宋立成，張宇涵，余忠闊，解立新△

研究表明，體外生長(zhǎng)的3D類器官能夠再現(xiàn)體內(nèi)對(duì)應(yīng)器官的基本屬性，成為研究損傷和修復(fù)再生的有力工具［1］。肺成體干細(xì)胞（adult stem cells，ASCs）衍生的類器官完全由上皮細(xì)胞組成，較普通2D培養(yǎng)平面可動(dòng)態(tài)展示細(xì)胞增殖分化過(guò)程，這更有利于呼吸道病毒感染后肺損傷的體外研究［2-3］。ASCs 分化成各類上皮細(xì)胞后，形成正常的頂端連接復(fù)合體，并具有上皮極性，但頂端或管腔表面包裹在類器官球體內(nèi)，而面向球體外部的基底外側(cè)表面與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用［4］。氣道上皮許多功能需要接觸球體的頂面或腔面，包括微生物相互作用，吸收藥物或毒素。類器官極性內(nèi)向（apical in，AI）的特點(diǎn)有可能限制其在感染模型中的廣泛應(yīng)用［5］。然而通過(guò)機(jī)械破碎氣道類器官使頂端表面暴露于培養(yǎng)基中的方法不能精確復(fù)制感染過(guò)程，甚至可能引起非特異性反應(yīng)［6］。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種類器官顯微注射模型，將病毒注射入類器官，使微生物與上皮極性表面直接接觸造成感染。為了更好地模擬呼吸道病毒感染，筆者優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，成功構(gòu)建極性外向（apical out，AO）肺類器官，增加呼吸道病毒對(duì)上皮的可及性，為呼吸道感染研究提供新平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8 周齡雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠60 只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。小鼠均用于肺組織獲取及類器官培養(yǎng)。小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。分選磁珠為去死細(xì)胞磁珠、CD45 磁珠及CD326（EpCAM）磁珠均購(gòu)自Miltenyi Biotec 公司。DMEM/F12、B27 補(bǔ)充劑、GlutaMAX、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Invitrogen 公司。Rspondin1、Noggin 購(gòu)自MedChemExpress 公司。 N-acetylcysteine、Nicotinamide、SB431542、SB202190、CHIR99021 購(gòu)自Sigma 公司。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）-7、FGF-10 購(gòu)自Peprotech 公司。ROCK 抑制劑Y-27632 購(gòu)自STEMCELL 公司。兔抗鼠α-微管蛋白（α-tubulin）抗體購(gòu)自Proteintech 公司，大鼠抗小鼠緊密連接蛋白（ZO-1）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司，驢抗兔二抗IgG H&L（Alexa Fluor?568）及羊抗大鼠IgG H&L（Alexa Fluor?647）抗體購(gòu)自Abcam 公司。無(wú)生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠、transwell 小室及配套的24 孔板購(gòu)自Corning 公司。顯微鏡為徠卡公司的DMI3000 B型，顯微操作系統(tǒng)為艾本德公司的TransferMan?4r 型，微量自動(dòng)注射儀為艾本德公司的FemtoJet?4x 型，微量移液器拉拔器為Sutter 公司的P-97 Flaming/Brown 型。綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的流感病毒PR8（GFP-PR8）為中國(guó)科學(xué)院微生物所方敏實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。PCR 試劑盒、TRIzolTM試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 呼吸道原代上皮細(xì)胞的獲取 參照Li等［7］的方法，1%苯巴比妥5μL/g 麻醉小鼠，切開(kāi)腹膜后剪斷腹主動(dòng)脈，沿胸骨柄剪開(kāi)胸廓，結(jié)扎氣管，將1.5 mL 注射器吸取少量混合分散酶和膠原酶D的酶液注入肺內(nèi)，將肺鼓起。將結(jié)扎后的肺取下，置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中漂洗，在3 mL 的Hanks'平衡鹽溶液中室溫消化30 min。將肺組織在DNase+DMEM 的培養(yǎng)基中將肺葉解離并切碎，置于搖床上按照300 r/min震蕩15 min。使用70μm及40μm篩網(wǎng)過(guò)濾組織懸液，1 200 r/min離心5 min后，懸液加入紅細(xì)胞裂解液1 mL置于37 ℃培養(yǎng)箱90 s。再次離心、重懸、計(jì)數(shù)，將細(xì)胞移至6 孔板中培養(yǎng)。按照說(shuō)明書(shū)要求，分別采用去死細(xì)胞磁珠、CD45磁珠及CD326磁珠對(duì)獲取的單細(xì)胞懸液進(jìn)行抗體特異性陽(yáng)性選擇和陰性選擇，以獲取上皮細(xì)胞進(jìn)行肺類器官構(gòu)建。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 參考多項(xiàng)研究對(duì)氣道類器官培養(yǎng)基進(jìn)行整合優(yōu)化［8-10］。根據(jù)生長(zhǎng)及分化需要，培養(yǎng)基分為擴(kuò)增及分化兩種類型。在培養(yǎng)的第1周，采用擴(kuò)增培養(yǎng)基誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖并形成類器官，從第2周起改為分化培養(yǎng)基，促進(jìn)干細(xì)胞向終末細(xì)胞分化。干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的主要成分包括Advanced DMEM/F12、雙抗（1%）、Rspondin1（500 μg/L）、Noggin（100 μg/L）、B27 添加物（2%）、Y-27632（5 μmol/L）、SB431542（10μmol/L）、SB202190（1μmol/L）、FGF-7（5μg/L）、FGF-10（20μg/L）、CHIR99021（3μmol/L）。干細(xì)胞分化培養(yǎng)基在擴(kuò)增培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加10%胎牛血清（FBS），并去除SB431542和CHIR99021。

