侯嘉茗,張博涵,阮入琳,張鑒慧,劉 坤,陳顥元,宋銘忻,張子群

旋毛蟲(Trichinellaspiralis,T.spiralis)是一種危害十分嚴重的食源性人獸共患寄生蟲[1],可感染豬、犬、貓和鼠等哺乳動物,有時也會感染人類[2]。旋毛蟲的感染主要是以誤食或生食含肌幼蟲包囊的肌肉,肌肉隨宿主的胃液消化,內(nèi)部的幼蟲暴露并鉆入十二指腸或空腸前段,雌雄成蟲進行交配后產(chǎn)生新生幼蟲,新生幼蟲隨血液循環(huán)到達全身肌肉,最終形成肌幼蟲并定居于全身的橫紋肌內(nèi),然后進入下一次循環(huán)[3]。旋毛蟲對宿主的侵害性主要分為3種方式,分別是剝奪機體營養(yǎng)成分、對機體造成機械損傷和分泌毒素等[4],旋毛蟲產(chǎn)生毒素大部分是以旋毛蟲排泄分泌抗原(Trichinellaspiralisexcreted secretory antigen,ES)的形式,并且ES抗原可引起宿主全身免疫應(yīng)答,是十分良好的抗原物質(zhì)[5]。診斷旋毛蟲疾病其目的在于早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防和早治療,從源頭上解決該病帶來的經(jīng)濟損失及人類健康等問題。旋毛蟲的診斷方法主要包括病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷及分子生物學(xué)診斷等。傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法(壓片法和集中消化法)在面對臨床大量檢測時,存在費時費力、靈敏性低、檢測效果不好及對人的創(chuàng)傷較大等多種弊端。分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法相對于傳統(tǒng)檢測方法來說具有較高準確性、敏感性和快速簡便等優(yōu)點。當實際檢測旋毛蟲時,常常會采取多種檢測手段并用的方式。已知在旋毛蟲各個發(fā)育階段都含有大量的海藻糖,它在旋毛蟲的生長發(fā)育和代謝中承擔著重要功能。在新生幼蟲體內(nèi)海藻糖含量占蟲體干重5.2%,在4 d齡成蟲體內(nèi)其含量占蟲體干重4.3%,在7 d齡成蟲體內(nèi)其含量占蟲體干重7.2%,在肌幼蟲體內(nèi)其含量占蟲體干重8.3%[6]。迄今為止,海藻糖的合成途徑含有5種,但除了畢赤酵母外,其余生物均需要海藻糖酶來代謝海藻糖[7]。因此,研究海藻糖酶具有重要的意義,但目前針對旋毛蟲海藻糖酶(Trichinellaspiralistrehalase,TsTRE)的研究尚不清晰。本研究全國首次表達rTsTRE蛋白,并證明該蛋白屬于ES中一成份,以該蛋白為免疫原建立的間接ELISA抗體檢測方法各性能均良好,可為進一步開發(fā)旋毛蟲診斷試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、蟲種及血清 體重為2.5～3.0 kg雌性新西蘭大白兔購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;旋毛蟲蟲種是從黑龍江省遜克縣的黑豬體內(nèi)分離得到的,并由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲與寄生蟲病學(xué)教研室保種和傳代;20份感染200條肌幼蟲42 d小鼠的陽性血清、20份健康小鼠的陰性血清、25份感染其他寄生蟲的陽性血清(感染華支睪吸蟲的豬血清5份、感染日本血吸蟲的小鼠血清5份、感染豬蛔蟲的豬血清5份、感染弓形蟲的小鼠血清5份和感染弓首蛔蟲的犬血清5份)及20份健康豬的陰性血清均由本教研室提供。

1.1.2 主要試劑E.coliBL21和E.coliDH5-α感受態(tài)細胞、T3 Super PCR Mix聚合酶均購自北京擎科生物科技有限公司;pMD18-T Vector克隆載體、SacI酶與HindIII限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒購自AXYGEN公司;Hochest 33342染色液、Trizol試劑、質(zhì)粒小提試劑盒、Ni-瓊脂糖凝膠6FF、TMB單組分顯色液和ECL發(fā)光液均購自百杰斯生物公司;Goat Anti-rabbit IgG/HRP和Goat anti-mouse IgG/HRP購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;pColdI表達載體由本教研提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)TsTRE基因組序列(基因號:XM_003380744.1),設(shè)計一對特異性引物,并引入SacI和HindIII酶切位點。該引物由吉林庫美生物有限公司完成,上游引物為TRE-SacI:5′-CGAGCTCATGGCATTGCTGTACGATCCGGA-T-3′;下游引物為TRE-HindIII:5′-CCAAGCT-TTCACATGGCATAATTGGGATATGGTC-3′。

