湯睿陽, 王繼芬*, 肖婷月, 覃仕揚, 接昭瑋, 張傲林

(1. 中國人民公安大學偵查學院, 北京 100038;2. 北京市公安司法鑒定中心, 法庭毒物分析公安部重點實驗室, 北京 100192)

合成大麻素類(synthetic cannabinoids, SCs)新精神活性物質(zhì)是通過模擬大麻的主要精神活性成分四氫大麻酚(Δ9-THC)與內(nèi)源性大麻素受體CB1結(jié)合而起興奮作用[1-3],吸食后能產(chǎn)生甚于天然大麻的強烈快感,產(chǎn)生嚴重依賴性,繼而出現(xiàn)濫用情況,是當今世界范圍內(nèi)種類最多、濫用最為嚴重的新精神活性物質(zhì)之一。因其廣泛濫用和娛樂致癮的特性,目前SCs已成為全球共同關(guān)注的熱點[4-7]。其中,N-(1-氨基-2,2-二甲基-1-氧代丁基-2-基)-1-丁基-1H-吲唑-3-甲酰胺(ADB-BINACA)、N-(1-氨甲?；?2-甲基丙基)-1-戊基吲唑-3-甲酰胺(AB-PINACA)、2-[1-(5-氟戊基)-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3,3-二甲基丁酸甲酯(5F-MDMB-PICA)和2-[1-(5-氟戊基)-1H-吲哚-3-甲酰氨基]-3-甲基丁酸乙酯(5F-EMB-PICA)是近幾年出現(xiàn)頻率較高的酰胺類SCs。這4種酰胺類合成大麻素分子的結(jié)構(gòu)信息見圖1。

圖 1 4種合成大麻素的結(jié)構(gòu)信息Fig. 1 Structure information of the four synthetic cannabinoids (SCs) 5F-MDMB-PICA: 2-[1-(5-fluoropentyl)-1H-indole-3-formylamino]-3,3-dimethylbutyrate methyl ester; 5F-EMB-PICA: 2-[1-(5-fluoropentyl)-1H-indole-3-formylamino]-3-methylbutyrate ethyl ester; ADB-BINACA: N-(1-amino-2,2-dimethyl-1-oxobutyl-2-yl)-1-butyl-1H-indazole-3-formamide; AB-PINACA: N-(1-carbamoyl-2-methylpropyl)-1-pentyl indazole-3-formamide.

同分異構(gòu)現(xiàn)象在合成大麻素類、合成卡西酮類、芬太尼類等新精神活性物質(zhì)中普遍存在[8,9]。5F-MDMB-PICA與5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這兩對同分異構(gòu)體均是由于一個甲基位置的不同而產(chǎn)生異構(gòu)[10-12],因而在結(jié)構(gòu)與性質(zhì)上的差異較小,當同時存在時分離鑒定較為困難,給公安實踐中該類SCs的檢驗鑒定帶來了一定的困難與挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有文獻顯示,檢驗酰胺類SCs的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[11]、超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectroscopy, UHPLC-HRMS)[12]以及超臨界流體色譜-質(zhì)譜法(supercritical fluid chromatography-mass spectroscopy, SFC-MS)[13]等,而對于同分異構(gòu)體的區(qū)分研究目前尚顯缺乏。Toyo’oka等[14]利用SFC-MS方法成功鑒別出8種合成大麻素,采用CO2作為超臨界流體色譜流動相,結(jié)合少量極性溶劑,實現(xiàn)了部分合成大麻素同分異構(gòu)體的有效分離,效果理想。然而目前絕大部分法庭科學實驗室都沒有配備超臨界流體色譜-質(zhì)譜儀器,因而該技術(shù)方法并不具備公安實戰(zhàn)推廣價值。目前有關(guān)5F-MDMB-PICA與5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA同分異構(gòu)體之間檢驗鑒定和有效區(qū)分的方法尚鮮有報道。

