姚鑫宇 武瑞騏 陳廣輝 李振興 陳定聰 張結 鄒起平 紀曉鋒 周賓賓*

1.廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530000 2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)作為一種慢性流行病,其主要特征是骨量減少,骨微結構惡化,致使骨骼強度降低,發(fā)生骨折的概率增大[1],流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),2020年中國OP或者低骨密度的病人達2.866億例,預計2050年會增加到5.333億例[2],形勢不容樂觀?，F(xiàn)階段,OP的治療以藥物為主,在臨床上較為常用的有選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽和降鈣素等。這些藥物可以緩解骨丟失從而改善臨床癥狀,但長期應用會受到耐受性低、副作用嚴重和經(jīng)濟成本高等多方面因素的限制。因此尋求一個療效穩(wěn)定、安全性高的治療藥物顯得尤為重要。

近年來,隨著中藥研究的投入不斷加大,臨床及科研工作者對其作用機制、臨床應用的理解逐步加深,部分具備療效好、副作用小、經(jīng)濟性價比高等優(yōu)點的中藥獲得患者及臨床工作者的廣泛認可。中藥地黃(Rehmannia glutinosa Libosch)在中國傳統(tǒng)醫(yī)學長達千年的實踐歷史中占據(jù)重要地位,是眾多醫(yī)方中不可缺少的一部分[3]。在中醫(yī)理論中腎藏精主骨,化生骨髓,以髓養(yǎng)骨,腎虛則精虧,骨枯髓減。肝藏血,主疏泄,人體氣血得以正常運行,若肝失疏泄,則氣血運行不暢,氣滯血瘀;肝主筋,筋連接骨和關節(jié),肝虛則筋骨肌肉無以濡養(yǎng)。而地黃味甘、苦,性寒,歸肝、腎經(jīng),具有補血滋陰,益髓填精的功效?！侗静菥V目》中“填骨髓、長肌肉、生精血”的描述肯定了地黃對筋骨肌肉虛勞諸證的補益作用。已有研究證明,其提取物的活性成分有促進骨形成及抑制骨吸收等作用,常被組方應用于OP的預防及治療[4]。臨床治療中地黃多運用于六味地黃丸、血府逐瘀湯等經(jīng)典組方,其臨床功用得到充分證實。然而,其單體作用機制仍未被完全闡述清晰。綜上,本文欲通過總結地黃活性成分治療OP的相關文獻,以期探討其防治OP的作用機制,望能在防治OP的基礎、臨床方面提供一些新思路。

1 地黃活性成分治療OP的相關研究

現(xiàn)代藥理學的研究顯示,地黃分離的活性成分包括環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類等(表1)。在這些化合物的作用下,地黃發(fā)揮了抑制氧化應激、抑制腫瘤發(fā)展、緩解炎性反應等多種功效[5]。近年來,多項治療OP的研究表明,地黃及其活性成分可以調(diào)節(jié)多種與OP相關的信號通路中重要靶細胞的表達,是當前OP藥物防治研究領域的熱點。

表1 地黃主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Rehmannia glutinosa Libosch

1.1 環(huán)烯醚萜苷類化合物

環(huán)烯醚萜苷類化合物(iridoid/secoiridoid glycosides)屬于單萜類化合物,在龍膽科和玄參科等植物中較為常見[6]。研究發(fā)現(xiàn),環(huán)烯醚萜苷的各種生物活性在治療OP方面發(fā)揮了重要作用。梓醇(Catalpol)、桃葉珊瑚苷(Aucubin)、京尼平苷(Geniposide)屬于中藥地黃環(huán)烯醚萜苷類化合物中分離得到的主要化學成分,在治療OP、腫瘤、糖尿病等多種疾病中都起到了令人滿意的效果。Chen等[7]研究表明,梓醇可以通過激活信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)從而增強骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cell, BMSC)以及其介導的血管生成。同時,體內(nèi)實驗中還證實,梓醇可加速雙側(cè)卵巢切除大鼠模型的骨修復并促進血管生成。此外Ha等[8]研究發(fā)現(xiàn),京尼平苷被認為對OP的治療有作用,因為它們參與成骨細胞的細胞增殖,并抑制破骨細胞的細胞增殖。還有研究表明,桃葉珊瑚苷具有強大的抑制OP的作用,不僅可以增加成骨細胞的分化,同時也能抑制骨吸收,從而促進皮質(zhì)骨厚度及密度增大[9]。本文對環(huán)烯醚萜苷類化合物參與抗OP的機制研究實驗進行了匯總(表2),為將來其成為OP治療候選藥物提供一定理論支持。