1.2.2 構(gòu)建pColdI-TsTRE表達菌株 應(yīng)用集中消化法和改良版貝爾曼方法收集旋毛蟲肌幼蟲,Trizol法提取肌幼蟲總RNA基因組,后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用PCR技術(shù)以旋毛蟲cDNA為模板擴增TsTRE基因,PCR反應(yīng)體系為:T3 Super PCR Mix聚合酶 19.0 μL,引物 1.0 μL,cDNA模板4.0 μL;PCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,57 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,循環(huán)35次,72 ℃ 5 min,4 ℃保存。使用膠回收試劑盒純化目的基因并與pMD18-T Vector克隆載體連接后轉(zhuǎn)入到E.coliDH5-α感受態(tài)細胞中大量擴增,提取純化克隆質(zhì)粒進行SacI和Hind II雙酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送往吉林庫美生物技術(shù)有限公司測序。測序正確的目的基因與pCold I表達載體連接后轉(zhuǎn)入E.coliBL21感受態(tài)細胞中表達,再次雙酶切鑒定。對酶切正確菌株進行保存,命名為pColdI-TsTRE表達菌株。

1.2.3 蛋白純化及Western-blot分析 將表達菌株放置在37 ℃條件下重新復(fù)蘇,待菌液生長到對數(shù)生長期時加入濃度為1.0 mmol/L ITPG誘導(dǎo)劑分別在16 ℃條件下培養(yǎng)6 h、10 h、14 h、18 h、20 h和24 h,根據(jù)SDS-PAGE電泳篩選出rTsTRE蛋白的最佳ITPG誘導(dǎo)時間;再以最佳誘導(dǎo)時間為條件分別使用濃度為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L ITPG誘導(dǎo)劑進行分批誘導(dǎo),篩選rTsTRE蛋白的最佳ITPG誘導(dǎo)濃度。應(yīng)用親和柱層析的原理使用鎳柱純化rTsTRE蛋白,并利用Western-blot技術(shù)鑒定rTsTRE蛋白的反應(yīng)原性、抗原性及特異性(一抗是稀釋度為1∶500感染旋毛蟲42 d小鼠的陽性血清,二抗是稀釋度為1∶5 000 Goat anti-mouse IgG/HRP血清)。

1.2.4 免疫程序 用三通閥按照完全/不完全佐劑與rTsTRE蛋白1∶1的比例皮下多點注射新西蘭大白兔,第1次與第2次免疫間隔7 d,第2次與第3次免疫間隔14 d,每次免疫1 mg TsTRE重組蛋白,免疫前和每次免疫后收集一次血清,用于后續(xù)試驗。

1.2.5 間接免疫熒光方法定位 TsTRE蛋白按1.2.2所述方法獲取小鼠腿肌制備冰凍切片,并收集2 000條肌幼蟲置于1.5 mL離心管內(nèi);1 mL 4%多聚甲醛固定10 min;1mL PBS緩沖液清洗2～3次,每次5 min;1 mL 1% Triton X-100透膜20 min,清洗同上;滴加1 mL即用型山羊血清37 ℃封閉1 h,清洗同上;一抗為rabbit anti-TsTREIgG(1∶500倍稀釋)4 ℃孵育過夜,清洗同上;二抗為goat anti-rabbit IgG/AlexaFluor 555(1∶500倍稀釋)37 ℃孵育1 h,清洗同上;其中冰凍切片使用Hochest 33342復(fù)染,清洗同上;最后滴加適量的抗熒光淬滅劑,使用激光共聚焦顯微鏡觀察玻片,4 ℃避光下保存。

1.2.6 建立間接ELISA旋毛蟲抗體檢測方法

1.2.6.1 最佳包被抗原濃度和待測血清稀釋度的確定 采用矩陣點樣法,TsTRE蛋白稀釋至1.000 0 ng/μL、0.500 0 ng/μL、0.250 0 ng/μL、0.125 0 ng/μL和0.062 5 ng/μL并包被96孔板,使用血清稀釋度為1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000和1∶32 000的兔陰性血清和rabbit anti-TsTREIgG陽性血清進行檢測。根據(jù)酶標儀在OD450nm處讀數(shù),計算P(陽性血清)/N(陰性血清)數(shù)值,當P/N≥2.1且為最大數(shù)值時,則為最佳條件。

1.2.6.2 最佳抗原包被條件的確定 使用最佳抗原濃度包被96孔板,分別置于4 ℃過夜、37 ℃ 1 h和37 ℃ 2 h條件下包被,對陰/陽血清進行檢測,比較P/N數(shù)值。

1.2.6.3 最佳封閉液和封閉條件的確定 使用5% BSA溶液、1% BSA溶液、10%脫脂奶粉溶液和5%脫脂奶粉溶液作為封閉液,分別封閉37 ℃ 2 h、37 ℃ 1.5 h和37 ℃ 1 h,對陰/陽血清進行檢測,比較P/N數(shù)值。