1.2.3 類器官模型的構(gòu)建 參考Li等［11-12］的方法，獲得的上皮細(xì)胞在干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中稀釋，調(diào)整細(xì)胞含量為2×106/mL，放置無(wú)菌冰上。將4 ℃解凍的無(wú)生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠在冰上用預(yù)冷低溫低吸附槍頭與細(xì)胞懸液等體積混合。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置transwell 小室及配套的24 孔板，30 min 后拿出。迅速將100μL 細(xì)胞懸液加入小室底部，所有小室添加完畢后，將24孔板再次放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔10 min將24孔板上下翻轉(zhuǎn)放置。30 min 后拿出24 孔板，在小室外每孔加入410μL 干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，覆蓋小室底層膜。此后每隔2 d更換下層培養(yǎng)基。1周后更換為類器官分化培養(yǎng)基。2周后進(jìn)行傳代。采用傳3代的類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 類器官顯微注射 使用拉拔器將1 mm的細(xì)絲毛細(xì)管拉至一個(gè)細(xì)點(diǎn)，注射針經(jīng)酒精燈加熱形成90°彎曲，最大限度地減少注射過(guò)程中基質(zhì)膠中斷和針斷裂。在針頭直徑漸變至20μm處用細(xì)鑷子鉗斷注射針。在微量注射前的7 d，將類器官進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取橫斷面半徑為60～80μm 的類器官作為注射對(duì)象。通過(guò)使用0.4 nL 0.8%的70 ku FITC-dextran 靶向類器官進(jìn)行微注射來(lái)評(píng)估該平臺(tái)的效率。設(shè)置注射儀參數(shù)：注射壓力200 hPa，注射時(shí)間0.1 s，補(bǔ)償壓力2 hPa。觀察注射前后類器官直徑的變化。

1.2.5 類器官極性反轉(zhuǎn) 將transwell小室從24孔板取出，放置于超低吸附的6孔板中，每孔中加入3個(gè)transwell 小室，并加入5 mL EDTA 溶液，在4 ℃搖床上100 r/min 震蕩60 min。用1 mL低吸附槍頭輕柔沖洗transwell小室底膜，直至基質(zhì)膠全部回收。將6孔板內(nèi)的EDTA溶液及消化后的基質(zhì)膠全部放入15 mL 離心管中，4 ℃，200×g，離心3 min，去除上清液，加入干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基3 mL，然后轉(zhuǎn)移至超低吸附6孔板中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)。每隔2 d，小心吸取上層1/3的培養(yǎng)基進(jìn)行換液，并輕柔混勻整個(gè)培養(yǎng)基。通過(guò)光學(xué)顯微鏡每日統(tǒng)計(jì)各transwell內(nèi)反轉(zhuǎn)的類器官的比例（5個(gè)transwell為一組進(jìn)行合并統(tǒng)計(jì)）。培養(yǎng)1 周后，將類器官4 ℃，200×g，離心3 min，重新鋪到基質(zhì)膠中，通過(guò)HE染色鑒定是否反轉(zhuǎn)成功。

