劉鎮(zhèn)滔，康方圓，吳奎顯，倪晗，楊彥賓，王月影，楊國宇，韓立強

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院河南省動物生長發(fā)育重點實驗室，鄭州 450002）

0 引 言

牛奶中的脂肪以水包油乳液的形式存在，稱為乳脂肪球（MFG）[1-2]，其直徑在0.2～15 μm 不等，平均粒徑在2.5～5.7 μm[3]。乳磷脂主要聚集在乳脂肪球膜（MFGM）上，如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺（PE）等[4]。相關(guān)研究表明膜磷脂具有提高免疫力、調(diào)節(jié)代謝、促進(jìn)大腦發(fā)育、預(yù)防癌癥等生理作用[5-6]。

不同大小的MFG，其磷脂含量和結(jié)合蛋白水平各不相同，從而影響牛乳的營養(yǎng)價值和生產(chǎn)加工性能[7]。AVRAMIS C A 等[8-9]發(fā)現(xiàn)，小粒徑乳脂肪球在制作奶酪時更利于加工和保存。共軛亞油酸（CLA）是在反芻動物產(chǎn)品和肉類中發(fā)現(xiàn)的，人類主要通過乳制品來獲取CLA[10]。其具有抗癌、抗肥胖、減少脂肪沉積、改變脂肪酸組成、增加肌肉含量、改善肉質(zhì)等生理作用[11-13]。在生產(chǎn)中，CLA 被認(rèn)為是造成奶牛低乳脂癥（MFD）的機(jī)制之一，主要由于反式脂肪酸直接抑制乳脂肪的合成引起[14]。通過前期研究發(fā)現(xiàn)CLA可以顯著降低牛乳脂肪含量，并且會影響到脂肪球的平均粒徑[15]，但是對不同粒徑大小脂肪球的影響還不清楚。因此本研究通過對荷斯坦奶牛飼喂CLA，采集其牛乳，通過重力分層分成大粒徑和小粒徑脂肪球，分析CLA 對不同大小粒徑脂肪球的影響及PC含量的變化，為進(jìn)一步探索CLA 對乳脂肪的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

共軛亞油酸微囊粉（成分如表1 所示），澳海生物；甲醇、乙腈，J T Baker；異丙醇，MACRON；甲酸，科密歐；甲基叔丁基醚，Merck；脂質(zhì)組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），Sigma。

表1 共軛亞油酸的脂肪酸組成

1.1.2 主要儀器

乳成分分析儀（Foss 120 Milko-Scan），F(xiàn)oss；激光粒度儀（Mastersizer 3 000），Malvern；真空離心濃縮儀，Genevac；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890-5977），安捷倫；超高效液相色譜儀（LC-30A 和CCBM30A），島津。

1.2 實驗設(shè)計

1.2 1 實驗動物和飼養(yǎng)管理

研究在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)奶牛場進(jìn)行。實驗所用荷斯坦奶牛，生產(chǎn)性能良好、身體健康且均處于泌乳中期，產(chǎn)后（169±26）d。試驗期間采用全混日糧（Toal Mixed Ration，TMR）飼喂。在每天早上6:00 和下午16:00 擠奶2 次。本實驗分為2 組，每組各8 頭，正常組僅飼喂基礎(chǔ)日糧；試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加400 g/d CLA。試驗持續(xù)8 d，并記錄每天試驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 牛乳樣品采集

在實驗第8 天采集牛乳200 mL，分裝后一部分采用乳成分分析儀分析常規(guī)乳成分，一部分進(jìn)行重力分層后測量乳脂肪球粒徑，然后保存在-80 ℃冰箱進(jìn)行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用測定磷脂酰膽堿的種類含量。

1.2.3 乳脂肪球的重力分層

根據(jù)MESILATI S R 等[14]的方法改進(jìn)后，采集乳樣不超過6 h 且冷藏處理。將70 mL 新鮮乳樣加入到100 mL 注射器中，用封口膜密封下部，4 ℃下靜置24 h，取下封口膜，使乳樣從針孔流出，約每10 mL 時分別進(jìn)行收集，從下至上分別命名為F1、F2、F3、F4、F5、F6，最上層為F7（奶油層）。最后測量各組中的MFG 粒徑大小。