1.2.6.4 最佳酶標二抗稀釋度和孵育條件的確定 將goat anti-rabbit IgG/HRP酶標二稀釋度設(shè)置為1∶7 000、1∶8 000、1∶9 000和1∶10 000,分別孵育37 ℃ 30 min、37 ℃ 45 min和37 ℃ 60 min,對陰/陽血清進行檢測,比較P/N數(shù)值。

1.2.6.5 最佳TMB反應(yīng)時間的確定 將TMB反應(yīng)時間分別設(shè)置為37 ℃ 5 min、37 ℃ 10 min、37 ℃ 15 min和37 ℃ 20 min,對陰/陽血清進行檢測,比較P/N數(shù)值。

1.2.6.7 重復(fù)性試驗 利用不同批次包被的96孔板和同批次包被的96孔板對20份感染200條旋毛蟲42 d小鼠的陽性血清進行檢測,每個樣品重復(fù)3個孔,設(shè)置陰性血清對照孔,測量OD450nm處數(shù)值,差異系數(shù)=(標準差/平均數(shù))×100%。

1.2.6.8 敏感性試驗 利用建立的間接ELISA方法分別對不同稀釋倍數(shù)的感染旋毛蟲的小鼠陽性血清進行檢測,每個樣品重復(fù)3個孔,確定該方法的敏感性[8]。

1.2.6.9 特異性試驗 利用建立的間接ELISA方法對華支睪吸蟲、日本血吸蟲、豬蛔蟲、弓形蟲和弓首蛔蟲陽性血清進行檢測,每個樣品重復(fù)3個孔,評價該間接ELISA方法的特異性[9]。

1.2.6.10 臨床檢出率試驗 使用上述建立的方法對20份豬陰性血清進行檢測,比較OD450nm處數(shù)值與臨界值之間的大小,陰性檢出率=[(20份豬血清數(shù)-陽性血清數(shù))/20份豬血清數(shù)]×100%。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建pCold I-TsTRE表達質(zhì)粒的結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,成功克隆TsTRE基因且目的基因條帶大小約為1 548 bp(圖1A);pMD18T-TsTRE克隆質(zhì)粒和pCold I-TsTRE表達質(zhì)粒的酶切條帶分別有兩條帶,分別是1 548 bp和2 692 bp(圖1B)及1 548 bp和4 377 bp(圖1C)。

A:PCR擴增產(chǎn)物;B:pMD18-TRE克隆質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物;C:pColdI-TRE表達質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。

2.2 rTsTRE蛋白表達和純化的結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果顯示,rTsTRE蛋白的分子量約為60 kDa(圖2),rTsTRE蛋白在細胞沉淀中表達量較多(圖2A);ITPG誘導(dǎo)最佳時間為24 h(圖2B);ITPG誘導(dǎo)最佳濃度為1.0 mmol/L(圖2C);純化后的蛋白顯示為較純條帶(圖2D)。結(jié)果表明,成功重組表達rTsTRE蛋白。

A:可溶性分析.M:蛋白質(zhì)分子量標準; 1:未誘導(dǎo)上清; 2:未誘導(dǎo)沉淀; 3:誘導(dǎo)上清; 4:誘導(dǎo)沉淀.B:ITPG濃度篩選.M:蛋白質(zhì)分子量標準; 2-7:分別誘導(dǎo)6 h、10 h、14 h、18 h、20 h和24 h的沉淀.C:ITPG時間篩選; M:蛋白質(zhì)分子量標準; 2-6:ITPG終濃度分別為0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1.0 mmol/L的沉淀.D:rTsTRE蛋白純化.M:蛋白質(zhì)分子量標準; 1:未過柱液體; 2:過柱流出液體; 3-5:經(jīng)wash buffer洗雜流出液; 6-11:經(jīng)elution buffer洗脫流出液。

2.3 Western-blot分析 根據(jù)Western blot結(jié)果可知,感染200條肌幼蟲42 d小鼠的陽性血清能與rTsTRE蛋白結(jié)合,且在60 kDa左右處有一清晰條帶(圖3)。

M:蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準; 1:小鼠陽性血清; 2:健康小鼠血清。

2.4 間接免疫熒光法定位 TRE蛋白分析根據(jù)激光共聚焦顯微鏡觀察可知,紅色熒光信號代表旋毛蟲TRE蛋白的分布位置,發(fā)現(xiàn)在旋毛蟲肌幼蟲體內(nèi)含有大量海藻糖酶,主要存在旋毛蟲蟲體前2/3處的桿狀體細胞、尾部的生殖原基處和表皮等部位(圖4)。

