范文欣 劉秋艷 陳 甜 王一淇 王海凌 王曉立

（宿遷學(xué)院建筑工程學(xué)院園林教研室，江蘇 宿遷 223800）

毛果楊（Populus trichocarpa）為楊柳科半常綠喬木，具有易繁殖、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，是木本植物研究的模式生物。轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)能夠與DNA 序列特異性結(jié)合[1]，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝反應(yīng)和抗逆反應(yīng)等多種過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。RAV 屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)亞家族，僅在植物中存在，對(duì)植物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程有重要意義。RAV 蛋白同時(shí)含有B3 保守域和AP2 保守域[3]，其中B3 保守域能特異地與靶序列CACCTG 結(jié)合，處于蛋白C 端；處于蛋白N 端的AP2 結(jié)構(gòu)域則與GCC 盒結(jié)合密切相關(guān)。相關(guān)學(xué)者已在多個(gè)植物中對(duì)RAV 家族進(jìn)行了全基因組分析：荔枝[4]（Litchi chinensis）和杧果[5]（Mangifera indica）中鑒定得到4 個(gè)RAV 轉(zhuǎn)錄因子；新疆沙冬青[6]（Ammopiptanthus mongolicus）、鉆天柳[7]（Chosenia arbutifolia）、二倍體棉花[8]（Gossypium australe）和龍眼[9]（Dimocarpus longan）中的RAV 成員數(shù)量分別是2、4、10和4個(gè)；在擬南芥中[10]鑒定有13個(gè)RAV基因，其中有6個(gè)具有AP2結(jié)構(gòu)域，其他則只具有B3 結(jié)構(gòu)域?？梢?jiàn)不同物種之間RAV 基因家族數(shù)量和具有AP2結(jié)構(gòu)域的基因數(shù)量有一定的變化。

RAV 轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還參與植物對(duì)外界的脅迫反應(yīng)，同時(shí)還在抗病性中發(fā)揮重要作用。RAV 同源蛋白在植物中是一個(gè)龐大的蛋白家族，其調(diào)節(jié)生物學(xué)功能的分子機(jī)制和功能多樣性還需進(jìn)一步研究和證明。RAV 同源蛋白在毛果楊植物中研究尚不多見(jiàn)。目前，有關(guān)毛果楊RAV 家族的相關(guān)報(bào)道較少。本研究對(duì)毛果楊RAV 同源蛋白進(jìn)行鑒定，分析蛋白結(jié)構(gòu)特征，為RAV 同源蛋白功能的解析、植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為后期分子輔助育種和生物技術(shù)工具提供依據(jù)，從而培育出達(dá)到經(jīng)濟(jì)目的的優(yōu)良品種。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

通過(guò)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https∶//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）檢索“RAV”，查找并獲得毛果楊RAV基因序列。

1.2 分析方法

1.2.1 RAV 蛋白基因的搜索與確認(rèn)RAV蛋白的同源序列在毛果楊基因組中作為候選蛋白，然后對(duì)所有候選基因的候選蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在線分析預(yù)測(cè)位點(diǎn)上的PFAM 和SMART 蛋白結(jié)構(gòu)域分析。得到的基因是毛果楊的RAV 基因家族的全部成員。

1.2.2 毛果楊RAV 基因家族結(jié)構(gòu)分析毛果楊基因家族成員結(jié)構(gòu)分析：基因名稱，基因序列大小，編碼序列大小等信息。

1.2.3 毛果楊RAV 基因家族理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞定位利用Expasy 的ProtParam 軟件（HTTPS：/Web.Expasy.org/ProtParam/)分析RAV 基因家族成員的物理和化學(xué)特性。毛果楊RAV 基因家族成員的亞細(xì)胞定位是通過(guò)在線軟件Plant-MPloc 進(jìn)行預(yù)測(cè)的。

1.2.4 motif 結(jié)構(gòu)對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建通過(guò)MEME Suite 5.5.1（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行基序結(jié)構(gòu)分析，使用MEGA 7.0軟件為毛果楊、甜橙、番茄、擬南芥和黃瓜等的RAV基因家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 毛果楊RAV 基因家族器官組織的基因表達(dá)在Affymetrix 網(wǎng)站上搜索RAV 基因家族成員的探針，并通過(guò)BAR 數(shù)據(jù)庫(kù)（bar.Utoronto）檢索成員的組織表達(dá)的相對(duì)量。運(yùn)用聚類(lèi)熱圖軟件Multiple Experiment Viewer 繪制RAV 基因家族組織表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛果楊RAV家族的鑒定

