苑懿，黃羽文，邢巾，張宇

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

0 引 言

鼠傷寒沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，常以肉制品、蛋制品、水產(chǎn)品及乳制品等食品為傳播媒介，進入人體消化道釋放致病因子[1-3]，引起腹痛、腹瀉、胃腸炎和發(fā)熱等癥狀，嚴重可導致死亡[4]。在2016年全國共報告的食源性疾病中，有23.9%的暴發(fā)事件是由沙門氏菌感染引起，它是造成食源性疾病的第二大致病菌[5]，可出現(xiàn)在乳制品加工、運輸、儲存、銷售等各個環(huán)節(jié)[6]。我國原料奶的質(zhì)量標準遠低于乳業(yè)發(fā)達國家[7]，因此，發(fā)展鼠傷寒沙門氏菌快速檢測，實現(xiàn)其早期篩查具有重要的現(xiàn)實意義。

目前針對鼠傷寒沙門氏菌檢測方法中，培養(yǎng)計數(shù)法是金標準方法，靈敏度高，但耗時長[8]；ELISA 是很多細菌的推薦檢測標準，檢測速度較快，但靈敏度偏低[9-10]；PCR 也是推薦標準方法，靈敏度較高，檢測速度也較快，但依賴于熱循環(huán)器，不適合進行現(xiàn)場檢測[11-12]。以上檢測方法均無法實現(xiàn)快速、現(xiàn)場、高靈敏的微生物檢測，無法滿足實際檢測要求。因此亟需開展快速靈敏、低成本和操作簡便的比色型生物傳感器用于鼠傷寒沙門氏菌的篩查。常用的比色策略是基于天然酶的催化作用[13]，但生物酶易失活、不易儲存、分離難、提取成本高，難以大規(guī)模應用[14-15]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)成本低、穩(wěn)定性高的貴金屬納米酶具有類過氧化物酶的催化活性，包括Au、Ru、Pd、Pt 和Os[16-18]。金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）制備簡單，生物相容性高[19]，向其中引入其它金屬來構(gòu)建多金屬納米結(jié)構(gòu)和核殼結(jié)構(gòu)[20]，產(chǎn)生協(xié)同效應，有助于提高酶活性[21-22]。LIU A[23]等構(gòu)建了Ag@Au 核/殼的三角形納米片作為葡萄糖比色檢測的納米探針，引入金殼不僅提高了銀納米片的穩(wěn)定性，還賦予材料葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根過氧化物酶（HRP）類雙重酶催化活性。免疫磁分離技術(shù)是一種在外加磁場作用下將目標細菌從樣本溶液中分離、富集的方法，通過具有鐵磁性的納米粒子的表面修飾目標細菌抗體的特異性識別來實現(xiàn)[24-26]。

本研究建立了一種基于多孔Au@PtNCs 的比色型生物傳感器。將Anti-S. typhimurium-mAb 與Au@Pt－NCs 靜電吸附偶聯(lián)形成Au@PtNCs@mAb，用羧基化磁珠（MNPs-COOH）與Anti-S. typhimurium-pAb 進行共價偶聯(lián)形成MNPs@pAb。兩者與鼠傷寒沙門氏菌溶液充分混合反應形成MNPs@pAb-S. typhimurium-Au@PtNCs@mAb 免疫磁細菌復合物，磁分離及富集。由于Au@PtNCs 優(yōu)良的類過氧化物酶催化特性，加入H2O2-TMB 進行催化反應，溶液顏色由無色逐漸變?yōu)樗{色，最后使用酶標儀測定652 nm 處的吸光度，從而測定計算目標細菌濃度來實現(xiàn)可視化快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 14028）為研究模型，蠟樣芽孢桿菌（CICC 10041）、單核細胞增生李斯特菌（ATCC 13932）和大腸桿菌O157∶H7（ATCC 43888）作為非靶向目標細菌。