表2 環(huán)烯醚萜苷類化合物治療OP的研究模型及作用機制Table 2 Research model and mechanism of action of iridoid in the treatment of OP

1.2 苯乙醇苷類化合物

苯乙醇苷類化合物(phenylethanoid glycosides)是一類天然糖苷類化合物。目前已經(jīng)從地黃中分離出多種苯乙醇苷類化合物,其中主要化學成分包括毛蕊花糖苷(Verbascoside/Acteoside)和松果菊苷(Echinacoside)等。其具有抗OP、緩解炎性反應和抑制氧化應激的功能。Yang等[10]發(fā)現(xiàn),毛蕊花糖苷主要是通過下調(diào)RANKL/核因子κB受體激活因子( receptor activator of nuclear factor kappa B,RANK)通路、抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor κb,NF-κB)和刺激磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路,從而調(diào)控下游蛋白靶點的表達,進而改善骨小梁的結構和恢復骨骼生理狀態(tài)。還有研究表明,毛蕊花糖苷減少了腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)所介導的炎癥產(chǎn)生,這與活性氧類(reactive oxygen species,ROS)減少一起有助于抑制破骨細胞生成,增加了成骨細胞的增殖和分化,而且毛蕊花糖苷通過改善小梁微結構和骨生物力學能力,在雙側(cè)卵巢切除術小鼠中表現(xiàn)出預防骨質(zhì)流失的潛在作用(表3)[11]。

2 地黃活性成分治療OP的相關信號通路

2.1 Wnt/β-catenin通路

眾所周知,成骨細胞的分化及成熟過程中,Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路發(fā)揮了重要作用。在缺乏Wnts時,糖原合成激酶-3β(glycogen synthesis kinase-3β,GSK-3β)將下游的目標靶β-catenin磷酸化。Wnt3a與Frizzleed以及低密度脂蛋白受體相關蛋白5或6(LDL-receptor-related protein,LRP5/6)共受體結合,從而誘導β-catenin磷酸化,進而穩(wěn)定細胞質(zhì)內(nèi)LRP5/6,更重要的是這一過程下調(diào)了GSK-3β活性,并引起β-catenin積累,最終使β-catenin轉(zhuǎn)位到細胞核,與核轉(zhuǎn)錄因子T細胞因子/淋巴增強子因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor,TCF/LEF)相結合,使相關蛋白靶基因活性提高,進一步促進了成骨細胞的分化和增殖[12-13]。而Dickkopf相關蛋白1(Dkk1)和骨硬化素可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮作用,使成骨細胞的活性降低,并且進一步降低骨形成的程度,因而導致OP[14]。

有研究表明,梓醇能抑制去勢OP大鼠Dkk1和骨硬化素的表達,并降低磷酸化的β-catenin與β-catenin的比值,使β-catenin的核轉(zhuǎn)位增加,從而激活TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子,進而促進β-catenin下游成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)激發(fā)活性,發(fā)揮成骨的作用[15]。Zhu等[16]的研究也同樣表明,梓醇可促進BMSC成骨并防止卵巢切除后誘導的骨丟失。根據(jù)他們的結果,梓醇的促成骨作用與Wnt/β-catenin通路的激活有關,因為梓醇處理后P-GSK-3β、總β-catenin和核β-catenin的表達水平顯著增強。研究表明,京尼平苷實現(xiàn)抗OP的作用是通過抑制小核酸分子(microRNA-214)的活性,從而上調(diào)了Wnt/β-catenin信號通路,促進前成骨細胞及軟骨細胞ATDC5的增殖及成熟[17]。此外,京尼平苷還通過在體內(nèi)外激活胰高血糖素樣肽-1受體(glucagon like peptide-1 receptor,GLP-1R)表達來改善地塞米松誘導的OP。由此可見,地黃及其活性單體治療OP的過程中可以通過Wnt/β-catenin信號通路多靶點的調(diào)控成骨細胞,進而影響骨代謝,促進骨形成,這為OP的治療提供了理論支持(圖1)。