在Phytozome中以“RAV”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，選取6個(gè)毛果楊基因序列，6個(gè)基因的蛋白氨基酸數(shù)長(zhǎng)度在369～2 556，Potri.002G173300.1 蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)比較大，在2556。在Expasy（Expasy ProtParam tool）數(shù)據(jù)庫(kù)中可以看出，Potri.002G173300.1 蛋白質(zhì)為酸性蛋白，理論等電點(diǎn)為6.2；其余成員均為堿性蛋白（理論等電點(diǎn)均大于7）。6 個(gè)基因的蛋白相對(duì)分子量在42 725.38～281 004.09，Da，Potri.002G1733 00.1 蛋白質(zhì)相對(duì)分子量最大。6 個(gè)基因的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)在42.76～78.05。毛果楊RAV 基因平均親水系數(shù)在-0.378 與-0.723，Potri.002G173300.1 蛋白質(zhì)親水系數(shù)較大在-0.073，均為親水性蛋白。毛果楊RAV 基因編碼的蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，只有Potri.002G173300.1的蛋白質(zhì)定位預(yù)測(cè)在葉綠體或細(xì)胞核中出現(xiàn)。毛果楊RAV 基因家族的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位如表1所示。

表1 毛果楊RAV基因家族的理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

2.2 毛果楊RAV氨基酸序列比對(duì)在線分析

利用MEGA5軟件，對(duì)6個(gè)毛果楊的氨基酸序列進(jìn)行在線分析（圖1）。標(biāo)星號(hào)序列標(biāo)注的同源性更高，呈現(xiàn)高度保守的特征。

圖1 毛果楊RAV基因家族氨基酸序列比對(duì)

2.3 毛果楊RAV系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

為更好地了解毛果楊RAV基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將毛果楊（6個(gè)），甜橙（orange1.1 g 046898m、orange1.1g018549m、orange1.1g017035m），番茄（Solyc05 g 009790.1、Solyc03g083110.1、Solyc04g007000.2），擬南芥（AT1G50680、AT1G51120、AT1G25560），黃瓜（Cucsa.142990、Cucsa.147340）RAV基因編碼的蛋白質(zhì)序列通過(guò)MEGA7 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列分析，并構(gòu)建6 個(gè)毛果楊與其他物種植物RAV 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），將RAV 基因家族分成4 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的亞族。亞族III 僅含一個(gè)番茄成員Solcy03g083110.1；亞族IV 僅含一個(gè)毛果楊成員Potri.002G173300；這兩個(gè)亞族可能是在番茄、毛果楊中獨(dú)自進(jìn)化的結(jié)果，也可能是其他相關(guān)物種中發(fā)生了基因丟失現(xiàn)象。亞族I中基因數(shù)目最多，含8個(gè)基因，來(lái)自毛果楊、甜橙、擬南芥和黃瓜4 個(gè)物種，Potri.006G186301.1 與Potri.018G109201.1 在同一分支點(diǎn)上，與Potri.003G212800.1有一定差異性；亞族II中包含7個(gè)基因，由來(lái)自毛果楊、甜橙、番茄、擬南芥和黃瓜5 個(gè)物種的RAV 成員構(gòu)成，Potri.010G12920 0.1與Potri.008G117100.1在同一分支點(diǎn)上。

圖2 RAV基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 毛果楊RAV motif分析

選用6 個(gè)毛果楊RAV 基因家族成員，發(fā)現(xiàn)毛果楊RAV 基因的序列長(zhǎng)度差異不大。從毛果楊RAV家族蛋白motif 分析可以看出（圖3），Potri.002G173300 基因較其他RAV 家族蛋白的氨基酸數(shù)量差距都比較大，且只有1個(gè)相同的蛋白質(zhì)基序，這也同RAV基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中Potri. 002G173300基因單獨(dú)被列為一支一致。其余RAV 基因家族蛋白與擬南芥AT1G25560、AT1G50680 具有類(lèi)似的motif 結(jié)構(gòu)，總體上看PtRAV 具有比較保守的基因序列。