Anti-S. typhimurium-mAb（1 g/L），Meridian 公司；Anti-S. typhimurium-pAb（2.8 g/L），F(xiàn)itzgerald 公司；三水合氯金酸（Ⅲ）、氯鉑酸、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、PVP（10 ku）、脫脂乳和牛血清白蛋白,Sigma Aldrich 公司；PBS 及PB 緩沖液、H2O2-TMB，索萊寶公司；BHI 培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基，北京奧寶生物技術(shù)公司；MNPs-COOH（直徑180 nm），上海So-Fe 生物醫(yī)藥公司；EDC，D&B 生物；NHSS，Yanye 生物技術(shù)公司；其他試劑均為市售分析純級，北京國藥集團。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore 超純水系統(tǒng)，Millipore 公司；超聲波清洗儀，昆山超聲波儀器有限公司；全波段酶標儀Infinite M200，北京賽百奧科技有限公司；96 孔透明酶標板，康寧公司；高速冷凍離心機，湖南湘儀有限公司；混勻儀和振蕩器，Scientific Industries 公司；恒溫培養(yǎng)箱，Benchmark 公司；JEOL JEM-1200EX 透射電子顯微鏡，JEOL 公司。

1.3 方法

1.3.1 多孔Au@PtNCs 制備

首先采用檸檬酸三鈉還原法合成13 nm AuNPs[27]，并進行了一些修改。多孔Au@PtNCs 的形成是以AuNPs 為核進行層層生長。具體合成方案如下：取31 μL AuNPs（10 mmol/L）加入969 μL 去離子水中，然后加入20 μL PVP（質(zhì)量分數(shù)10%）在室溫下均勻混合5 min。然后加入60 μL 氯鉑酸（100 mmol/L）和40 μL 100 g/L抗壞血酸并加熱至70 °C，反應15 min，溶液顏色由紅變黑，表明成功合成Au@PtNCs。將其冷卻至室溫，4 ℃下離心（5 500 r/min，10 min）處理2 次去除上清，沉淀用1.0 mL 的去離子水復溶，并于4 °C 儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫Au@PtNCs 探針制備

免疫Au@PtNCs 探針制備具體步驟如下：取500 μL合成的1.3.1 溶液，4 °C 下離心（5 500 r/min，10 min），使用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）清洗1 次，去除多余的PVP，使用500 μL PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）復溶，并加入25 μg Anti-S. typhimurium-mAb，室溫下靜電吸附3.5 h，反應結(jié)束加入50 μL BSA 溶液（10%），封閉多余位點，封閉時間為1.5 h，封閉結(jié)束之后，4 °C 下離心（5 500 r/min，10 min），使用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）清洗1 次，去除多余未修飾的抗體，沉淀使用500 μL的專用復溶液復溶，并置于4 °C 保存。

專用復溶液：10% 的蔗糖溶液+1% 的脫脂乳+1%的PVP，配置時可用30% 的蔗糖溶液+3% 的脫脂乳+3% 的PVP 等體積混合，溶劑為PB（0.01 mol/L，pH 8.0）。

1.3.3 免疫MNPs 的制備

取1 mg 的直徑為180 nm MNPs-COOH，用PB（0.01 mol/L，pH 6.0）清洗2 次，磁富集去除上清液，用1 mL PB（0.01 mol/L，pH 6.0）復溶；再加入EDC、NHSS，控制二者最終濃度為0.1 g/L，于室溫下反應30 min 以達到活化羧基，反應結(jié)束磁吸用PB（0.01 mol/L，pH 6.0）清洗去除多余的EDC、NHSS；將富集物于1 mL PB（0.01 mol/L，pH 8.0）復溶，加入200 μg Anti-S.typhimurium-pAb 置于室溫下反應3 h 偶聯(lián)抗體，反應結(jié)束加入100 μL 脫脂乳，封閉2 h，封閉結(jié)束磁富集清洗，于4 °C 下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 免疫探針合成條件優(yōu)化

