周芷伊 趙 莉 王衡新 蔣飛榮 舒長(zhǎng)宏 鄧姣梅 潘任桃 鄧友田

1.天地恒一制藥股份有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410331；2.湖南安生美藥物研究院有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410000

活絡(luò)消痛膠囊是由刺五加浸膏、威靈仙、當(dāng)歸、制川烏、制草烏等10 味藥材組成的傳統(tǒng)中藥制劑，具有通經(jīng)活絡(luò)、舒筋止痛的功效。用于風(fēng)寒濕痹，經(jīng)絡(luò)閉塞，筋骨疼痛，四肢麻木。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，活絡(luò)消痛膠囊治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）具有較好的臨床療效[1-3]，此外，還可用于治療頸椎病[4]及糖尿病周圍神經(jīng)病變等慢性疾病[5]。

KOA 具有發(fā)病率高、病程長(zhǎng)、階梯性明顯、對(duì)生活質(zhì)量影響大等特點(diǎn)[6-9]?；罱j(luò)消痛膠囊治療此類疾病需長(zhǎng)期反復(fù)用藥，但其安全性數(shù)據(jù)暫無(wú)報(bào)道，無(wú)法確認(rèn)長(zhǎng)期用藥對(duì)身體造成的影響，大多中成藥目前仍存在安全性信息尚不明確的問題，這在一定程度上影響了其療效與安全性[10-11]。為初步探討其臨床用藥安全性，本研究開展活絡(luò)消痛膠囊單次給藥和6 個(gè)月重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)研究，判斷藥物的蓄積毒性反應(yīng)、劑量毒性效應(yīng)關(guān)系、毒性靶器官及可逆性，推測(cè)重復(fù)用藥的安全劑量范圍，提示臨床試驗(yàn)中需重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的指標(biāo)，以便為臨床長(zhǎng)期用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

ME1002E 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、DF50Vet 型動(dòng)物用五分類血液細(xì)胞分析儀（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司）、BS-430 型全自動(dòng)生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）、K-Lite6B 型電解質(zhì)分析儀（梅州康立高科技有限公司）、C3100 型全自動(dòng)凝血分析儀（北京普利生儀器有限公司）、URIT-150Vet 型動(dòng)物尿液分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司）、ECLIPSECi-L 型尼康生物正置顯微鏡（NIKON）、ImageViewDS-1600 型成像系統(tǒng)（杭州圖譜光電科技有限公司）

1.2 藥品與試劑

活絡(luò)消痛膠囊（天地恒一制藥股份有限公司，批號(hào)：201401），臨床擬用劑量：一次4 粒，一日3 次，0.35 g/粒，4.20 g 內(nèi)容物/d，每0.35 g 膠囊內(nèi)容物相當(dāng)于0.66 g 生藥，成人日服生藥量為7.92 g 生藥/d。

異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)：1902801）、血細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)㎜YF-1（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2021022201）、血細(xì)胞分析用稀釋液（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2021090401）、血細(xì)胞分析儀用質(zhì)控物（深圳市帝邁生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BC1121）、質(zhì)控血清（RANDOX，批號(hào)：1396UN）、電解質(zhì)測(cè)定試劑（梅州康立高科技有限公司，批號(hào)：DE21060001）、電解質(zhì)質(zhì)控品（梅州康立高科技有限公司，批號(hào)：L21020001）、UQ 尿質(zhì)控液（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司，批號(hào)：55210100）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠40 只，SPF 級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量181.50 ～207.40 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.430727211100809045，倫理審查編號(hào)：IACUC-2021CY2016ATS2；SD 大鼠160 只，SPF 級(jí)，體重：180.20 ～219.90 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.430727211100865621，倫理審查編號(hào)：IACUC-2021CY2017CTS2。二者生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2018-0004。購(gòu)入后檢疫適應(yīng)環(huán)境5 ～6 d，對(duì)動(dòng)物外觀健康、臨床癥狀等情況觀察，各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到試驗(yàn)要求，經(jīng)湖南安生美藥物研究院有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理（倫理）委員會(huì)審查、批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.4 方法

1.4.1 急性毒性試驗(yàn) 采用最大給藥量法，選用SD 大鼠，40 只，雌雄各半，體重181.50 ～207.40 g，按體重性別區(qū)段隨機(jī)分為空白對(duì)照組、活絡(luò)消痛膠囊組，每組各20 只。受試物最大濃度為0.40 g 內(nèi)容物/ml，最大給藥量30.20 g 生藥/kg，相當(dāng)于人臨床擬用劑量267 倍。受試物與去離子水按20 ml/kg分別經(jīng)口灌胃，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h 以上，給藥當(dāng)日給藥2 次（兩次給藥間隔約6 h，兩次給藥間禁食不禁水）。給藥當(dāng)天密切觀察并記錄各組大鼠的中毒表現(xiàn)和特點(diǎn)、毒性反應(yīng)出現(xiàn)及恢復(fù)時(shí)間以及死亡情況等，然后每天觀察2 次（上、下午各1 次），連續(xù)觀察14 d 動(dòng)物臨床癥狀。分別于給藥當(dāng)日給藥前及給藥后第4、7、10、14 天對(duì)大鼠體重進(jìn)行稱量，第15 天解剖大鼠，進(jìn)行大體觀察。

