋰藻土納米片后，能夠有效促進(jìn)干細(xì)胞的吸附和增殖，可應(yīng)用于骨引導(dǎo)再生術(shù)［35］。Guo 等［36］制備梯度硅化SF 與R5 多肽的復(fù)合材料，對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs）在骨誘導(dǎo)環(huán)境中的成骨分化具有調(diào)控作用。相較多孔SF 支架，通過(guò)逐步澆筑干燥的方法制備的SF 樹(shù)脂十分致密，這種塊體SF 基材的力學(xué)性能達(dá)到了皮質(zhì)骨的水平，且其機(jī)械加工性能優(yōu)異［37］。目前，SF 樹(shù)脂被加工成可降解螺釘，用于骨固定，已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。該螺釘植入初期穩(wěn)定降解極慢，1 年后逐漸降解，3年后降解率超過(guò)80%。

3.3D制備SF基骨支架：3D制備技術(shù)應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足進(jìn)展［38］，SF基生物墨水也廣泛用于皮膚、軟骨和骨組織工程3D 打印中［39］。盡管SF 體系的優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)物理交聯(lián)實(shí)現(xiàn)高強(qiáng)度，但SF 物理交聯(lián)的動(dòng)力學(xué)調(diào)控仍然困難，因此3D 打印SF 墨水的挑戰(zhàn)之一在于固化成型技術(shù)。純SF 溶液擠出式打印的常見(jiàn)方式是冷凍成型和凝固浴后處理［40］，甲基丙烯酸縮水甘油酯化學(xué)改性使SF 墨水具有光交聯(lián)特性［41］，與透明質(zhì)酸、明膠共混顯著改善了SF墨水打印性能［42-43］。用于骨組織修復(fù)的SF 基生物墨水也常復(fù)合生物礦物，除了力學(xué)和生物學(xué)性能的改進(jìn)，礦物相的引入還賦予SF基生物墨水理想的觸變性能，在高剪切速率下易流動(dòng)、無(wú)剪切時(shí)易凝固定型［44］。生物墨水負(fù)載細(xì)胞的3D 打印技術(shù)是研究前沿，3D 打印負(fù)載細(xì)胞的SF 基墨水，細(xì)胞存活率達(dá)到80%以上，已初步應(yīng)用于骨組織再生［45-46］。總體來(lái)看，3D 制備SF基骨支架代表了目前研發(fā)的重要趨勢(shì)，而優(yōu)化組成、結(jié)構(gòu)和工藝獲得綜合性能優(yōu)異的SF 基3D 結(jié)構(gòu)性材料，同時(shí)動(dòng)物模型試驗(yàn)仍亟待開(kāi)展。

4. SF 基骨支架的降解性能：SF 生物材料的體外降解研究表明，相同固含量的SF 支架的降解速率慢于SF 水凝膠、快于SF致密膜［1］。基于動(dòng)物模型的SF基骨支架的體內(nèi)生物學(xué)數(shù)據(jù)稀少，水溶液體系獲得的SF 支架其降解周期為2～6 個(gè)月［47］，而新骨生成通常為術(shù)后3～6 個(gè)月。因此，SF 基骨支架的降解速率需要進(jìn)一步降低以匹配骨的再生和重塑。

四、展望

骨與軟骨修復(fù)一直是骨科臨床的重要挑戰(zhàn)，組織工程技術(shù)為這一挑戰(zhàn)提供了新的機(jī)遇，而生物材料是不可或缺的要素。SF 材料具有優(yōu)異的力學(xué)性能、加工性能和良好的生物相容性，是一種應(yīng)用前景廣闊的生物材料。用于軟骨及骨組織修復(fù)的SF 材料的前沿研究，體現(xiàn)了SF 材料的多種形態(tài)以及搭載基因、藥物、生長(zhǎng)因子、納米顆粒和細(xì)胞的能力。隨著SF 生物材料實(shí)現(xiàn)分子結(jié)構(gòu)精準(zhǔn)調(diào)控和復(fù)雜3D 結(jié)構(gòu)定制，更多SF材料在骨軟骨組織工程領(lǐng)域的體內(nèi)應(yīng)用數(shù)據(jù)會(huì)逐步呈現(xiàn)，SF材料及植入物大規(guī)模應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)臨床指日可待。