卓文珊, 唐建鋒, 梁金勝, 曹日暉

(1. 中山大學(xué)分析測(cè)試中心, 廣東 廣州 510275; 2. 廣州宏度精細(xì)化工有限公司,廣東 廣州 510405; 3. 中山大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系, 廣東 廣州 510006)

N-酰基氨基酸是近年來(lái)發(fā)展較快、生產(chǎn)合成工藝研究較多、市場(chǎng)占有率不斷提升的一類重要表面活性劑[1-4]。其合成原料來(lái)源于生物質(zhì)直鏈脂肪酸和氨基酸,合成時(shí)將結(jié)構(gòu)不同的氨基酸和脂肪酸進(jìn)行組配,得到結(jié)構(gòu)和性能各異的表面活性劑,其中N-月桂酰氨基酸(NLAAs)及其鹽最為常見(jiàn)。與傳統(tǒng)表面活性劑相比,NLAAs性質(zhì)溫和,具有良好的乳化、潤(rùn)濕、增溶、分散、發(fā)泡等性能,同時(shí)可以降低傳統(tǒng)表面活性劑潛在的危險(xiǎn)性,表現(xiàn)出優(yōu)秀的生物降解性、生物相容性和高安全性,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于日用化學(xué)品中[5-12]。此外,NLAAs在石油燃料、食品、飲料、機(jī)械工業(yè)、生物醫(yī)藥、礦物浮選、紡織印染、農(nóng)藥生產(chǎn)等工業(yè)領(lǐng)域也都顯示出廣泛的應(yīng)用前景[13-16]。相關(guān)產(chǎn)品由于綠色環(huán)保、性能溫和的特點(diǎn),受到人們的歡迎,市場(chǎng)需求日益增大,宣稱“溫和、安全”的產(chǎn)品也越來(lái)越多。相關(guān)產(chǎn)品的售價(jià)也比傳統(tǒng)的表面活性劑高,市場(chǎng)上容易出現(xiàn)以次充好的現(xiàn)象。因此,原料的純度高低、原料的真假及產(chǎn)品質(zhì)量好壞的鑒別顯得尤為重要。這些問(wèn)題的存在對(duì)NLAAs檢測(cè)的準(zhǔn)確性、便捷性提出了更高的要求。

NLAAs是?；聂人犷惢衔?屬于陰離子表面活性劑。檢測(cè)陰離子表面活性劑的方法主要有兩相滴定法(TT)、亞甲藍(lán)分光光度法(MBSM)、流動(dòng)注射-亞甲藍(lán)分光光度法(FIA)和高效液相色譜法(HPLC)等[17-19]。TT只能測(cè)定陰離子表面活性劑的總量,對(duì)于多種表面活性劑配伍的樣品無(wú)法辨別種類并分別定量。對(duì)于含有甜菜堿、氧化胺等兩性表面活性劑的復(fù)配體系,也不能使用兩相滴定法,因?yàn)檫@些兩性表面活性劑在酸性條件下呈現(xiàn)陽(yáng)離子性質(zhì),會(huì)影響陰離子表面活性劑的準(zhǔn)確定量[20]。此外,用TT對(duì)NLAAs進(jìn)行滴定分析時(shí),容易出現(xiàn)結(jié)晶析出或者乳化現(xiàn)象,破乳困難,對(duì)滴定的終點(diǎn)判斷產(chǎn)生嚴(yán)重干擾[21]。MBSM和FIA都是基于陰離子表面活性劑與陽(yáng)離子染料亞甲藍(lán)反應(yīng)生成的亞甲基藍(lán)活性物質(zhì)在特征波長(zhǎng)下有吸收的原理進(jìn)行測(cè)試。方法測(cè)定的也都是陰離子活性物總量,而且樣品中的陽(yáng)離子活性物、硫酸鹽、磺酸鹽及酚類等配伍化合物都會(huì)對(duì)測(cè)試有干擾,導(dǎo)致結(jié)果偏高或偏低,必須要先消除干擾物才能進(jìn)行測(cè)試。這兩種方法主要被用于水質(zhì)中低濃度的陰離子表面活性劑的測(cè)定,對(duì)于洗護(hù)產(chǎn)品這類成分復(fù)雜且含有高濃度表面活性劑的樣品并不適合。與傳統(tǒng)方法相比,HPLC具有測(cè)試直觀、快速的優(yōu)點(diǎn),但從現(xiàn)有文獻(xiàn)[22-24]來(lái)看,該法一般是使用紫外檢測(cè)器(UV)或熒光檢測(cè)器檢測(cè)帶有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)或有較強(qiáng)紫外吸收的表面活性劑,如直鏈烷基苯磺酸鹽(LAS)等。對(duì)于無(wú)或弱紫外吸收的化合物用UV檢測(cè)靈敏度低,一般采用示差折光指數(shù)檢測(cè)器(RID)、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)或電霧式檢測(cè)器(CAD)[25-28]等通用型檢測(cè)器。對(duì)于大多數(shù)高效液相色譜儀用戶來(lái)說(shuō),基本上80%以上的化合物都是用UV來(lái)進(jìn)行測(cè)試,UV是HPLC儀器的基本配置,其他3種檢測(cè)器則較少配置。因此,建立HPLC-UV新方法對(duì)NLAAs的測(cè)試具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