UHPLC-HRMS聯(lián)用技術(shù)近年來發(fā)展迅速,是法醫(yī)毒理學領(lǐng)域中檢驗SCs的熱點應用技術(shù)。目前國內(nèi)外將該技術(shù)廣泛應用于多種SCs代謝機理以及方法研究[15-17]。Tynon等[18]建立了血液中酰胺類SCs的LC-MS/MS快速檢測方法,成功檢出了AB-PINACA等8種合成大麻素;李佳瑞等[4]利用UHPLC-HRMS技術(shù),借助斑馬魚實驗模型,篩選出了5F-EMB-PICA的潛在代謝標志物,效果較為理想;古錕山等[19]采用LC-HRMS分析比較了斑馬魚體內(nèi)代謝模型、人體尿液樣本以及肝微粒體體外代謝模型以及人體真實尿液樣本中ADB-BINACA的代謝情況。

本研究建立了有效區(qū)分和同時檢測5F-MDMB-PICA與5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA兩對SCs同分異構(gòu)體的UHPLC-HRMS方法,并將所建立方法應用于實戰(zhàn)案例的檢材檢驗,旨在為實踐中相關(guān)SCs同分異構(gòu)體的檢驗鑒定提供思路參考和方法支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

Vanquish超高效液相色譜儀-Q ExactiveTMHF組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀(美國賽默飛公司),配有可加熱電噴霧離子源H-ESI。VORTEX2渦旋定速混勻器(德國IKA公司)。

1.2 藥品與試劑

甲酸銨、甲酸和甲醇(色譜純,純度99.99%,德國Merck公司);0.1%十二烷基硫酸鈉溶液(北京沃凱生物科技有限公司);超純水(屈臣氏蒸餾水); 5F-MDMB-PICA、5F-EMB-PICA、ADB-BINACA、AB-PINACA對照品(上海原思標物科技有限公司產(chǎn)品),純度≥98%。這4種酰胺類合成大麻素的基本信息見表1。

表1 4種酰胺類合成大麻素的具體信息

單一標準溶液配制:準確稱量5F-MDMB-PICA、5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這4種合成大麻素的標準物質(zhì)各5 mg,分別放置于50 mL的容量瓶中,加入甲醇充分溶解并定容,振蕩搖勻得到1 mg/mL的標準儲備液。用甲醇逐級稀釋配制得到1 000、500、200、100、50、20、10、5 ng/mL的單一標準溶液備用。

混合標準溶液配制:準確移取質(zhì)量濃度為1 μg/mL的5F-MDMB-PICA、5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這4種合成大麻素的單一標準溶液各1 mL,置于10 mL的容量瓶中,加入甲醇充分溶解并定容,用甲醇逐級稀釋配制成100、50、25、20、10、5、1 ng/mL的混合標準溶液,振蕩搖勻,裝入進樣瓶備用待測。

1.3 檢材前處理

毛發(fā)檢材 將毛發(fā)檢材用5 mL的0.1%十二烷基硫酸鈉溶液、超純水和丙酮各清洗2次,每次1 min,再用超純水沖洗3次,去除毛發(fā)表面殘留的丙酮,放置在陰涼通風處自然晾干。準確稱取20 mg清洗干凈的干燥毛發(fā)檢材放置于研磨管中,在研磨管中加入1 mL甲酸-甲醇(1∶2 000, v/v)溶液,將研磨管放置于球磨儀中充分混合研磨。將研磨完成的溶液轉(zhuǎn)移至新的研磨管中,放置于超聲波清洗器中超聲處理30 min。取超聲后溶液放置于離心管中,用低溫高速冷凍離心機以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液,過0.22 μm有機微孔過濾膜,裝瓶待進一步進樣分析。

煙絲檢材 稱取100 mg煙絲檢材放入試管中,加入甲醇溶液10 mL溶解,放置于超聲波清洗器中超聲處理30 min,取超聲后溶液放置于離心管中,用低溫高速冷凍離心機以8 000 r/min離心10 min,取上清液稀釋100倍后進樣分析。