1.2.6 流感病毒感染類器官實(shí)驗(yàn) 將普通類器官培養(yǎng)體系的下層營(yíng)養(yǎng)液更換為同體積病毒維持液，分別加入0.1、0.01、0.001 感染復(fù)數(shù)（MOI）的GFP-PR8 病毒，在37 ℃下孵育2 h。將病毒維持液吸凈，用PBS清洗小室外層及孔板內(nèi)部3次，再添加等體積干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基，24 h后觀察類器官形態(tài)及熒光產(chǎn)生情況。在類器官注射實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算類器官體積后，按照60μL/mm3分別將PBS、GFP-PR8、PR8注射入類器官球中，在接種期間和接種后分別在下層培養(yǎng)基中加入絲氨酸蛋白酶抑制劑0.125 mmol/L。24 h 后，收集小室底部的基質(zhì)膠并進(jìn)行HE 染色及熒光染色。在類器官反轉(zhuǎn)模型中，將反轉(zhuǎn)后的類器官的培養(yǎng)基更換為病毒維持液，加入0.01 MOI 的GFPPR8病毒，在37 ℃下孵育2 h后進(jìn)行洗滌，隨后將接種的類器官重新包埋在基質(zhì)膠中，然后在擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在PR8感染中，將4塊6孔板中懸浮培養(yǎng)的類器官分成4組，分別為對(duì)照組、感染0.001 MOI 組、感染0.01 MOI 組、感染0.1 MOI組，在37 ℃下孵育2 h。在接種期間和接種后分別用絲氨酸蛋白酶抑制劑（0.125 mmol/L）處理PR8 接種的類器官。24 h后，對(duì)照組及各濃度感染組收集類器官進(jìn)行后續(xù)免疫熒光及PCR分析，重復(fù)6次。對(duì)類器官進(jìn)行PCR分析時(shí)，將Trypsin-EDTA 200 μL 加入上層小室中，對(duì)應(yīng)24 孔板中加入500 μL Trypsin-EDTA，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置30 min，每隔10 min 用1 mL 槍頭機(jī)械破碎基質(zhì)膠。30 min 后將基質(zhì)膠吸出，放置于15 mL 的預(yù)裝等體積Trypsin-EDTA 離心管中，10 min 后加入等體積培養(yǎng)基，4 ℃，500×g離心5 min，去除上清液及云霧狀基質(zhì)膠，細(xì)胞沉淀用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 免疫熒光染色 將transwell 底膜及黏附的基質(zhì)膠用刀片小心割下，在4%多聚甲醛中剝離基質(zhì)膠，并固定20 min，在70%乙醇中滲透，在含有0.1%Triton X-100 和3%牛血清白蛋白的PBS 中封閉60 min。將基質(zhì)膠與兔抗鼠αtubulin，大鼠抗小鼠ZO-1 抗體在4 ℃封閉緩沖液中孵育過(guò)夜，用PBS洗滌2次，分別與二抗驢抗兔IgG H&L抗體及羊抗鼠IgG H&L抗體孵育，置于阻斷緩沖液中在室溫下放置2 h，用PBS洗滌2次，與DAPI孵育，用PBS洗滌2次。

1.2.8 RT-PCR TRIzol 試劑盒提取基質(zhì)膠消化后的類器官的總RNA，Nanodrop 分光光度儀檢測(cè)RNA 純度和濃度。以RNA 為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.1.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，數(shù)據(jù)分布采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用表示，行t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M（P25，P75）表示，行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微注射對(duì)類器官形態(tài)的影響 將FITC-dextran 注射入類器官后，類器官的體積發(fā)生明顯增大，且直徑越小的類器官形態(tài)改變?cè)矫黠@，見(jiàn)圖1。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ITC-dextran 可均勻分布于整個(gè)類器官內(nèi)部，使球體充分充盈，熒光素未出現(xiàn)外溢，見(jiàn)圖2。

Fig.1 Morphological characteristics after microinjection of FITC-dextran in organoid圖1 類器官顯微注射FITC-dextran后的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

Fig.2 Observation of organoid imaging characteristics under a fluorescence microscope after microinjection圖2 熒光顯微鏡下觀察顯微注射后的類器官顯像特點(diǎn)