A:旋毛蟲肌幼蟲; B:小鼠腿肌制備的冰凍片。

2.5 間接ELISA反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 當P/N≥2.1時,實驗數(shù)據(jù)則有意義,即選擇最大P/N值,是該方法的最佳反應(yīng)條件。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,確定抗原包被濃度為1.0 ng/μL、血清稀釋度為1∶16 000、抗原包被條件為4 ℃過夜、封閉液選擇5%BSA且封閉條件為37 ℃封閉2 h、酶標二抗稀釋度為1∶10 000且孵育條件為37 ℃孵育2 h、顯色時間為10 min及陽性臨界值為0.384,見表1。

2.6 重復(fù)性試驗 使用同批次或不同批次包被的96孔板檢測相同20份感染旋毛蟲的小鼠陽性血清。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可知,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別在5.504%～7.630%之間及4.664%～9.929%之間,它們的差異系數(shù)均不大于10%,見表2。

表2 重復(fù)性試驗

2.7 敏感性試驗 將感染旋毛蟲的小鼠陽性血清從1∶10開始倍比稀釋,用優(yōu)化好的ELISA方法進行檢測,根據(jù)檢測結(jié)果判定陽性血清的最大稀釋度。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,當陽性血清稀釋度為1∶1 280時,檢測的OD450處值仍大于0.384且P/N大于2.1,表明該方法的最低檢出效價為1∶1 280,見表3。

表3 敏感性試驗

2.8 特異性試驗 使用建立的間接ELISA方法檢測感染旋毛蟲的小鼠陽性血清為陽性,而檢測華支睪吸蟲、日本血吸蟲、豬蛔蟲、弓形蟲、弓首蛔蟲陽性血清及正常小鼠陰性血清均為陰性,表明該方法均具有良好的特異性,見表4。

表4 特異性試驗

2.9 臨床檢測性試驗 使用建立的間接ELISA方法檢測20份陰性豬血清,檢測結(jié)果全部為陰性。

3 討 論

由旋毛蟲生活史可知,腸道內(nèi)的肌幼蟲發(fā)育為成蟲后產(chǎn)生的新生幼蟲會隨血液寄生在宿主肌肉部長達數(shù)月或更久,其蟲體抗原、表面抗原及ES抗原均會引起宿主的強烈免疫應(yīng)答,不同抗原產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體均會停留在血液中,這為血清學(xué)診斷方法提供了理論支撐。20世紀70年代,ELISA方法首次用于檢疫豬旋毛蟲病[10]。在實驗室診斷旋毛蟲疾病方法中,肌肉鏡檢法是最可靠方法,且當每克肌肉中含有3個肌幼蟲,則認為感染該病,但其缺點是費事費力;胃液消化法則程序復(fù)雜且不能應(yīng)用于活體檢測;皮膚實驗方法的假陽性率極高;實時熒光定量PCR方法雖最為準確但成本較高,且假陽性和假陰性的比例也較高[11]。與其他檢測方法比較,ELISA方法具有可用于活體動物檢測、靈敏度高、特異性好及獲取樣本簡便等優(yōu)點,因此該方法成為實驗室檢測手段中最為常見的方法。最初使用ELISA方法檢測旋毛蟲時,多以旋毛蟲的ES抗原為診斷抗原,但是ES抗原具有收集困難、耗費大量蟲體樣本、回收濃度較低和其成分復(fù)雜等缺點。因此,大批量制備重組蛋白則成為當今檢測旋毛蟲的最佳的選擇[12-14]。目前,針對旋毛蟲海藻糖酶的研究甚少,但是我們已經(jīng)得知在旋毛蟲發(fā)育階段的各個時期都含有大量海藻糖,但含量大有不同,從新生幼蟲發(fā)育到具有感染性肌幼蟲階段過程中,蟲體內(nèi)糖原含量提高了22倍,其中僅海藻糖含量就提高了17倍多[6]。因此,旋毛蟲海藻糖酶具有重要的意義。2022年馬玲玲等人原核表達產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素β1蛋白并以該蛋白為診斷蛋白建立間接ELISA檢測方法,結(jié)果表明,當診斷抗原濃度為10 μg/mL時,待測血清的最佳稀釋度為1∶16 384[15]。在本試驗中,當TsTRE的濃度為1 ng/mL時,待測血清的最佳稀釋度為1∶16 000,與旋毛蟲GAD、GLS、p49、p53和Serpin等重組蛋白建立的間接ELISA方法相比,其待測血清的稀釋倍數(shù)更大[16-17]。本試驗證明,制備的兔免血清可以識別肌幼蟲中的天然TsTRE蛋白,并且該蛋白分布于蟲體的桿狀體、尾部及表皮等部位。

綜上所述,本研究所表達的旋毛蟲TRE蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性。以rTsTRE蛋白建立的間接ELISA抗體檢測方法可應(yīng)用于現(xiàn)場的臨床檢測,為預(yù)防和控制旋毛蟲病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法。

利益沖突：無