1.4.2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn) 選用檢疫合格的SD 大鼠160 只，體重180.20 ～219.90 g，雌雄各半，按體重采用區(qū)段隨機(jī)分為空白對(duì)照組及活絡(luò)消痛膠囊低、中、高劑量組，每組各40 只。本品臨床擬用劑量為4.20 g 內(nèi)容物/ d，成人按平均體重70 kg 計(jì)。活絡(luò)消痛膠囊高、中、低三個(gè)劑量組（11.30、5.70、2.80 g 生藥/kg）分別約相當(dāng)于人日服用劑量的100、50、25 倍，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（去離子水），給藥體積均為15 ml/kg，每天1 次，每周7 d，連續(xù)26 周，恢復(fù)期停藥觀察4 周。給藥3 個(gè)月、停藥4 周按計(jì)劃各組分別解剖10 只大鼠，雌雄各半。給藥6 個(gè)月，按計(jì)劃各組分別解剖20 只大鼠，雌雄各半。檢查項(xiàng)目包括：一般臨床觀察；體重、攝食量測(cè)定；眼科檢查；尿液檢查；血液學(xué)、血液生化、電解質(zhì)、凝血及臟器系數(shù)測(cè)定；組織病理學(xué)檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較滿足正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性時(shí)采用Mann-Whitney Test，系統(tǒng)解剖及組織病理學(xué)采用定性指標(biāo)判斷結(jié)果。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜ 0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

給藥后連續(xù)觀察14 d，空白對(duì)照組和活絡(luò)消痛膠囊組大鼠自主活動(dòng)、精神狀態(tài)和飲食情況均未見明顯異常，未見相關(guān)毒性反應(yīng)及動(dòng)物死亡，大體解剖肉眼觀察各器官均未見明顯異常情況。給藥后14 d 內(nèi)稱重，活絡(luò)消痛膠囊組與同期空白對(duì)照組動(dòng)物體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見表1。

表1 急性毒性試驗(yàn)中大鼠體重變化情況比較（g，）

表1 急性毒性試驗(yàn)中大鼠體重變化情況比較（g，）

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2.2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

2.2.1 活絡(luò)消痛膠囊對(duì)一般狀況的影響 給藥期和恢復(fù)期觀察期間，活絡(luò)消痛膠囊各劑量組與同期空白對(duì)照組比較，動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)及動(dòng)物的一般狀況等未出現(xiàn)與藥物毒性相關(guān)的異常。

2.2.2 活絡(luò)消痛膠囊對(duì)體重的影響 試驗(yàn)期間活絡(luò)消痛膠囊各劑量組與同期空白對(duì)照組比較，高劑量組雄性大鼠的體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但經(jīng)4 周停藥觀察期可恢復(fù)。見表2。

表2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中大鼠體重變化情況比較（g，）

表2 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中大鼠體重變化情況比較（g，）

注 與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.3 活絡(luò)消痛膠囊對(duì)尿液指標(biāo)的影響 活絡(luò)消痛膠囊給藥6 個(gè)月，與空白對(duì)照組比較中劑量組隱血賦值及高劑量組尿比重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但無(wú)明顯的量效關(guān)系，見表3。

表3 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠尿液指標(biāo)的影響（）

表3 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠尿液指標(biāo)的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，aaP ＜ 0.01；“-”為陰性

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2.2.4 活絡(luò)消痛膠囊對(duì)血常規(guī)、生化指標(biāo)、電解質(zhì)、凝血指標(biāo)的影響 活絡(luò)消痛膠囊各劑量組血常規(guī)指標(biāo)血小板計(jì)數(shù)、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、嗜堿性細(xì)胞比例與同期空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但無(wú)明顯的劑量、時(shí)間關(guān)系。生化指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、三酰甘油（triglycerides，TG）、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、葡萄糖（glucose，GLU）等與同期空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05 或P＜ 0.01），但無(wú)明顯量效關(guān)系。電解質(zhì)鈉、鉀、氯與同期空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。凝血指標(biāo)中活化部分凝血活酶時(shí)間和血漿凝血酶時(shí)間與同期空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但無(wú)明顯的劑量、時(shí)間關(guān)系，見表4 ～6。

表4 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠血常規(guī)的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05

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表5 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01；ALT-天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALP：堿性磷酸酶；GGT-γ：谷氨?；D(zhuǎn)移酶；BUN：尿素氮；GLU：葡萄糖；TG：三酰甘油；TBIL：總膽紅素

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表6 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠對(duì)電解質(zhì)及凝血指標(biāo)的影響（）

表6 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠對(duì)電解質(zhì)及凝血指標(biāo)的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05