圖1 地黃及其活性單體介導Wnt及BMP/Smads信號通路抗OP的作用機制Fig.1 Mechanism of Rehmannia glutinosa Libosch and its active monomers mediating Wnt and BMP/Smads signaling pathways against osteoporosis

2.2 BMP/smads通路

影響成骨細胞的關鍵信號通路是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)/Smads信號通路[18]。作為BMP配體成員的BMP2表現(xiàn)出高成骨活性,明顯增加骨鈣素表達,促進骨和軟骨形成。BMP與兩種類型的跨膜Ser/Thr激酶受體結合,包括I型受體和II型受體,以激活Smads和非Smads信號[19]。Smad有助于將BMP信號從受體傳遞到靶基因,促進Smad1、5、8等轉(zhuǎn)導因子磷酸化后翻譯到細胞核中,激活RUNX2轉(zhuǎn)錄表達,以促進早期成骨mRNA的表達[20],從而調(diào)節(jié)骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨鈣素(osteocalcin,OCN)等特定成骨細胞分化標志物的表達水平來激活骨形成。

有研究表明,桃葉珊瑚苷強烈增加了Smad1/5/8的水平,從而提高了ALP、OCN的表達,進一步促進骨生成,充分證明BMP2介導Smads信號傳導在促進成骨細胞分化過程中具有重要意義[21]。Li等[22]的研究也同樣表明桃葉珊瑚苷增加了MG63細胞,以及通過影響B(tài)MP/Smads通路促進OP小鼠骨組織中BMP2、P-Smads的表達,因而有利于分化成骨細胞,進一步提高骨骼密度,實現(xiàn)抗OP效果。由此可見,通過調(diào)控BMP/Smads通路地黃及其活性成分對成骨細胞的分化具有促進作用,提高骨密度,最終實現(xiàn)抗OP(圖1)。

2.3 PI3K/Akt軸

作為一個重要信號通路,PI3K/Akt軸在細胞存活、分化和生長的控制中起著不可替代的作用,并具有與其他信號通路和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡相互作用的能力,最終控制骨細胞分化[23]。在破骨細胞方面,PI3K/Akt信號級聯(lián)在破骨細胞生成過程中調(diào)節(jié)c-Fos表達,進而調(diào)節(jié)破骨細胞功能[24]。活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1,NFATc1)是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子,可調(diào)節(jié)破骨細胞特異性基因抗酒石酸酸性磷酸酶5(tartrate-resistant acidphosphatase 5,Tracp5)、組織蛋白酶K(cathepsin K,CTSK)等的表達,提高破骨細胞成熟增殖活性。Akt磷酸化的增加顯著促進了c-Fos的激活[25],從而上調(diào)破骨細胞標記基因(TRACP5、CTSK等)。在成骨細胞方面,胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfac-tor-1,IGF-1)具有調(diào)控成骨細胞合成代謝的作用[26]。PI3K/Akt/mTOR通路與Runx2在調(diào)控成骨細胞分化的過程中相互依賴。PI3K亞基和Akt的蛋白質(zhì)水平被Runx2提高,而PI3K/Akt/mTOR通路極大地加強了Runx2以及Runx2依賴性轉(zhuǎn)錄的基因結合。正是因為這種正反饋循環(huán),Runx2在成骨細胞分化及其遷移中的活性得到進一步促進了,從而加快成骨細胞的生長。

Jang等[27]發(fā)現(xiàn)松果菊苷可以抑制PI3K/Akt/c-Fos通路,下調(diào)PI3K表達、降低Akt磷酸化水平和降低c-Fos表達,從而實現(xiàn)了對破骨細胞增殖成熟能力的下調(diào)。Gong等[28]發(fā)現(xiàn),梓醇通過PI3K/Akt/mTOR通路不僅增強了IGF-1的分泌,而且增加了成骨細胞MC3T3-E1細胞中p-mTOR、p-IGF-1R和p-PI3K的蛋白表達,并激活Runx2的調(diào)控,進而上調(diào)了成骨細胞活性,實現(xiàn)了對OP的抑制作用。Li等[29]發(fā)現(xiàn)地塞米松抑制了PI3K/Akt/mTOR通路中關鍵蛋白的水平,而毛蕊花糖苷減弱了這種抑制作用,并且上調(diào)了成骨細胞活力。由此可得,地黃及其活性成分在可以通過PI3K/Akt通路選擇相應的靶點,從而達到上調(diào)成骨細胞成熟分化,抑制破骨細胞骨破壞活性的作用,這為治療OP提供了更多選擇(圖2)。