1.4 實驗條件

色譜條件 Hypersil GOLD C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm);柱溫:30 ℃;流動相A:含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液;流動相B: 0.1%甲酸甲醇溶液;流速:0.3 mL/min;進樣體積:5 μL;梯度洗脫程序:0～35 min, 50%B; 35～38 min, 95%B; 38～40 min, 50%B。

質(zhì)譜條件 采用正離子掃描方式;數(shù)據(jù)采集模式采用一級全掃描(Full MS scan)和數(shù)據(jù)依賴二級掃描(dd-MS2);鞘氣壓力為38 arb;輔助氣壓力為10 arb;電噴霧電壓為3.8 kV;離子源溫度和離子傳輸管溫度均為350 ℃;碰撞氣為氬氣(Ar)。一級全掃描參數(shù)設置:分辨率6×104;最大注射時間100 ms;自動增益控制(automatic gain control, AGC)為3×106;質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000。二級掃描參數(shù)設置:分辨率3×104;最大注射時間50 ms; AGC為2×105;隔離窗口(isolation window)m/z2.0;歸一化碰撞能量(normalized collision energy, NCE)為10、40、70 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

研究過程中共比較了Q Exactive高分辨質(zhì)譜技術(shù)中的平行反應監(jiān)測(parallel reaction monitoring, PRM)和一級質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴二級質(zhì)譜掃描(Full MS/dd-MS2)這2種質(zhì)譜掃描模式。在實驗過程中,以5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA這對吲哚酰胺類合成大麻素同分異構(gòu)體為例,嘗試采用PRM模式對這兩種同分異構(gòu)體進行鑒別區(qū)分,但效果無明顯改善。由于在公安實踐工作中進行物質(zhì)初篩時,待測分析物通常未知[1],因而PRM模式存在一定缺陷。Full MS/dd-MS2則是通過母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)進行定性分析,參考母離子的峰面積進行定量分析,并不要求預知待測目標化合物的相關(guān)信息,符合公安實戰(zhàn)對于相關(guān)酰胺類合成大麻素的快速檢驗要求。實驗最終選擇Full MS/dd-MS2掃描模式來進行分析物的篩查區(qū)分。5F-MDMB-PICA、5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這4種酰胺類合成大麻素的二級質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖 2 4種合成大麻素在Full MS/dd-MS2全掃描模式下的二級質(zhì)譜圖Fig. 2 Secondary mass spectra of the four SCs in full scan/data-dependent secondary mass spectrometry (Full MS/dd-MS2) mode

結(jié)合圖2和表1中4種酰胺類合成大麻素同分異構(gòu)體的定性離子對信息,可以發(fā)現(xiàn),5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA這對同分異構(gòu)體的兩對定性離子對完全相同,均為377.2/232.1和377.2/144.1;而ADB-BINACA和AB-PINACA這對同分異構(gòu)體的兩對定性離子對分別為331.2/286.2與331.2/201.1、331.2/286.2與331.2/215.1,有一對相同的定性離子對。這兩對分析物均需要通過優(yōu)化色譜條件來實現(xiàn)有效區(qū)分。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1流動相條件優(yōu)化

實驗考察了2種有機相,分別是含0.1%甲酸的甲醇溶液和含0.1%甲酸的乙腈溶液;考察了3種水相,分別是0.1%甲酸水溶液、含10 mmol/L甲酸銨的0.1%甲酸水溶液和含10 mmol/L甲酸銨的水溶液。實驗結(jié)果顯示,采用甲醇作為有機相進樣時,分析物的響應度要優(yōu)于乙腈體系,整體峰形更好。此外在有機相和水相中均加入甲酸能夠使得基線更為平穩(wěn)[20,21],在水相體系中加入10 mmol/L的甲酸銨能夠有效增強離子強度,抑制化合物解離,顯著改善色譜峰形[22]。綜合上述指標,研究采用含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液作為水相,0.1%甲酸的甲醇溶液作為有機相。

圖 3 兩種合成大麻素單標及混合標準溶液的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the two SC standard solutions and a mixed standard solution

