王旭 施文娟 孔婷 孫榮華

（1 鎮(zhèn)江市城市綠化管理站，鎮(zhèn)江 212000；2 上海市園林科學規(guī)劃研究院，上海 200232；3 上海城市困難立地綠化工程技術研究中心，上海 200232）*為通信作者

黃馨（Jasminummesnyi），又稱云南黃素馨，為常綠藤狀灌木，喜溫暖濕潤的環(huán)境，因其適宜于堤岸、花架綠籬或坡地高地懸垂種植，在我國各地得到了廣泛栽培[1]。例如，在江蘇省鎮(zhèn)江市，黃馨是高架、立交橋道路及公園綠地等區(qū)域的主栽品種。

近年來，黃馨的病害發(fā)生引起了廣泛關注。目前，國內外已報道引起黃馨葉部病害的病原菌有C.cassiicola、C.siamense[2-3]，但鮮有關于黃馨枝干病害病原菌的研究報道。目前，鎮(zhèn)江市的黃馨上出現(xiàn)了一種新的枝干炭疽病，受害枝干在發(fā)病初期出現(xiàn)近橢圓形的病斑，隨著病程的推進，病斑可從數(shù)厘米長發(fā)展至整個枝干，病害發(fā)生嚴重時易造成大量枝干枯萎死亡，給當?shù)氐纳鷳B(tài)景觀效果帶來較大影響。鑒于此，筆者對鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌進行了分離培養(yǎng)和致病性測定，并利用傳統(tǒng)的形態(tài)學結合多基因聯(lián)合分析構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行了致病菌的鑒定，旨在為該病害的診斷及科學防控提供理論研究基礎?，F(xiàn)將相關研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 癥狀觀察

2019 年，筆者在江蘇省鎮(zhèn)江市七里甸街道，觀察并記錄黃馨枝干炭疽病的發(fā)病情況與危害特點，同時采集發(fā)病枝條帶回實驗室進行病原菌分離。

病害調查分級標準參照羅卿權等[4]提出的標準，具體為：0 級，無枝枯；1 級，1 枝無分枝的小枝枯萎；2 級，無分枝的小枝枯萎，數(shù)量大于1 枝；3 級，1枝有頂級分枝的枝條枯萎；4級，有頂級分枝的枝條枯萎且枝條枯萎數(shù)大于1 枝；5 級，1 枝或1 枝以上基部大枝（至少有兩級分枝）枯萎；6級，整株枯萎。

計算公式：株發(fā)病率＝（發(fā)病株數(shù)÷總株數(shù)）×100%；病情指數(shù)＝[∑(各級病株數(shù)×各級代表值)÷（調查總株數(shù)×最高級代表值）]×100。

1.2 病原菌的分離及形態(tài)學鑒定

將發(fā)病癥狀典型的病枝用組織分離法進行病原菌分離[4]，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA）。取發(fā)病枝條病健交界處約3 mm ×3 mm 大小的植物組織，經75% 乙醇消毒15～20 s、5%次氯酸鈉消毒2 min、無菌水漂洗3次、晾干后，接種在含1% 乳酸的PDA 平板上，然后將其置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在14 h 光照/10 h 黑暗條件下進行恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d 后，在光學顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特征，記錄分生孢子的形狀和大小，挑取孢子，采用玻片萌發(fā)法觀察附著胞的形態(tài)，參照相關文獻從形態(tài)上進行初步鑒定[5-6]。

1.3 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則進行致病性測定。具體方法為：用無菌手術刀劃傷枝條表皮，形成長度為1 cm 的傷口，將菌絲塊正面朝向傷口，用已浸濕無菌水的脫脂棉保濕，每個菌株重復接種3個枝條，并設置清水對照。接種后5～7 d 觀察枝條發(fā)病情況，并對發(fā)病枝條進行病原菌再分離，完成柯赫氏法則驗證。