1.3.4.1 標記pH

將20 μL Au@PtNCs 與20 μg Anti-S. typhimurium-mAb 使用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）分別調(diào)節(jié)pH 至5、6、7、8、9 的條件下進行偶聯(lián)，反應結(jié)束之后，4 ℃下離心（5 500 r/min，10 min）去除上清，最后將探針與1 mL 復溶液復溶，于4 ℃保存?zhèn)溆?。取制備的免疫探針不同偶?lián)pH 條件20 μL Au@PtNC@mAb與20 μL MNPs@pAb 和1 mL 濃度為1.1×103CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌于室溫下反應1 h，磁回收洗滌3次后，加入200 μL H2O2-TMB，在37 ℃中孵育10 min后用酶標儀測定OD652nm。

1.3.4.2 抗體偶聯(lián)時間

將20 μL Au@PtNCs 與20 μg Anti-S. typhimurium-mAb 在最佳pH 條件下進行不同的偶聯(lián)時間，反應結(jié)束之后，4 ℃下離心（5 500 r/min，10 min）去除上清，最后將探針與1 mL 復溶液復溶，于4 ℃保存?zhèn)溆?。在不同偶?lián)時間條件下，取制備的免疫探針20 μL Au@PtNC@mAb 與20 μL MNPs@pAb 和1 mL 濃度為1.1× 103CFU/mL 的鼠傷寒沙門氏菌于室溫下反應1 h，磁回收洗滌3 次后，加入200 μL H2O2-TMB，在37 ℃中孵育10 min 后用酶標儀測定OD652nm。

1.3.4.3 抗體飽和標記量

基于1.3.4.2 中所優(yōu)化的檢測條件，將20 μL Au@PtNCs 與10、15、20、25、30 μg Anti-S. typhimuriummAb 進行偶聯(lián)，反應結(jié)束之后，4 ℃下離心（5 500 r/min，10 min）去除上清，最后將探針復溶于1 mL 復溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ≈苽涞拿庖咛结?，即在不同抗體標記量下的20 μL Au@PtNC@mAb 與20 μL MNPs @pAb和1 mL 濃度為1.1× 103CFU/mL 的鼠傷寒沙門氏菌于室溫下反應1 h，磁回收洗滌3 次后，加入200 μL H2O2-TMB，在37 ℃中孵育10 min 后用酶標儀測定OD652nm。

1.3.4.4 Au@PtNCs 探針用量

基于1.3.4.3 中所優(yōu)化的檢測條件，將不同用量的免疫探針5、10、20、30、40 μL Au@PtNCs@mAb，與20 μg MNPs@pAb 和1 mL 濃度為1.1× 103CFU/mL 的鼠傷寒沙門氏菌于室溫下反應1 h，磁回收洗滌3 次后，加入200 μL H2O2-TMB，在37 ℃中孵育10 min 后用酶標儀測定OD652nm。

1.3.4.5 免疫學反應時間

基于1.3.4.4 中的所優(yōu)化的檢測條件，取30 μL Au@PtNCs@mAb 與20 μg MNPs@pAb 和1 mL 濃度為1.1×103CFU/mL 的鼠傷寒沙門氏菌在室溫下反應，將反應時間分別設(shè)定為10、20、30、40、50、60 min，磁回收洗滌3 次后，加入200 μL H2O2-TMB，在37 ℃中孵育10 min 后用酶標儀測定OD652nm。

1.3.5 比色傳感器性能檢測

1.3.5.1 檢測標準曲線的構(gòu)建

在1.3.4 中優(yōu)化的檢測條件下，分別加入0 以及97～ 9.7×106CFU/mL 不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌，設(shè)定7 個濃度梯度，并根據(jù)1.3.4 中的方法以及優(yōu)化條件，加入一定量的Au@PtNCs 探針和免疫MNPs，在室溫下內(nèi)反應50 min 后，磁回收洗滌3 次，隨后加入200 μL H2O2-TMB，用酶標儀測定OD652nm（每個濃度重復3 次），記錄相應的平均OD 值。