洗護(hù)產(chǎn)品如洗面奶基質(zhì)復(fù)雜,通常含有一種或多種NLAAs,目前市場(chǎng)上較常使用的NLAAs有月桂酰谷氨酸(LG)、月桂酰甘氨酸(LC)、月桂酰丙氨酸(LA)及月桂酰肌氨酸(LS),若能同時(shí)檢測(cè)這4種化合物則可以極大地提高檢測(cè)效率。本研究針對(duì)這4種化合物的弱紫外吸收特點(diǎn),通過(guò)篩選合適的流動(dòng)相,選擇檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜柱,建立了HPLC-UV同時(shí)測(cè)定洗面奶中4種NLAAs含量的方法,為NLAAs原料的純度分析,原料生產(chǎn)監(jiān)控及洗護(hù)產(chǎn)品的品質(zhì)控制提供了新的技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司); XS205Du電子天平(美國(guó)梅特勒托利多公司); CPX5800H-C超聲波清洗儀(美國(guó)Branson公司); Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo公司);磷酸(分析純,廣州化學(xué)試劑廠); LG、LC、LA和LS對(duì)照品(純度≥98%,廣州宏度精細(xì)化工有限公司)。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取約8 mg(精確至0.01 mg)LG、LC、LA及LS對(duì)照品于4個(gè)10 mL容量瓶中,加入8 mL乙腈-0.10%H3PO4水溶液(60∶40, v/v),超聲溶解10 min,靜置至室溫,用乙腈-0.10%H3PO4水溶液(60∶40, v/v)定容,得到質(zhì)量濃度為800.0 mg/L的4種NLAAs對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。配制時(shí)用乙腈-0.10%H3PO4水溶液(60∶40, v/v)逐級(jí)稀釋,配成質(zhì)量濃度為2.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0、560.0、800.0 mg/L的系列對(duì)照品工作溶液。

1.3 樣品前處理

取洗面奶樣品大約10 mL,渦旋分散均勻后,準(zhǔn)確稱取約80 mg(精確至0.01 mg)樣品至10 mL容量瓶中,加入約8 mL乙腈-0.10% H3PO4水溶液(60∶40, v/v),超聲提取10 min后,靜置至室溫,用乙腈-0.10% H3PO4水溶液(60∶40, v/v)定容至刻度線,混勻,放置5 min,取適量上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾,濾液供高效液相色譜儀上機(jī)測(cè)試(供試品溶液可根據(jù)實(shí)際濃度用乙腈-0.10% H3PO4水溶液(60∶40, v/v)進(jìn)行適當(dāng)稀釋)。

1.4 液相色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流速:1 mL/min;流動(dòng)相A: 0.10% H3PO4水溶液;流動(dòng)相B:乙腈。檢測(cè)波長(zhǎng):205 nm。梯度洗脫條件:0～2.0 min, 60%B; 2.0～8.0 min, 60%B～95%B; 8.0～10.0 min, 95%B; 10.0～10.1 min, 95%B～60%B; 10.1～15.0 min, 60%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件考察

