李 芳, 李浩楠,余夢(mèng)瑤,賀黎銘,蔡 凌,羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所/菌類藥材系統(tǒng)研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室,成都 610041)

中藥材靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體。全年采收,除去雜質(zhì),剪除附有朽木、泥沙或培養(yǎng)基質(zhì)的下端菌柄,陰干或在40～50℃烘干[1]。靈芝是一種應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥,在我國的記載已超過2000年,被歷代醫(yī)藥學(xué)家認(rèn)為是滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的“仙草”,具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功效,能安心神、健脾胃、益氣血,臨床上多用于治療失眠、神疲乏力、心悸、腫瘤等。現(xiàn)代研究表明,靈芝含有多種化學(xué)成分,其中的活性成分以多糖、三萜、核苷、甾醇類為主,具有一定的抗腫瘤、降糖、保肝、抗衰老等活性[2]。

炎癥反應(yīng)是許多炎癥性疾病的早期癥狀之一,表現(xiàn)為發(fā)熱、疼痛、發(fā)紅、和腫脹,常見的炎癥性疾病包括皮炎、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等[3],慢性炎癥可以長時(shí)間持續(xù)存在,從而引起多種疾病,甚至導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。目前,非甾體抗炎藥是治療炎癥性疾病公認(rèn)的藥物,這些藥物通過抑制環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase,COX)阻止花生四烯酸代謝為前列腺素E2(PGE2),從而發(fā)揮其治療作用,但長期使用非甾體抗炎藥會(huì)引起胃腸道反應(yīng)等毒副作用[4]。因此,尋找安全性高的消炎新藥仍然是炎癥疾病的重要研究方向。靈芝藥用歷史悠久、來源廣泛、毒副作用少,是天然藥物的重要來源之一。近年來,國內(nèi)外出現(xiàn)了一些關(guān)于靈芝抗炎的研究報(bào)道,但是研究較少、不夠深入。基于此,本研究擬從靈芝核心種質(zhì)資源庫的30個(gè)靈芝菌株中提取有效成分,并通過體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行抗炎作用評(píng)價(jià),篩選獲得具有良好抗炎效果的靈芝菌株,以期為炎癥藥物開發(fā)提供更多的活性原料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 30個(gè)靈芝(Ganodermalucidum)菌株資源保藏于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所,子實(shí)體按常規(guī)的靈芝袋料栽培方法獲得。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RAW264.7 細(xì)胞系購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(中國上海),由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院菌類藥材研究所傳代保存。

1.1.3 試劑 谷氨酰胺(批號(hào)G8540-256)、丙酮酸鈉(批號(hào)L101019)購自四川愛得科技有限公司;脂多糖(LPS,貨號(hào)L2880)購自美國SIGMA公司;PRMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào):R8755-1L)購自美國SIGMA公司;青霉素-鏈霉素(批號(hào):V900929-100ML)購自上海百研生物科技有限公司;胎牛血清(貨號(hào):C04001-500ML)購自Bovogen 公司;MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑藍(lán))(批號(hào)298-93-1) 購自BIOFROXX公司;萘乙二胺鹽酸鹽(貨號(hào) DC07BA1002)、無水對(duì)氨基苯磺酸(貨號(hào) DC5BA0731)購自生工生物工程(上海)股份有限公司;亞硝酸鈉(NaNO2)、乙醇、NaCl購自成都長聯(lián)化工試劑有限公司。

1.1.4 儀器 BB5060UV二氧化碳培養(yǎng)箱(Heraeus公司);TS100熒光倒置顯微鏡(Nikon 公司);Fresco型離心機(jī)(SURVALL公司);SW-CJ-1D型潔凈工作臺(tái)(江蘇潔凈化設(shè)備廠);Multiskan Ascen酶標(biāo)儀(Thermo公司);LD210-1型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);5810R型高速冷凍離心機(jī)(德國 EPPENDORF);DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);25cm細(xì)胞刮刀(廣州潔特生物過濾股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 靈芝活性成分的提取 靈芝總多糖采用熱水回流提取,料液比為1∶50(靈芝/g:水/mL),提取溫度為100℃,提取時(shí)間為1h,提取2次。所得提取液用定性濾紙過濾2次,再用0.45um微孔濾膜過濾1次,并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得靈芝總多糖提取物,放于4℃冰箱備用。靈芝總?cè)撇捎靡掖紵峄亓魈崛》?料液比為1∶50(靈芝/g∶95%乙醇/mL),保持微沸,提取時(shí)間為1h,提取2次。所得提取液用定性濾紙過濾2次,并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮到70mL左右,在100℃水浴上蒸干,得靈芝總?cè)铺崛∥?放于4℃冰箱備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 從液氮罐中取出RAW264.7細(xì)胞,復(fù)蘇后于含10%胎牛血清、1‰抗生素的PRMI-1640培養(yǎng)基中,置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶80%左右時(shí),用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下,于培養(yǎng)液中吹打混勻,按1∶4-6傳代。

1.2.3 RAW264.7 細(xì)胞炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建及靈芝提取物抗炎活性評(píng)價(jià) 用不同濃度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞生成NO構(gòu)建細(xì)胞炎癥模型,同時(shí)考察LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性,綜合確定LPS的使用濃度。采用Griess法測定RAW264.7 細(xì)胞一氧化氮生成量。Griess A液(0.1%萘乙二胺二鹽酸)和 Griess B液(20%溶解在磷酸中的磺胺)等體積混合制備Griess 試劑。以0至100μM 的 NaNO2溶液為標(biāo)準(zhǔn)品,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)結(jié)束后,從孔板中取100μl上清液,再加100μl Griess試劑,室溫孵育30min。用酶標(biāo)儀測定孔板在540nm處的光吸收值(OD值)。將RAW264.7細(xì)胞以每孔4×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中,孵育過夜。次日加入含不同靈芝提取物 (終濃度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培養(yǎng)液預(yù)先培養(yǎng)2h,再加入 LPS培養(yǎng)48h以誘導(dǎo)NO生成構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型。計(jì)算NO抑制率=(對(duì)照組平均OD值-給藥組平均OD值)/對(duì)照組平均OD值×100%。NO含量和炎癥反應(yīng)成正相關(guān),以NO抑制率評(píng)價(jià)靈芝提取物抗炎活性。