1.3.5.2 特異性實驗

通過檢測其它3 株常見的食源性致病菌來評價該比色傳感器的特異性。對靶菌（鼠傷寒沙門氏菌）、非靶菌（大腸桿菌O157：H7、單核細胞增生李斯特菌和蠟樣芽孢桿菌）以及它們的混合物，根據(jù)1.3.4 中的方法以及優(yōu)化的條件，加入一定量的免疫Au@PtNCs和免疫MNPs，在室溫下反應一定時間后，磁回收洗滌3 次，隨后加入200 μL H2O2-TMB 并置于37 ℃中孵育10 min，用酶標儀測定OD652nm（每個濃度重復3次），記錄相應的平均OD 值。

1.3.5.3 實際樣品檢測

為確定該比色型生物傳感器在真實樣品檢測中的實用性及可行性，進行實際樣品加標回收實驗。按照國標方法處理牛乳樣本，取上清液與不同濃度的鼠傷寒沙門氏菌混合，采用批內(nèi)和批間2 種方法。批內(nèi)實驗測定連續(xù)1 d，同一天重復3 次，批間實驗測定連續(xù)3 d，每天1 次，每個濃度均3 次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔Au@PtNCs 制備與表征

首先利用檸檬酸三鈉還原法合成13 nm AuNPs，呈淡紅色，用紫外—可見吸收光譜表征其光學性能，如圖1（a）所示，AuNPs 在520 nm 附近出現(xiàn)了很強的光吸收峰，同時通過TEM 對其形貌進行微觀表征，如圖1（b）所示，結(jié)果表明材料制備成功，具有良好的單分散性?；诖?，以13 nm AuNPs 為核進行生長，Pt形成多孔Au@ PtNCs，如圖1（a）所示，Au@PtNCs 溶液變?yōu)樽厣?，通過紫外—可見吸收光譜進行分析，波長在520 nm 處AuNPs 的吸收峰消失，這是由于Pt 殼沉積在Au@PtNCs 表面上引起的阻尼效應屏蔽了AuNPs 較強的表面等離子體共振，這與先前的研究一致[28]，表明Au@PtNCs 已形成核殼結(jié)構(gòu)。隨后進一步通過TEM 對其進行微觀表征，如圖1（c）所示，結(jié)果表明合成了粒徑均一且分布在100 nm 的Au@PtNCs。綜上，本研究成功合成出了粒徑均一、分散性較好的Au@PtNCs。

圖1 Au@PtNCs 表征

2.2 免疫Au@PtNCs 探針制備及優(yōu)化

抗體標記pH、抗體偶聯(lián)時間、抗體飽和標記量、Au@PtNCs 探針用量和免疫反應時間對檢測條件的優(yōu)化息息相關(guān)。因此，本實驗分別對抗體標記pH、抗體偶聯(lián)時間、抗體飽和標記量、Au@PtNCs 探針用量及免疫反應時間5 個條件進行優(yōu)化，使用酶標儀測定OD652nm。pH 會改變蛋白質(zhì)構(gòu)象影響抗體結(jié)合位點活性，從而使得探針結(jié)合效率發(fā)生變化。首先用NaOH（0.01 mol/L）對溶液的pH 進行調(diào)控，結(jié)果如圖2（a）所示，當pH 從5.0 增加到6.0 時，吸光度從0.74 增加至1.12；隨著pH 增加至9.0 時，吸光度降至0.70，在pH 為6.0 的條件下吸光值最大，這表明較高pH 不利于免疫反應進行，會導致比色信號減弱?？贵w偶聯(lián)時間也會影響探針結(jié)合效率，如圖2（b）所示，在最佳標記pH 下，隨著抗體偶聯(lián)時間的增加，吸光度逐漸增大，偶聯(lián)時間3.5 h 吸光度達到最大水平為1.19，之后趨于平緩，3.5 h 為最佳抗體偶聯(lián)時間。在上述最優(yōu)的條件下對抗體飽和標記量進行優(yōu)化，結(jié)果表明抗體使用量從10 μg 到25 μg，OD652nm從0.80 迅速變?yōu)?.55，隨著抗體使用量繼續(xù)加大，吸光度上升趨勢趨于平緩，由此可確定最佳抗體飽和標記量為25 μg，如圖2（c）；在最佳抗體飽和標記量（25 μg）的基礎(chǔ)上，進一步對免疫探針用量優(yōu)化，結(jié)果如圖2（d）所示，當探針用量從5 μL 增加至30 μL，吸光度從0.42 迅速增加至1.49，之后信號略有下降，可能是由于空間位阻造成的，由此可確定最佳探針用量為30 μL。在確定了最佳標記pH 為6、抗體標記量25 μg 以及免疫探針用量30 μL 的條件下，進一步優(yōu)化免疫反應時間。如圖2（e）所示，當免疫反應時間由0 min 增加到50 min 時，隨著免疫反應時間的增加其吸光值由0.60 增至1.58，至50 min 以后不再呈明顯上升趨勢，由此可確定最佳免疫反應時間為50 min。