2.1.1提取溶劑選擇

N-月桂酰氨基酸表面活性劑既有疏水基團(tuán)又有親水基團(tuán),在有機(jī)溶劑和水溶液中均有較好的溶解性。參考已有標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[25-28],目前洗護(hù)產(chǎn)品中N-月桂酰氨基酸的提取主要是使用甲醇、乙腈、水、甲醇-水或乙腈-水的直接提取法,此法具有步驟簡(jiǎn)單、操作便捷的特點(diǎn)。根據(jù)卓文珊等[26]對(duì)表面活性劑原料使用不同比例的乙腈-水溶液提取月桂酰甘氨酸的研究結(jié)果,60%乙腈水溶液與80%乙腈水溶液的提取效果較好而且兩者之間差異非常小,為減少色譜分析過(guò)程中溶劑效應(yīng)的影響,本研究選擇色譜條件中的初始流動(dòng)相即乙腈-0.10% H3PO4水溶液(60∶40, v/v)作為提取溶劑。

2.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

LG、LC、LA和LS的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。4種NLAAs的結(jié)構(gòu)比較相似,分子結(jié)構(gòu)中的C=O不飽和鍵含有未共用單子對(duì),能產(chǎn)生n-π躍遷,由于躍遷能量較低,紫外吸收一般比較弱。對(duì)4種化合物的紫外吸收光譜圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)當(dāng)波長(zhǎng)低于240 nm時(shí)才開(kāi)始有微弱的紫外吸收,吸收強(qiáng)度隨著波長(zhǎng)的變短而增強(qiáng),最大吸收波長(zhǎng)約在205 nm處,因此方法選擇205 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖 1 LG、LC、LA及LS的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structural formulas of LG, LC, LA and LS

2.1.3酸性添加劑選擇

4種NLAAs結(jié)構(gòu)中都含有1個(gè)或2個(gè)羧基,結(jié)構(gòu)與有機(jī)酸類似,一般首選酸性緩沖溶液作為水相。但大多數(shù)酸性添加劑在205 nm波長(zhǎng)下也都有吸收,容易帶來(lái)干擾,因此必須進(jìn)行篩選。選擇HPLC常用的3種酸性添加劑包括1種無(wú)機(jī)酸(磷酸)及2種有機(jī)酸(乙酸和三氟乙酸),考察基線波動(dòng)及基線漂移的情況。結(jié)果顯示,采用磷酸時(shí)的基線比采用乙酸和三氟乙酸溶液時(shí)的基線更穩(wěn)定,梯度洗脫時(shí)對(duì)基線漂移的影響也更小。因此本方法選擇磷酸作為酸性添加劑。

2.1.4流動(dòng)相酸度選擇

圖 2 磷酸體積分?jǐn)?shù)對(duì)LG、LC、LA和LS峰面積與保留時(shí)間的影響Fig. 2 Effects of volume fraction of phosphoric acid on the peak areas and retention times of LG, LC, LA and LS

分別添加0.05%、0.075%、0.10%、0.125%和0.15%磷酸到水相中,運(yùn)行相同的洗脫程序,考察酸度變化對(duì)4種NLAAs峰面積和保留時(shí)間的影響,色譜圖見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,酸度變化對(duì)NLAAs保留時(shí)間的影響不大,基本保持不變。但隨著磷酸體積分?jǐn)?shù)的增加,峰形有所改善,峰的前延伸現(xiàn)象消失,分離度稍微增大。由于LG是雙羧基結(jié)構(gòu),添加0.05%磷酸時(shí),由于酸度不夠,部分羧基解離,出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。添加0.075%磷酸時(shí),LG仍可以看到肩峰現(xiàn)象,當(dāng)磷酸≥0.10%后,酸度的增強(qiáng)完全抑制了LG羧基的解離,只有一個(gè)峰,且隨著酸度的繼續(xù)增大峰面積基本保持不變。其他3種化合物是單羧基結(jié)構(gòu),磷酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)峰面積和保留時(shí)間的影響不大,基本上保持不變。LC和LS的色譜峰對(duì)稱性隨著酸度的增大而有所改善,在磷酸≥0.10%后基本保持不變。考慮到流動(dòng)相的酸性太強(qiáng)對(duì)色譜柱會(huì)有一定損害,而實(shí)際樣品的酸堿度也會(huì)有差異,有可能是弱堿性,流動(dòng)相須具備一定的緩沖能力,因此選擇磷酸的體積分?jǐn)?shù)為0.10%。