2.2.2梯度洗脫程序優(yōu)化

參考文獻[1],實驗初步采用常規(guī)梯度洗脫程序?qū)?0 ng/mL的5F-MDMB-PICA單標、50 ng/mL的5F-EMB-PICA單標以及50 ng/mL的5F-MDMB-PICA與5F-EMB-PICA混合標準溶液進樣分析,得到如圖3所示的色譜圖結(jié)果,可以看出,5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA這對吲哚酰胺類合成大麻素同分異構(gòu)體并不能得到有效區(qū)分,兩者色譜峰發(fā)生明顯重合。

研究過程中發(fā)現(xiàn),有機相濃度越高,樣本物質(zhì)在流動相的沖洗下出峰越快,相應的同分異構(gòu)體物質(zhì)間的出峰間隔越短,而當有機相與水相比例為1∶1時,能有效應對同分異構(gòu)體間極性差異較小的問題,兼顧分離效果與保留時間效率。在等梯度濃度的流動相作用下,更有利于實現(xiàn)色譜峰完全分離的目的,優(yōu)化后的洗脫程序參考1.3節(jié)。

采用優(yōu)化的洗脫程序?qū)?0 ng/mL的5F-EMB-PICA、5F-MDMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這4種酰胺類合成大麻素的混合標準溶液進樣分析,得到的提取離子色譜圖見圖4。

圖 4 4種合成大麻素的提取離子色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatograms of the four SCs

由圖4可見,4種酰胺類合成大麻素同分異構(gòu)體在該色譜條件下均得到了有效區(qū)分。在初步采用的洗脫程序條件下,5F-EMB-PICA的保留時間為24.16 min, 5F-MDMB-PICA的保留時間為24.24 min,兩者分離度為0.54,遠未能達到有效分離的目的。優(yōu)化后5F-EMB-PICA與5F-MDMB-PICA兩者的保留時間分別為27.22 min和30.42 min,分離度達到了2.06,實現(xiàn)了兩種分析物的完全分離。ADB-BINACA的保留時間為21.63 min, AB-PINACA的保留時間為23.26 min,分離度為1.22,分離程度達到了98.4%,基本達到了有效分離的目的。結(jié)果表明,對4種酰胺類SCs同分異構(gòu)體采取等梯度方法進樣,最終得到高達2.06和1.22的分離度,實現(xiàn)了兩對分析物分離的目的,區(qū)分效果理想。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

將質(zhì)量濃度為5、10、20、25、50、75、100 ng/mL的4種SCs混合標準溶液進樣分析,每個濃度點均進樣3次,以峰面積平均值y對質(zhì)量濃度x進行線性回歸,結(jié)果見表2。以色譜峰的信噪比(S/N)≥3,且符合定性要求(即保留時間、峰形及碎片離子豐度比均與相應目標物標準品數(shù)據(jù)保持一致)時樣本的最低濃度作為檢出限;以S/N≥10,且滿足準確度和精密度要求時的樣本最低濃度為定量限[1],結(jié)果見表2。結(jié)果表明,4種酰胺類SCs同分異構(gòu)體的線性關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,能夠滿足公安實踐工作中的檢驗要求。

表2 4種SCs的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 基質(zhì)效應、回收率和精密度

當樣本為毛發(fā)等復雜基質(zhì)時,基質(zhì)可能會對分析物的定量分析產(chǎn)生影響,并進一步影響方法的精密度和準確度[23],因此需要對所建方法的基質(zhì)效應進行考察。分別進樣分析低、中、高3個濃度的4種SCs標準溶液、空白毛發(fā)樣本提取后添加對應濃度的標準溶液、空白毛發(fā)樣本提取前添加對應濃度的標準溶液。實驗通過計算空白毛發(fā)樣本提取后添加對應濃度的標準溶液得到的峰面積均值與對應標準溶液的峰面積均值的比值來考察基質(zhì)效應大小。通過計算提取前的空白毛發(fā)添加樣本與提取后的空白毛發(fā)添加樣本的對應峰面積均值的比值考察這4種酰胺類SCs同分異構(gòu)體的回收率。