圖2 檢測條件的優(yōu)化

2.3 比色傳感器對鼠傷寒沙門氏菌的響應性能分析

2.3.1 檢測標準曲線的構(gòu)建

在確認2.2 中優(yōu)化的檢測條件下，設(shè)置了一組具有濃度梯度的鼠傷寒沙門氏菌菌液（97～9.7×106CFU/mL）驗證該比色傳感器的檢測性能。如圖3 所示，以鼠傷寒沙門氏菌的濃度為橫坐標，以O(shè)D652nm為縱坐標，繪制標準曲線，OD652nm與目標細菌濃度在97～9.7×105呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，其線性方程為：y=0.274In(x)-0.8757(R2=0.987)，經(jīng)標準曲線計算獲得該生物傳感器的最低檢測靈敏度為81 CFU/mL。此外，還使用TEM 表征形成的免疫復合物圖像，表明已經(jīng)形成了雙抗夾心復合物。

圖3 以牛乳樣本繪制的標準曲線及免疫復合物TEM 圖像

2.3.2 特異性評價

特異性的識別對于評估分析實際樣品至關(guān)重要。用該比色型傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌（1.1×103CFU/mL）與其它3 株常見的致病菌：大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特菌（5×106CFU/mL），驗證本方法對鼠傷寒沙門氏菌的檢測特異性。如圖4 所示，非靶菌的吸光值明顯低于0.30。此外，含所有細菌的混合物的吸光度與目標細菌的水平相似，吸光度均達到1.90 以上。這些結(jié)果表明，該生物傳感器檢測鼠傷寒沙門氏菌具有良好的特異性，這歸因于合成的成本低、穩(wěn)定性高的Au@PtNCs 探針具有優(yōu)異的過氧化物酶模擬催化活性。同時，結(jié)合磁分離技術(shù)對目標細菌鼠傷寒沙門氏菌進行分離富集，實現(xiàn)了對比色型生物傳感器信號的放大。

圖4 基于Au@PtNCs 的比色型生物傳感器特異性評價

2.3.3 實際樣本檢測性能評價

為確定該比色型生物傳感器在真實樣品檢測中的實用性及可行性，進行牛乳樣本的加標回收實驗。如表1 所示，根據(jù)建立的標準曲線計算出各加標樣品批內(nèi)平均回收率為96.75%～101.75%，CV 為1.10%～5.13%，批間平均回收率為97.25%～101.35%，CV為3.01%～5.00%，以上結(jié)果說明該生物傳感器對鼠傷寒沙門氏菌的檢測具有實用性及可行性。

表1 牛乳樣本中鼠傷寒沙門氏菌的檢測分析

3 結(jié) 論

成功建立了一種基于多孔Au@PtNCs 的比色型生物傳感器檢測牛乳中鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028 的方法。最低檢測限為81 CFU/mL，線性范圍為97～9.7×105CFU/mL。對常見的3 株食源性致病菌進行檢測，均沒有出現(xiàn)交叉反應，表明該生物傳感器具有較好的特異性和選擇性。此外，在實際牛乳樣本加標實驗中，其加標回收率為96.75%～101.75%，CV 為1.10%～5.13%。由此方法可實現(xiàn)對鼠傷寒沙門氏菌簡單、快速、靈敏的檢測，且可用于其他的生物分子或化學目標領(lǐng)域。