2.1.5洗脫方式及有機(jī)相選擇

洗面奶產(chǎn)品的配方成分通常都比較復(fù)雜,可能含有脂肪酸(如棕櫚酸、硬脂酸等)合成的強(qiáng)保留表面活性劑,使用梯度洗脫比等度洗脫更為合適。本文首先考察了使用甲醇和0.10% H3PO4水溶液作為流動(dòng)相的情況,比較了運(yùn)行含60%甲醇流動(dòng)相的等度洗脫程序和1.4節(jié)梯度洗脫程序?qū)悠贩蛛x效果的差異。結(jié)果顯示,梯度洗脫沒(méi)有出現(xiàn)等度洗脫時(shí)色譜峰輕微拖尾的現(xiàn)象,可以得到更加對(duì)稱的色譜峰,而且樣品中的強(qiáng)保留組分也快速流出,因此選擇梯度洗脫。然后考察了甲醇、乙腈作為有機(jī)相的差別,使用甲醇時(shí)基線出現(xiàn)了較嚴(yán)重的波動(dòng)與漂移現(xiàn)象,不利于低濃度目標(biāo)化合物的檢測(cè)。乙腈的截止波長(zhǎng)比甲醇更低,在同樣的梯度洗脫程序下,乙腈比甲醇的基線波動(dòng)和基線漂移更低,因此選擇乙腈作為有機(jī)相。

2.1.6色譜柱選擇

NLAAs是一類既有長(zhǎng)鏈脂肪烴,又有羧基的陰離子表面活性劑。長(zhǎng)鏈脂肪烴對(duì)色譜柱產(chǎn)生較強(qiáng)的吸附作用,羧基則容易產(chǎn)生次級(jí)保留作用,容易導(dǎo)致色譜峰拖尾。實(shí)驗(yàn)考察了不同類型的C18色譜柱,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)封端處理的Agilent Eclipse Plus C18色譜柱效果理想,因此選擇Agilent Eclipse Plus C18色譜柱來(lái)進(jìn)行方法驗(yàn)證。按照1.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)試,4種NLAAs對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖3a,此時(shí)4種化合物的色譜峰峰形尖銳,對(duì)稱性良好,理論塔板數(shù)在9 700～20 000范圍內(nèi),拖尾因子為0.93～0.98。洗面奶加標(biāo)樣品的色譜圖見(jiàn)圖3b,可以看到4種目標(biāo)化合物與洗面奶樣品中的其他成分均達(dá)到理想分離,無(wú)雜質(zhì)干擾,滿足分析要求。

圖 3 (a)對(duì)照品及(b)加標(biāo)樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of (a) standards and (b) spiked sample

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

取配制好的4種化合物系列對(duì)照品溶液,按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,分別以信噪比(S/N)為3和10時(shí)的濃度作為分析方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示:4種NLAAs在2.0～800.0 mg/L范圍內(nèi)都具有良好的線性關(guān)系,r≥0.999 5。方法的LOD較低,為0.17～0.49 mg/L, LOQ為0.57～1.63 mg/L。

表1 4種NLAAs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2.2儀器精密度和對(duì)照品穩(wěn)定性

取質(zhì)量濃度為50.0和200.0 mg/L的4種NLAAs對(duì)照品溶液,進(jìn)行6次平行測(cè)定,4種目標(biāo)化合物保留時(shí)間的RSD值為0.04%～0.23%,含量的RSD值為0.02%～0.24%。取上述溶液置于室溫下,于制備后0、12和24 h進(jìn)樣測(cè)定,得到對(duì)照品穩(wěn)定性結(jié)果,24 h內(nèi)4種NLAAs含量的RSD值為0.28%～0.84%。表明儀器的重復(fù)性良好,對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.3 與已有報(bào)道方法的比較