1.2.4 磷脂酰膽堿含量分析

1.2.4.1 磷脂樣品的提取

取F1 和F6 層牛乳樣本100 μL 加入到2 mL 離心管中，加入800 μL 脂質(zhì)提取液（V甲基叔丁基醚∶V甲醇=3∶1），混勻后超聲30 min, 加入240 μL 超純水，渦旋1 min 后，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min 離心15 min，吸取上清液至離心管中，真空離心濃縮儀濃縮至干，再用100 μL 乙腈/異丙醇（V乙腈∶V異丙醇=10∶90）復(fù)溶，最后上機(jī)LC-MS/MS 分析。

1.2.4.2 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱：Thermo AccucoreTMC30 柱(2.6 μm,2.1 mm×100 mm i.d.)，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量6 μL。流動相：A 相，乙腈/水（V乙腈∶V水=60∶40）；B相，乙腈/異丙醇（V乙腈∶V異丙醇=10∶90）；梯度洗脫程序：0 min 為VA∶VB=4∶1，2 min 為VA∶VB=7∶3，4 min 為VA∶VB=2∶3，9 min 為VA∶VB=3∶17，14 minVA∶VB=1∶9，15.5 min 為VA∶VB=1∶19，17.5 min 為VA∶VB=4∶1。

1.2.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI）溫度550 ℃，正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，負(fù)離子模式下質(zhì)譜電壓-4 500 V。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics26 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用T-Test 分析比較數(shù)據(jù)差異，以P>0.05 表示無統(tǒng)計學(xué)差異，*P<0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異，**P<0.01 表示有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 生產(chǎn)性能及乳成分分析

如表2 所示，對第8 天試驗組和正常組的乳樣進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂CLA 對奶牛的產(chǎn)奶量無顯著影響（P>0.05）；乳成分中乳脂肪、乳蛋白含量顯著下降（P<0.05），而乳糖含量無明顯變化（P>0.05）。

表2 生產(chǎn)性能及乳成分分析

2.2 重力分層分析

2.2.1 乳脂肪球分層外觀

如圖1 所示，對試驗組和正常組的第8 天乳樣進(jìn)行重力分層，觀察到飼喂CLA 后F7 層（奶油層）明顯變薄。對牛乳每10 mL 進(jìn)行分層后使用激光粒度分析儀進(jìn)一步測量脂肪球粒徑。

圖1 正常組與CLA 處理組重力分層

2.2.2 重力分層乳脂肪球粒徑參數(shù)分析

對重力分層乳樣分析脂肪球粒徑，結(jié)果如圖2 所示，橫軸表示重力分層層數(shù)，縱軸表示粒徑大小。對照組和試驗組的牛乳粒徑隨著層數(shù)的增加，呈現(xiàn)從F1 層到F7 層逐漸增加的變化趨勢。與對照組相比，CLA 處理組中D[3,2]、D[4,3]、DV(10)、DV(50)、DV(90)等粒徑參數(shù)在F1～F6 各層均顯著降低（P<0.05 或者P<0.01）。比表面積（SSA）經(jīng)CLA 處理后F1～F6 層均顯著增加（圖2f），其中對照組F1 層SSA 為3 099 m2/kg，而CLA 處理組F1 層SSA 最大達(dá)到4 157 m2/kg，F(xiàn)7 層SSA 最小，對照組為1 781 m2/kg，而CLA 組為1 891 m2/kg。

圖2 CLA 對重力分層乳脂肪球粒徑的影響

2.3 CLA 對不同粒徑牛乳中磷脂酰膽堿含量的影響

上述結(jié)果表明，經(jīng)過重力分層后乳脂肪球粒徑參數(shù)在各層間均有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，取F1 層小粒徑脂肪球和F6 層大粒徑脂肪球乳樣進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果如圖3 所示。與CON 組相比，在F1 層中經(jīng)CLA 處理后PC（28∶0)、PC（30∶0）、PC（31∶0）、PC（32∶0）、PC（30∶1）的含量顯著下降（P<0.05）。在F6 層中變化趨勢一樣，CLA 組中的21 種PC 化合物如PC（32∶2)、PC（34∶2)、PC（36∶2）、PC（34∶3）、PC（36∶3）、PC（36∶4）、PC（O-40∶1）等含量都顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。