2.4 OPG/RANKL/RANK通路

骨保護素(osteoprotegerin,OPG)/RANKL/RANK信號通路在骨吸收和骨重建過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,是破骨細胞分化成熟過程中的關鍵信號途徑[30]。RANKL與其受體RANK之間的相互作用,這會導致各種下游信號通路的激活,從而誘導破骨細胞生成相關基因的表達。RANKL作為刺激破骨細胞的調(diào)控靶點之一,其作用是通過與RANK結合導致破骨細胞前體增殖、成熟來完成的。OPG可以與RANK的結合,從而降低RANKL與RANK結合的比例,進而達到降低破骨細胞相關活性表達的目的。白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)是一種促進炎癥反應的細胞因子,它能夠通過刺激IL-6的活性而增加破骨細胞的表達,從而增強破骨細胞的功能并促進RANKL的表達,從而使NF-κB受體與RANKL結合,促進破骨細胞的增殖。RANKL信號誘導c-Fos與NFATc1結合,NFATc1立即刺激破骨細胞TRACP和CTSK等相關基因的活性。CTSK可以分解部分骨基質(zhì)蛋白,如I型膠原(collagen type I,Col I),進而影響骨代謝,促進骨丟失。

Zhang等[31]發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷顯著降低OP小鼠血清中IL-1的濃度,降低RANKL細胞中NFATc1、TRACP5和CTSK的表達,從而抑制骨丟失,而且他們發(fā)現(xiàn)梓醇可以刺激RANK誘導磷酸酶及張力蛋白基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)磷酸化,從而抑制破骨細胞的形成。還有研究表明,松果菊苷可以增強成骨細胞分化和礦化,包括成COL I分泌以及OPG產(chǎn)生,同時降低RANKL蛋白含量,達到促進成骨細胞生長,減少破骨細胞的生成[32]。Meng等[33]發(fā)現(xiàn)梓醇通過抑制RANKL引起核因子κB抑制因子A ( recombinant inhibitory subunit of NF kappa B alpha,IκBα)磷酸化來抑制NF-κB、p65之磷酸化與核轉(zhuǎn)位,降低NFATc1的mRNA和蛋白表達水平,因此TRACP、CTSK等基因表達也隨之受到抑制,從而達到了抗OP的作用。綜上,炎性因子與OPG/RANKL/RANK信號通路有著緊密的聯(lián)系,可以促進RANKL的表達而地黃及其活性成分可以抑制炎性因子并通過調(diào)控該通路抑制破骨細胞,最終達到抗OP的目的(圖3)。

圖3 地黃及其活性單體介導OPG/RANKL/RANK通路抗OP的作用機制Fig.3 Mechanism of Rehmannia glutinosa Libosch and its active monomers mediating the OPG/RANKL/RANK pathway against osteoporosis

2.5 Keap1/Nrf2通路

氧化應激是氧化和抑制氧化之間平衡被打破的結果,氧化應激可以促進破骨細胞分化導致OP的發(fā)生。核因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor, Nrf2)是細胞氧化還原平衡的關鍵[34]。從生理狀態(tài)上看,Nrf2中Neh2結構域和Kelch樣環(huán)氧氯丙烷有關蛋白(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)穩(wěn)定地結合于細胞質(zhì)中,處于非活性狀態(tài)。Keap1是泛素-蛋白質(zhì)連接酶(ubiquitin-ligase protein,E3)的適應蛋白,負責Nrf2的持續(xù)泛素化和降解[35]。當大量ROS激發(fā)細胞發(fā)生氧化應激反應時,叉頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型(forkhead box O,FoxO)被激活,下調(diào)了成骨細胞的增殖能力并加快骨細胞的衰亡,但Nrf2磷酸化后與Keap1解離并發(fā)生核易位,與抗氧化反應元件(antioxidant response elementt,ARE)在核內(nèi)相結合,誘導下游血紅素氧合酶(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化還原酶-1(NADH-oxidoreductase-1,NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化酶表達,極大地抑制了氧化應激[36]。HO-1則被認為是促進Nrf2抗氧化和抗炎的重要媒介[37]。這些內(nèi)源性保護物質(zhì)由酶降解物構成,具有促進機體抗炎及抑制氧化的能力[38-39],從而抑制ROS對細胞的刺激,進而抑制ROS減弱成骨細胞形成的能力。