與TT、MBSM等傳統(tǒng)方法相比,HPLC方法可以更加精準(zhǔn)地得到氨基酸表面活性劑的具體含量,所用試劑種類少,而且無(wú)需使用三氯甲烷等有毒溶劑,降低了有機(jī)溶劑的消耗和環(huán)境污染問(wèn)題。本方法使用UV檢測(cè)器,UV檢測(cè)器與ELSD、RID、CAD等檢測(cè)器相比,具有適用性廣、檢出限低、線性范圍寬的優(yōu)點(diǎn)。以檢出限為例,本方法對(duì)LG、LC、LS的檢出限分別為0.42、0.49、0.17 mg/L,而已有報(bào)道的HPLC-ELSD對(duì)LC的檢出限為3.0 mg/L[26],對(duì)LG的檢出限為50 mg/L[25], HPLC-CAD對(duì)LS的檢出限為3.75 mg/L[28]。由此可見(jiàn)本方法的檢出限遠(yuǎn)低于已有的文獻(xiàn)方法。此外,本方法操作簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,HPLC對(duì)每個(gè)樣品中4種NLAAs的單針檢測(cè)過(guò)程在15 min內(nèi)就能完成,極大地提升了樣品的檢測(cè)效率。而且方法使用的UV檢測(cè)器是最通用的檢測(cè)器,也有利于方法的產(chǎn)業(yè)化推廣使用。

2.4 樣品分析

采用本方法對(duì)網(wǎng)上售賣的來(lái)源于不同廠家的5種氨基酸型洗面奶產(chǎn)品(編號(hào):S1～S5)進(jìn)行NLAAs含量檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表2。5個(gè)樣品均含有一種或多種NLAAs, NLAAs的總含量在64.58～97.01 mg/g范圍內(nèi)。所有樣品都含有LC, 含量為59.25 ～75.55 mg/g。此外,洗面奶S1、S2和S5中還含有LG,含量為2.55～37.76 mg/g,洗面奶S4中含有LA,含量為9.31 mg/g。將檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)簽進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):樣品S1～S4含有的NLAAs成分與產(chǎn)品標(biāo)簽保持一致,但S5中并沒(méi)有檢測(cè)到標(biāo)簽中標(biāo)有的主要成分LS,實(shí)際檢測(cè)到的是未在標(biāo)簽中列出的LC。結(jié)果表明對(duì)此類氨基酸表面活性劑產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管十分必要。采用本法在5個(gè)洗面奶樣品中精密加入不同體積的4種NLAAs對(duì)照品溶液,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。LG、LC、LA和LS在4個(gè)水平下的加標(biāo)回收率為94.3%～107.4%。可見(jiàn)方法的回收率較高,準(zhǔn)確度良好。使用此方法可以準(zhǔn)確地檢測(cè)4種NLAAs的含量,為洗面奶產(chǎn)品監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

表2 實(shí)際樣品中4種NLAAs的含量和加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化流動(dòng)相、選擇合適的色譜柱和檢測(cè)波長(zhǎng),解決了弱紫外吸收表面活性劑的檢測(cè)難題,建立了HPLC-UV同時(shí)檢測(cè)LG、LC、LA和LS 4種NLAAs的方法。使用本方法對(duì)市售的5款洗面奶進(jìn)行氨基酸表面活性劑的含量檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中1款洗面奶含有的NLAAs類型與產(chǎn)品標(biāo)簽不吻合,證明了對(duì)相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)的必要性。方法的前處理操作簡(jiǎn)單,精密度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性良好,為洗面奶產(chǎn)品中NLAAs的分析提供了可靠的技術(shù)手段,在N-月桂酰氨基酸表面活性劑的原料生產(chǎn)監(jiān)控、化妝品質(zhì)量控制以及化妝品市場(chǎng)監(jiān)控等方面均具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。