圖3 CLA 對不同粒徑牛乳中磷脂酰膽堿含量的影響

3 討 論

發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)日糧中添加CLA 對牛乳乳糖含量、產(chǎn)奶量不造成影響，但顯著降低了乳脂肪含量。研究表明，Trans-10,cis-12 CLA 被認(rèn)定為瘤胃脂肪酸的氫化中間體，對多種哺乳動物的乳脂肪生成起抑制作用[16]，張?zhí)旆f等[17]在薩能奶山羊中添加CLA 顯著降低了羊乳中乳脂含量。VOGEL L 等[18]在奶牛哺乳早期和后期分別飼喂CLA，認(rèn)為CLA 減少乳脂肪含量與其脂肪酸（FA）從頭合成相關(guān)。XING Z Y 等[19]在奶牛日糧中添加CLA，與本實驗結(jié)果一致，均顯著降低了乳脂肪含量。表明日糧中添加CLA 可以抑制乳脂肪的合成。在試驗中還發(fā)現(xiàn)CLA 也影響了乳蛋白的含量，這一點在以前的論文中也有報道，如LOOC J J[20]發(fā)現(xiàn)CLA 可降低乳蛋白和非脂乳固體的含量，其機(jī)制目前還不清楚，這可能與乳腺分泌時乳脂肪和乳蛋白的合成比例有關(guān)。

乳脂肪球作為乳脂的存在形式，其粒徑大小與乳脂含量密切相關(guān)[21]，給奶牛分別飼喂低精料與高精料日糧，發(fā)現(xiàn)低精料日糧處理組的粒徑更大[22]。WIKING L等[23]研究了52 頭荷斯坦奶牛乳脂球分布與乳脂組成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MFG 的平均粒徑與奶牛的乳脂肪產(chǎn)量之間存在相關(guān)性，乳脂肪含量越少，MFG 平均粒徑就越小。為了進(jìn)一步探究CLA 與乳脂肪球粒徑之間的關(guān)系，本實驗對CON 組和CLA 組的乳樣進(jìn)行重力分層后，分別測定各層之間的乳脂肪球粒徑，發(fā)現(xiàn)在CLA 處理組中F1 至F6 層中各粒徑參數(shù)均顯著降低，這表明CLA 引起乳脂肪降低的同時，也引起了所有分層脂肪球粒徑的減小，表明日糧中添加CLA 可降低MFG 粒徑。研究表明，大粒徑乳脂肪球與小粒徑乳脂肪球相比，粒徑更大，SSA 更小[24]。與本實驗所測CON 組結(jié)果一致，CLA 組SSA 明顯變大，符合了小脂肪球SSA 更高的特征。研究發(fā)現(xiàn)，MFG 粒徑大小會影響牛乳乳品生產(chǎn)和加工[25]。AVRAMIS C A[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)制造埃曼塔奶酪時，小MFG 比大MFG 更能抵抗破裂，并在加工時更好地保持其天然MFGM 微觀結(jié)構(gòu)，增加其產(chǎn)量和風(fēng)味。MFG 的大小與脂質(zhì)組成密切相關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)CLA 處理后，牛乳中大粒徑（F6 層）和小粒徑（F1 層）脂肪球，其粒徑降低的同時PC 含量均減少，說明牛乳中PC 含量與乳脂肪球粒徑的大小存在一定的聯(lián)系，也表明CLA 引起的牛乳脂肪下降的主要特征是乳脂肪球粒徑減小及PC 含量降低。在細(xì)胞內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰膽堿（PC）作為膜的主要成分，能夠影響細(xì)胞脂滴[27]，敲除細(xì)胞合成PC 的關(guān)鍵酶CCTα 也能影響細(xì)胞脂滴的合成，因此CLA 對粒徑的作用，可能與奶牛乳腺細(xì)胞內(nèi)PC 調(diào)控脂滴的合成有關(guān)。

4 結(jié) 論

研究通過給奶?；A(chǔ)日糧中添加CLA，可顯著降低乳脂肪含量及乳脂肪球粒徑，并且減少了乳脂肪球膜上磷脂酰膽堿的含量。在未來的研究中應(yīng)該深入了解MFGM 的組成如何隨MFG 粒徑和乳脂含量的變化而變化，這將對精準(zhǔn)生產(chǎn)不同粒徑尺寸的MFG 具有重要意義。