Wang等[40]發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷促進了細胞質(zhì)Nrf2向細胞核的易位,并在體外增加了HO-1和NQO1的蛋白表達,表明了桃葉珊瑚苷改善了由氧化應激引起的成骨抑制,從而表明桃葉珊瑚苷改善氧化應激是通過Nrf2介導的信號通路實現(xiàn)的。Xiao等[41]發(fā)現(xiàn)京尼平苷可以觸發(fā)Nrf2信號的表達,通過激活MC3T3-E1細胞中的Nrf2表達來改善地塞米松誘導的雌激素受體應激和線粒體凋亡,從而達到抗OP的作用。由此可見,地黃及其活性成分可以通過調(diào)控Keap1/Nrf2通路來逆轉(zhuǎn)氧化應激引起的損傷及對成骨細胞的抑制。近年來,氧化應激被作為導致OP的重要因素,被越來越多的學者所關注,但目前相關文獻還有所欠缺,對其作用機制的研究還不夠深入,因此后續(xù)還需要研究者進一步借助不同學科的方法,多方面的從分子層面深入研究其作用機理(圖4)。

圖4 地黃及其活性單體介導Keap1/Nrf2通路抗OP的作用機制Fig.4 Mechanism of Rehmannia glutinosa Libosch and its active monomers mediating Keap1/Nrf2 pathway against osteoporosis

3 小結和展望

目前有關地黃防治OP的研究大多圍繞在單一成分展開,但是中醫(yī)治療具有多層次、多系統(tǒng)的特點,因此本文通過總結近年來地黃及其活性單體在防治OP領域的相關研究,系統(tǒng)的探討地黃及其活性單體防治OP作用機理,并通過總結發(fā)現(xiàn)其對成骨細胞的作用主要是通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路、BMP/smads通路及PI3K/Akt/mTOR通路實現(xiàn)的。以上三個通路均可以調(diào)控其靶點,從而促進RUNX2等成骨因子的轉(zhuǎn)錄表達,最終起到防治OP的作用。而在破骨細胞方面地黃通過調(diào)控OPG/RANKL/RANK以及PI3K/Akt/c-Fos通路,實現(xiàn)了對破骨細胞的抑制,進而減少了骨吸收。此外地黃可以通過Keap1/Nrf2通路調(diào)控氧化活性,清除ROS,從而減少氧化應激對成骨細胞的抑制,調(diào)控骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

本文在總結過往文獻時發(fā)現(xiàn)PTEN作為一種多功能分子,表達于各種類型的細胞中,調(diào)節(jié)多種細胞過程,其常常被認為是一種重要的抑癌因子,但近幾年有研究表明,PTEN可以通過對RANKL誘導的Akt和NF-κB信號的負性調(diào)節(jié)來抑制RAW264.7細胞中RANKL誘導的破骨細胞的形成,起到抗OP的作用[42]。有研究表明,葛根素可以通過PI3K/Akt通路上調(diào)PTEN的表達,從而下調(diào)p-Akt蛋白的激活,進而抑制破骨細胞活性[43]。由此可見,除了地黃以外,還有許多潛在的活性成分可以通過該機制治療OP。因此開展更多活性成分通過干預PTEN治療OP的研究可以為調(diào)控相關通路治療OP的作用靶點提供新的依據(jù),而且可以挖掘出更多治療OP的活性成分,為防治OP提供更多的選擇。此外,地黃活性成分的研究主要集中在環(huán)烯醚萜苷類及苯乙醇苷類。但對其他類別研究較少,這極大地限制了地黃及其活性成分的開發(fā)與利用,研究者可以展開更細致的研究,這或許可以促進地黃防治OP作用機制的綜合理解。

綜上所述,本文總結和探討了地黃及其活性成分抗OP作用和調(diào)控機制,有助于提高對地黃及其活性成分藥理作用的認識,可以促進其藥理研究,進而加快制劑研發(fā),成為臨床防治OP的新策略。