1.4 多基因聯(lián)合鑒定

1.4.1 菌株DNA 提取與PCR 擴增

在接種菌株的PDA 平板于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱、14 h 光照/10 h 黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d 后，用滅菌的刀片刮取PDA 平板表面菌絲，置于研缽中，加入液氮研磨，采用CTAB 法提取基因組DNA[7]。對真菌的核糖體內轉錄區(qū)間隔區(qū)（internal transcribed spaces，ITS）、肌動蛋白基因（actin，ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）、ApMAT基因 (partial mating type Mat1-2 gene)、谷氨酰胺合成酶基因(glutamine synthetase gene，GS)、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）進行擴增，引物序列及退火溫度等見表1[8-9]，引物設計由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。PCR 體系總體積為25.0 μL，包括0.1 μL Taq 聚合酶（5 U/μL）、2.5 μL PCR Buffer(含Mg2+)、2.0 μL dNTPs、引物(10 μmol/L)各1.0 μL、1.0 μL 模板DNA，然后用滅菌ddH2O 補足25.0 μL。PCR 產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 引物序列、退火溫度及PCR 產物長度

1.4.2 聚類分析

采用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的Blastn 工具進行序列比對和同源性分析，下載相似性高的序列及其對應模式菌的序列用于聚類分析。將所需序列，用Clustal X 2.0.1 0 進行比對剪切后，按ITS-GAPDHACT-TUB-ApMAT-GS的順序分別首尾相連接，用MEGA-X 軟件以鄰接法（neighbor joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法 (Bootstrap，1 000次重復)檢驗各分支的置信度。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀觀察及病情調查

黃馨枝干炭疽病在鎮(zhèn)江市始發(fā)于4月下旬，故本研究于2019 年5 月—9 月進行調查，共調查50 株黃馨。結果表明，5月黃馨枝干炭疽病的病株率為28%、病情指數(shù)為12.5，6 月黃馨枝干炭疽病的病株率為48%、病情指數(shù)為19.0，7 月黃馨枝干炭疽病的病株率為62%、病情指數(shù)為32.0，8月黃馨枝干炭疽病的病株率為78%、病情指數(shù)為40.3，9月黃馨枝干炭疽病的病株率為82%、病情指數(shù)為42.6。黃馨枝干炭疽病在初發(fā)時，受害枝干出現(xiàn)黑褐色、近橢圓形病斑，隨著病情的推進，病斑中心凹陷，病斑擴展延長呈長橢圓形或不規(guī)則形，且無分枝的小枝受害時，小枝萎蔫；在發(fā)病后期，基部枝條上病斑沿枝干擴展成條塊狀，使枝條上葉片枯萎，直至黃馨整株萎蔫干枯。病原菌不僅可以侵染黃馨較小的分枝，導致分枝枯死，也可侵染黃馨基部主枝，導致黃馨整株枯萎死亡。

2.2 病原菌分離與致病性

從采集的發(fā)病癥狀典型的黃馨病枝中，分離培養(yǎng)得到10 個菌落形態(tài)一致的分離物（命名為JM-1），其菌落呈圓形，邊緣整齊，初期為白色；氣生菌絲為白色至灰白色，后漸變?yōu)樯罨疑?、絮狀或絨狀，培養(yǎng)皿背面呈現(xiàn)不均勻的灰白色。挑取菌落邊緣的菌絲轉移純化，將菌株命名為2019JM。為驗證菌株2019JM 的致病性，將其接種于黃馨枝條，接種5 d 后發(fā)現(xiàn)，接種枝條萎蔫，發(fā)病癥狀與黃馨枝枯病自然狀態(tài)下的感染癥狀相同，接種清水的枝條不發(fā)病。對接種發(fā)病的黃馨枝條進行病原菌再次分離，所得分離物的菌落形態(tài)與原分離物JM-1 一致，證明2019JM 為黃馨枝干炭疽病的病原菌。

2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

將病原菌2019JM 接種在PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中、于14 h 光照/10 h 黑暗條件下，培養(yǎng)5 d 后，病原菌分生孢子呈橢圓形至長橢圓形，兩端鈍圓或一端略尖，無隔膜，單細胞，無色；分生孢子大小基本相近，大小為（12.1～16.5）μm×(4.0～5.0)μm，見圖1-A。分生孢子萌發(fā)后，在頂端產生附著胞，附著胞為黑褐色、棍棒形或橢圓形，邊緣大多規(guī)則，大小為(5～11)μm×(4～8)μm，見圖1-B。依據(jù)孢子和附著胞的形態(tài)特征，將其初步鑒定為炭疽菌屬真菌，具體的種需要采用分子手段進行進一步鑒定[5-6]。