2.2 顯微注射GFP-PR8 病毒感染類器官特點(diǎn) 見(jiàn)圖3、4。在培養(yǎng)基中添加GFP-PR8 病毒，類器官上皮細(xì)胞感染效率很低，當(dāng)顯微注射GFP-PR8病毒到類器官腔內(nèi)，細(xì)胞感染率顯著增加，表現(xiàn)為極性向內(nèi)的纖毛區(qū)域GFP熒光更明顯，而α-tubulin的表達(dá)明顯減弱；HE 染色提示顯微注射后的類器官結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞間連接明顯破壞，細(xì)胞內(nèi)較多空泡形成。注射GFP-PR8 后，類器官內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)的ZO-1 較注射PBS 的表達(dá)量顯著減少，提示細(xì)胞間連接遭到的明顯破壞是由GFP-PR8感染，而非顯微注射引起。

Fig.3 Expression characteristics of specific proteins in organoids after microinjection of GFP-PR8(immunofluorescence staining)圖3 顯微注射GFP-PR8后類器官特定蛋白表達(dá)特點(diǎn)（免疫熒光染色）

Fig.4 Expression characteristics of specific proteins in organoids after microinjection of GFP-PR8(HE staining,×400)圖4 顯微注射GFP-PR8后類器官特定蛋白表達(dá)特點(diǎn)（HE染色，×400）

2.3 類器官極性反轉(zhuǎn)后的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 類器官內(nèi)部細(xì)胞核向中央腔偏移、纖毛反轉(zhuǎn)向外的類器官逐步增多，且類器官間的黏附程度增加。反轉(zhuǎn)后的類器官大小穩(wěn)定，未出現(xiàn)新的增殖、分化。纖毛細(xì)胞極性隨時(shí)間逐漸反轉(zhuǎn)向外，于第6 天起反轉(zhuǎn)比例趨于穩(wěn)定。見(jiàn)圖5—7。

Fig.5 Morphological comparition of AI and AO organoids(HE staining)圖5 AI及AO類器官形態(tài)學(xué)特點(diǎn)比較（HE染色）

Fig.6 The proportion of organoids with polarity reversal in the upper chamber of transwell to the total population of organoids圖6 Transwell上層小室中極性反轉(zhuǎn)的類器官占總體類器官的比例

Fig.7 Morphological characteristics of organoids under different culture conditions(×100)圖7 類器官在不同培養(yǎng)條件下的形態(tài)特點(diǎn)（×100）

2.4 極性反轉(zhuǎn)增加GFP-PR8 病毒感染類器官效率 GFP-PR8感染兩種類器官后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察AO 類器官GFP 的熒光明顯強(qiáng)于AI 類器官，提示AO 類器官PR8 感染效率更高，見(jiàn)圖8。通過(guò)HE染色可觀察到AO類器官內(nèi)部有較多壞死物質(zhì)堆積，外層纖毛排列紊亂，細(xì)胞連接松散，細(xì)胞質(zhì)疏松，有空泡形成，見(jiàn)圖9。

Fig.8 Characteristics of organoidafter infection with GFP-PR8(×100)圖8 類器官感染GFP-PR8后的特點(diǎn)（×100）

Fig.9 Morphological characteristics of AO organoids infected by PR8(HE staining)圖9 PR8感染AO類器官后的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)（HE染色）

2.5 極性反轉(zhuǎn)增強(qiáng)類器官對(duì)病毒感染的致傷效應(yīng) 見(jiàn)圖10。在低濃度時(shí)（MOI=0.001），兩種方式類器官內(nèi)IL-1β、CCL2、SCGB1A1、SCGB3A2、MUC5B 的mRNA 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中濃度時(shí)（MOI=0.01），類器官的上述基因表達(dá)水平AO均顯著高于同濃度刺激下的AI 類器官。而高濃度時(shí)（MOI=0.1），上述因子的表達(dá)水平AO較AI均有降低趨勢(shì)，而AI在濃度升高后mRNA水平還有繼續(xù)升高的趨勢(shì)。FOXJ1的表達(dá)水平在AO和AI間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig.10 Gene expression characteristics in AI and AO organoids after stimulation with different virus concentrations圖10 不同濃度病毒感染AI及AO類器官后的基因表達(dá)特點(diǎn)