將平行配制的4種SCs標準溶液分別添加至空白毛發(fā)中,制成低、中、高3個水平(0.05、0.5和5 μg/g)的毛發(fā)陽性樣本,在1天之內(nèi)的早、中、晚3個時間段分別對同一條件、同一批次下的毛發(fā)陽性樣本前處理后進樣分析[24];通過色譜峰面積的相對標準偏差(RSD)考察精密度指標,每個含量水平平行實驗5次,重復上述操作連續(xù)進樣5天;結(jié)果見表3。

表3 毛發(fā)樣本中4種SCs的基質(zhì)效應、回收率、日內(nèi)和日間精密度

由表3可以看出,5F-MDMB-PICA、5F-EMB-PICA、ADB-BINACA與AB-PINACA這4種酰胺類SCs在毛發(fā)中的基質(zhì)效應在88.67%～111.76%范圍內(nèi),表明4種酰胺類SCs在低、中、高濃度水平下進行上述前處理方法的基質(zhì)效應滿足公安實踐檢測要求,可實現(xiàn)對毛發(fā)檢材中4種分析物的有效提取與定量分析。5F-EMB-PICA、5F-MDMB-PICA、ADB-BINACA和AB-PINACA這4種SCs的回收率為96.23%～105.11%,日內(nèi)、日間精密度(RSD)均小于10%,即所建立的該檢驗技術(shù)方法準確度和精密度均良好,符合公安實踐中對樣本的檢驗分析要求。

2.5 案例應用分析

采用上述建立的UHPLC-HRMS分別對疑似含有合成大麻素的毛發(fā)和煙絲檢材進行檢驗鑒定。

毛發(fā)和煙絲兩份檢材通過1.3節(jié)中所述方法進行前處理后,均采用UHPLC-HRMS方法檢測,得到的結(jié)果分別與標準品的相關(guān)參數(shù)進行對照。檢材的色譜圖結(jié)果見圖5。

圖 5 毛發(fā)和煙絲樣品的提取離子色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatograms of the hair and the tobacco samples

如圖5所示,兩個色譜峰的保留時間分別為23.43 min和30.61 min,與上述AB-PINACA、5F-MDMB-PICA標準品所對應的保留時間一致,結(jié)合表1中對應特征離子碎片信息,AB-PINACA的定性離子對為331.2/286.2和331.2/215.1, 5F-MDMB-PICA的定性離子對為377.2/232.1和377.2/144.1,可以確定毛發(fā)檢材中含有合成大麻素AB-PINACA,煙絲檢材中含有合成大麻素5F-MDMB-PICA。

采用外標工作曲線法對毛發(fā)檢材中的AB-PINACA含量和煙絲檢材中的5F-MDMB-PICA含量進行定量分析,得到毛發(fā)中AB-PINACA的含量為0.73 μg/g,煙絲中5F-MDMB-PICA的含量為11.3 mg/g。

3 結(jié)論

本文針對5F-MDMB-PICA和5F-EMB-PICA、ADB-BINACA和AB-PINACA這4種酰胺類SCs同分異構(gòu)體的區(qū)分檢驗進行了研究,通過優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件,建立了UHPLC-HRMS定性定量檢驗方法,成功實現(xiàn)了2對同分異構(gòu)體的有效區(qū)分鑒別,并進行了方法學驗證。將本研究建立的UHPLC-HRMS檢驗SCs同分異構(gòu)體的技術(shù)方法應用于公安實際案例之中,在繳獲的煙絲檢材中成功檢測出5F-MDMB-PICA成分,在毛發(fā)檢材中檢出了AB-PINACA成分,并進行了相應定量分析。該研究成果能夠滿足公安實戰(zhàn)工作中對酰胺類SCs的檢驗要求,并可為酰胺類SCs中多種同分異構(gòu)體的檢驗鑒定提供方法參考與思路借鑒。