圖1 菌株2019JM 的形態(tài)特征

2.4 病原菌rDNA-ITS 序列分析

提取病原菌基因組DNA 并對ITS、GAPHD、GS、TUB2、ACT和ApMAT序列片段進行PCR 擴增，將序列提交給NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得序列號，具體見表2。以Colletotrichumhippeastri（CBS 241.78）作為外群[6]，多基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹的聚類分析結果見圖2，菌株2019JM 與GenBank 中的模式菌株暹羅炭疽菌C.siamense(ICMPl8578、LC2940、LC2941、CBS125378) 以很高的支持率聚為一支，表明菌株2019JM 為暹羅炭疽菌。因此，綜合依據(jù)形態(tài)學鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，本研究將引起江蘇省鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌鑒定為C.siamense。

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析中的菌株信息

圖2 基于多基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

3 結論與討論

炭疽菌屬(ColletotrichumCorda)真菌寄主廣泛，是世界范圍內許多糧食作物及經濟作物上的重要致病菌[5-6]，但是，炭疽菌屬不同種之間的形態(tài)特征差異微小，且繼代培養(yǎng)性狀不穩(wěn)定，故依據(jù)形態(tài)特征鑒定炭疽菌不夠準確。同時，ITS基因序列難以區(qū)分膠孢炭疽菌復合群下近緣相似種之間的差異[10]，但依據(jù)多基因序列可以有效鑒定膠孢炭疽菌復合群下各種，故目前，多基因分析方法已成為炭疽菌屬真菌鑒定的必要手段[5-6]。例如，ApMAT和GS的單基因或者雙基因可以將暹羅炭疽菌從膠孢炭疽菌復合群下鑒定出來[5-6]。本研究前期采用單基因分析發(fā)現(xiàn)，依據(jù)ITS基因發(fā)育樹的自展支持率較低，不能有效區(qū)分各序列的進化關系，而GS、TUB-2、ApMAT基因可以將暹羅炭疽菌的各菌株聚在一起，但是對膠孢炭疽菌復合群下其他種的自展支持率較低，說明只有依賴多基因序列才能有效區(qū)分膠孢炭疽菌復合群下各種的進化關系。

暹羅炭疽菌C.siamense最早在泰國咖啡上被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后有C.siamense在草莓、葡萄、油茶、辣椒、橡膠等多種寄主植物上發(fā)生的報道[6,8,11-14]，由于C.siamense具有較強的致病力，故對寄主植物的經濟價值和生態(tài)效益構成了嚴重威脅。在鎮(zhèn)江市，C.siamense為害黃馨枝干引起的炭疽病一般在4 月下旬開始發(fā)生，病害初發(fā)時，受害枝條上出現(xiàn)不規(guī)則病斑，無分枝的小枝受害時，會造成小枝枯萎；在5 月—6 月，黃馨枝干炭疽病的病株率有所升高，但病害總體發(fā)生程度較輕，偶有頂級枝條萎蔫，多表現(xiàn)為無分枝的小枝枯萎和枝干部位出現(xiàn)病斑；7 月—9月是黃馨枝干炭疽病的發(fā)病高峰期，且此時夏季高溫，受溫度脅迫易造成大量枝干枯萎死亡，甚至造成黃馨整株枯死，嚴重影響了黃馨的生態(tài)景觀價值。

本研究利用病原菌形態(tài)特征結合多基因聯(lián)合構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，首次明確了引起鎮(zhèn)江市黃馨枝干炭疽病的病原菌為C.siamense，這為該病害的診斷提供了理論依據(jù)，且這是國內首次報道C.siamense引起黃馨枝干炭疽病。

有研究認為，炭疽菌易發(fā)生復合侵染，即多種炭疽菌可同時侵染同一寄主植物。另據(jù)文獻報道，辣椒炭疽病的致病菌有4 種；李楊等[14]在海南省的油茶上分離到3種不同的炭疽菌。因此，關于黃馨枝干炭疽病是否存在優(yōu)勢菌株和復合侵染現(xiàn)象也有待進一步研究確認。