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2.2.5 活絡(luò)消痛膠囊對(duì)眼科及臟器系數(shù)的影響 試驗(yàn)期間活絡(luò)消痛膠囊各劑量組及空白對(duì)照組眼科檢查未見明顯異常。與同期空白對(duì)照組比較，中、高劑量組部分臟器系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05或P＜ 0.01），雌性動(dòng)物給藥6 個(gè)月中、高劑量組及雄性動(dòng)物高劑量組給藥3 個(gè)月、給藥6 個(gè)月肝臟臟器系數(shù)異常顯示與時(shí)間、劑量有一定相關(guān)性，但停藥4 周恢復(fù)正常，見表7。

表7 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠尿臟器系數(shù)的影響（）

表7 長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中活絡(luò)消痛膠囊對(duì)大鼠尿臟器系數(shù)的影響（）

注 與空白對(duì)照組比較，aP ＜ 0.05，aaP ＜ 0.01

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2.2.6 大體解剖和病理檢查 大體觀察給藥3 個(gè)月、給藥6 個(gè)月和停藥4 周各組解剖的動(dòng)物臟器顏色、大小、質(zhì)地均未見明顯病理改變；顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)肝臟、心臟及腎上腺等臟器可見組織病理學(xué)改變，但活絡(luò)消痛膠囊高劑量組與空白對(duì)照組比較，病變類型及病變動(dòng)物數(shù)量、病變程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖1。

圖1 HLXT 對(duì)SD 大鼠肝臟組織病理學(xué)圖像示例（HE 染色，×200）

3 討論

活絡(luò)消痛膠囊為已上市多年中藥復(fù)方制劑，臨床多用于骨關(guān)節(jié)炎、頸椎病等慢性疾病[1-5]，需長(zhǎng)期反復(fù)用藥，由當(dāng)歸、制川烏、制草烏等10 味藥材組成，制川烏、制草烏均為有毒藥材，毒性靶器官主要是心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[12-15]。為保證用藥安全，本研究按照《藥物單次給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[16]《藥物重復(fù)給藥毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[17]對(duì)活絡(luò)消痛膠囊的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，闡明藥物的毒性作用、了解其毒性靶器官及重復(fù)接受藥物后的毒性特征，為上市后藥品提供安全性評(píng)價(jià)依據(jù)。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠以最大給藥量經(jīng)口灌服活絡(luò)消痛膠囊，給藥累積劑量為30.20 g 生藥/kg（臨床給藥劑量的267 倍），動(dòng)物未見相關(guān)毒性反應(yīng)及死亡，表明活絡(luò)消痛膠囊無(wú)急性毒性。長(zhǎng)期給藥毒性試驗(yàn)中，最大給藥劑量11.30 g 生藥/kg（臨床給藥劑量的100 倍），給藥6 個(gè)月，動(dòng)物的外觀體征、行為活動(dòng)及一般狀況等均良好無(wú)異常。與對(duì)照組比較，活絡(luò)消痛膠囊高劑量組雄性動(dòng)物體重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但經(jīng)停藥4 周可恢復(fù)，綜合其他各檢測(cè)指標(biāo)分析，造成因素可能是給予高濃度藥液，造成攝食量減少所致。活絡(luò)消痛膠囊組與同期空白對(duì)照組比較對(duì)部分血常規(guī)、生化指標(biāo)、電解質(zhì)、凝血指標(biāo)及尿液指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），但無(wú)明顯的劑量、時(shí)間關(guān)系，故認(rèn)為該變化無(wú)毒理學(xué)意義。與同期空白對(duì)照組比較，活絡(luò)消痛膠囊雌性動(dòng)物給藥6 個(gè)月中、高劑量組及雄性動(dòng)物高劑量組給藥3個(gè)月、給藥6 個(gè)月肝臟臟器系數(shù)異常，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），且顯示與時(shí)間劑量有一定相關(guān)性，但停藥4 周恢復(fù)正常，結(jié)合解剖時(shí)大體觀察、病理檢查和血液生化檢查結(jié)果分析，未見明顯異常，故認(rèn)為該差異無(wú)毒理學(xué)意義。大體解剖觀察結(jié)果和病理檢查各組別動(dòng)物臟器均未見明顯異常，未發(fā)現(xiàn)活絡(luò)消痛膠囊對(duì)SD 大鼠有明顯的毒性作用。

綜上所述，活絡(luò)消痛膠囊無(wú)急性毒性及長(zhǎng)期毒性，藥物的最大耐受量（maximal tolerance dose，MTD）≥30.2 g 生藥/kg，相當(dāng)于人日服用劑量的267 倍；未觀察到臨床不良反應(yīng)的劑量水平（no observed adverse effect level，NOAEL）為11.3 g 生藥/kg，相當(dāng)于人日服用劑量的100 倍，在治療劑量范圍內(nèi)用藥安全性高，長(zhǎng)期重復(fù)服用無(wú)蓄積毒性，安全性風(fēng)險(xiǎn)低。