1.2.4 靈芝提取物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞毒性的影響 采用MTT法檢測細(xì)胞活力以評(píng)價(jià)靈芝提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒性影響。將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板中,培養(yǎng)過夜,次日加入含不同靈芝提取物 (終濃度0, 12.5, 25, 50, 100μg/mL)的培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)48h。充分作用后,小心吸出孔板中的培養(yǎng)基,每孔加入100μl PBS和 10μl MTT溶液,培養(yǎng)4h后,每孔加入100 μl SDS溶液,孵育過夜。用酶標(biāo)儀測試孔板在570nm處的光吸收值(OD值)。計(jì)算細(xì)胞存活率=給藥組平均OD值/對(duì)照組平均OD值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝提取物產(chǎn)率

將30份靈芝種質(zhì)資源的30個(gè)靈芝子實(shí)體樣品,按照前述方法分別采用醇提和水提方式,獲得60個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品,提取率見表1。

表1 靈芝提取物產(chǎn)率統(tǒng)計(jì)

2.2 炎癥細(xì)胞模型構(gòu)建

結(jié)果表明,不同濃度的LPS(0,2.5,5,10,20,25μg/mL)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后,NO生成量均明顯增加,成功誘導(dǎo)形成細(xì)胞炎癥,見圖1。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2.5和5μg/mL LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力無明顯影響,其余高濃度LPS均對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力有顯著抑制作用,見圖2。綜合考慮,本研究確定以2.5 μg/mL LPS作為建立炎癥細(xì)胞模型的有效濃度。

圖1 不同濃度LPS對(duì)NO釋放量的影響

圖2 不同濃度LPS對(duì)細(xì)胞活性的影響

2.3 靈芝提取物對(duì)NO生成的影響

2.3.1 總?cè)茖?duì)NO生成的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明,30個(gè)靈芝總?cè)铺崛∥飳?duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7炎癥模型NO生成有不同程度的抑制作用,除去編號(hào)GL154、GL215、GL221、GL222、GL226外,其余25個(gè)靈芝總?cè)铺崛∥锞哂休^好的抑制NO生成的作用,抑制率>60%。

2.3.2 總多糖對(duì)NO生成的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明,28個(gè)靈芝總多糖提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7炎癥模型NO生成有不同程度的促進(jìn)作用,僅編號(hào)GL220、GL167具有一定的抑制NO生成作用,抑制率<30%。因此30個(gè)靈芝總多糖提取物均不具有抗炎作用。

2.4 靈芝提取物對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力的影響

2.4.1 靈芝總?cè)茖?duì)Raw264.7細(xì)胞活力的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明,30個(gè)靈芝總?cè)铺崛∥飳?duì)Raw264.7細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用,其中編號(hào)GL230、GL232、GL234、GL235、GL236、GL237、GL225、GL184靈芝總?cè)铺崛∥镆种谱饔妹黠@,抑制率>40%。

2.4.2 靈芝總多糖對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明,30個(gè)靈芝總多糖提取物對(duì)Raw264.7細(xì)胞活力有不同程度的抑制或促進(jìn)作用,其中編號(hào)GL227、GL229、GL232、GL234、GL235靈芝總多糖提取物促進(jìn)增殖作用明顯,促進(jìn)率>40%。

3 討論與結(jié)論

靈芝是我國常用的傳統(tǒng)名貴中藥材,已有3000多年的藥用歷史,具有扶助正氣、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效。靈芝資源在我國分布范圍很廣,北到黑龍江,西到新疆,南到云南,廣東等地均有靈芝的存在,其中江西、福建、廣東是我國靈芝資源的主產(chǎn)區(qū),我省也有豐富的野生資源[5-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明,靈芝具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化等藥理作用。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)靈芝還具有一定的抗炎作用[9-10]。本研究開展不同靈芝菌株的抗炎活性篩選,以期篩選獲得具有較好抗炎活性的靈芝菌株,拓寬靈芝應(yīng)用方向,提高對(duì)靈芝資源的利用度。三萜和多糖是靈芝的主要活性成分,本研究首先通過乙醇提取和水提取的方法分別獲得了靈芝總?cè)坪涂偠嗵?結(jié)果表明不同靈芝菌株子實(shí)體中的總?cè)坪涂偠嗵翘崛〉寐什煌?活性成分含量各有差異。LPS刺激小鼠RAWA264.7細(xì)胞炎癥模型是體外研究炎癥常用的細(xì)胞模型[11],NO是炎癥反應(yīng)中釋放的常見炎癥因子,可作為評(píng)價(jià)抗炎活性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[12],適用于類似本研究的大量樣品抗炎活性篩選,采用此法能快速獲得篩選結(jié)果。同時(shí)樣品對(duì)RAWA264.7細(xì)胞的毒性作用也是重點(diǎn)考察指標(biāo)[13]。綜合分析,30個(gè)靈芝總多糖提取物都不具有抗炎活性;編號(hào)GL219、GL 167靈芝菌株的總?cè)铺崛∥镌跐舛葹?2.5 μg/mL下,兼具抗炎活性良好(NO抑制率>60%)、無細(xì)胞毒性的優(yōu)點(diǎn),可作為進(jìn)一步篩選的抗炎原料。