3 討論

構(gòu)建真實(shí)模擬呼吸道病毒感染體外模型對(duì)肺部感染性疾病防治具有重要科學(xué)意義和臨床價(jià)值［13-14］。本研究中，筆者描述了兩種新的氣道類器官研究方法，目的是加強(qiáng)干預(yù)因素與類器官極性表面的直接接觸。兩種方法利用了內(nèi)源性干細(xì)胞的強(qiáng)大增殖能力，以及它們聚集并生成類器官的能力。這些類器官的組成細(xì)胞具有顯著的緊密連接，并由club細(xì)胞以及分化的纖毛細(xì)胞組成。纖毛細(xì)胞顯示出類似于體內(nèi)觀察到的形態(tài)特性，即纖毛處于極化段，細(xì)胞核位于尾端。由于小鼠及人類支氣管上皮對(duì)流感病毒均敏感，所以類器官是研究急性肺損傷的良好體外模型。

3.1 類器官極性反轉(zhuǎn)對(duì)模擬病毒感染意義重大 細(xì)胞極性在人甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染中起重要作用。人氣道上皮細(xì)胞，包括纖毛細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，是IAV的易感細(xì)胞，與非極化的細(xì)胞相比，極化的上皮細(xì)胞特征獨(dú)特，位于這些細(xì)胞的頂端和基底層的IAV特異性受體的差異表達(dá)和細(xì)胞蛋白的極化運(yùn)輸，這些在體內(nèi)系統(tǒng)中對(duì)塑造病毒的感染性起著重要作用［15］。使用類器官來(lái)研究微生物與宿主相互作用的一個(gè)挑戰(zhàn)是，上皮的頂端表面被封閉在球體內(nèi)，而外層基底膜封閉性較強(qiáng)，病原體難以進(jìn)入內(nèi)部［16］。筆者設(shè)計(jì)了一種方法來(lái)扭轉(zhuǎn)類器官的上皮極性，使頂端表面向外。通過(guò)去除培養(yǎng)系統(tǒng)中的ECM 蛋白，使類器官懸浮生長(zhǎng)，并保持了3D結(jié)構(gòu)。上皮極性逆轉(zhuǎn)可能是蛋白質(zhì)和細(xì)胞器從一極遷移到另一極的結(jié)果，也有可能存在其他機(jī)制，如對(duì)機(jī)械力的響應(yīng)，有助于調(diào)節(jié)腸樣外翻和極性，本研究描述的方法提供了一個(gè)平臺(tái)，以進(jìn)一步研究協(xié)調(diào)上皮形態(tài)發(fā)生。Co等［17］的研究也發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)后類器官Ki67 的表達(dá)有降低趨勢(shì)，提示反轉(zhuǎn)過(guò)程對(duì)增殖和分化有影響。

3.2 類器官極性反轉(zhuǎn)后黏附性增加 在懸浮培養(yǎng)的過(guò)程中，難免會(huì)出現(xiàn)類器官聚集黏附的現(xiàn)象。一方面是由于類器官極性反轉(zhuǎn)后，極性向外的區(qū)域具有分泌黏液蛋白成分的特性，導(dǎo)致相互接觸后產(chǎn)生粘連；另一方面，類器官外部的基質(zhì)膠若未完全消化，殘留的成分也會(huì)導(dǎo)致相互粘連［18］。因此，后續(xù)的改良實(shí)驗(yàn)需要盡量減少類器官之間的黏附，避免聚集成團(tuán)后影響病原體與所有上皮的有效接觸。

3.3 顯微注射的應(yīng)用范圍可進(jìn)一步拓展 類器官顯微注射模型的顯著特征包括保持類器官形態(tài)的完整性，可防止頂端分泌的產(chǎn)物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，并能夠選擇性地感染極化上皮的頂端。因此，該模型允許對(duì)微生物、上皮細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物之間的相互作用進(jìn)行廣泛研究［19］。目前，已有多項(xiàng)研究證實(shí)了顯微注射技術(shù)在腸道及呼吸道類器官中關(guān)于病原體-宿主相互作用、急性損傷等方面的可行性及價(jià)值［19-21］。未來(lái)更有前景的研究方法是將類器官與免疫細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，從而更加貼近實(shí)景下實(shí)現(xiàn)各種病理?xiàng)l件下的細(xì)胞相互作用，這對(duì)于深入探索復(fù)雜生態(tài)位的分子病理機(jī)制具有重要意義。