2.5 毛果楊RAV基因家族表達(dá)分析

選用5個(gè)毛果楊RAV基因家族成員（Potri.003G 212800.1未查詢到相應(yīng)探針），通過(guò)BAR數(shù)據(jù)庫(kù)檢索RAV基因家族成員組織表達(dá)的相對(duì)量（圖4）。所選用的5個(gè)不同的毛果楊RAV基因家族成員在發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)存在明顯的差異，其在根、莖、幼葉、成熟葉、雄蕊、雌蕊和頂芽中均有表達(dá)，毛果楊RAV基因在頂芽中整體表達(dá)量較高，Potri.008G117100最高達(dá)132.18，在根、莖與幼葉中基因表達(dá)量次之，在雄蕊和成熟葉中基因表達(dá)量較少，雌蕊中基因表達(dá)量最低，Potri.006G186301 基因在雌蕊中不表達(dá)，這說(shuō)明該基因同源蛋白為不穩(wěn)定蛋白。除此之外，在5 個(gè)家族成員序列中，Potri.008G117100和Potri.010G129 200基因表達(dá)相近，Potri.002G173300和Potri.008G11 7100、Potri.010G129200 基因表達(dá)有一定差異性，Potri.018G109201 差異性最大，Potri.018G109201 主要在葉片中表達(dá)量最高。因此，可推測(cè)，毛果楊RAV 家族蛋白不僅具有多樣性，與親緣關(guān)系較近的蛋白還具有相似或相近的基因表達(dá)。

圖4 毛果楊RAV基因家族組織表達(dá)

3 結(jié)論與討論

RAV 是AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員，在生物與非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，但對(duì)其在楊樹(shù)中的功能探討較為有限[11]。RAV基因不僅參與植物的一系列生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，并且還參與植物對(duì)外界的脅迫反應(yīng)，在抗病方面也發(fā)揮著重要作用。RAV 家族是AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族中一個(gè)重要的亞家族，僅存在于植物中，對(duì)植物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程都具有重要意義[12]。RAV轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，還參與植物對(duì)外界的脅迫反應(yīng)，同時(shí)還在抗病性中發(fā)揮重要作用。水稻OsRAV11 和Os-RAV12 可能對(duì)水稻種子的大小和心皮分化過(guò)程起調(diào)控作用[13]。Cao 等[6]在煙草上的研究發(fā)現(xiàn)，NtRAV-4 被沉默后，種子萌芽和根系發(fā)育的速度變快，且葉片光合能力增強(qiáng)；下調(diào)NtRAV-4 后煙草植株的抗旱性增強(qiáng)。

經(jīng)分析，毛果楊中一共獲得6 個(gè)PtRAV 基因。PtRAV 蛋白序列長(zhǎng)度和分子質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，而等電點(diǎn)等性質(zhì)差異較大，這與相關(guān)學(xué)者對(duì)煙草的研究結(jié)果相似[14]。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，PtRAV 均定位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，這與其他植物中如杧果和苦蕎等的結(jié)果相似[6,15]，推測(cè)PtRAV主要在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用。通過(guò)對(duì)擬南芥、番茄、甜橙等RAV蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，LcRAV聚集在第I、II和IV 3個(gè)亞族。同一亞族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的位置、保守基序的種類(lèi)和位置趨向一致，并且不同植物RAV之間至少存在5個(gè)共同的保守基序，分別是motif 1、motif 3和motif 2（5′→3′），同時(shí)motif 1 和motif 2/3 可能分別是AP2 結(jié)構(gòu)域和B3結(jié)構(gòu)域的主要組成部分，這與Ji 等[16]的研究結(jié)果一致，也說(shuō)明了RAV家族具有較高的保守性。毛果楊RAV 家族蛋白不僅具有多樣性，對(duì)于親緣關(guān)系較近的蛋白，它們還具有相似或相近的生物學(xué)功能和理化性質(zhì)。

本研究基于毛果楊全基因組分析，鑒定出6 個(gè)RAV基因家族成員，系統(tǒng)分析了毛果楊RAV同源蛋白的基本結(jié)構(gòu)信息、進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)分析等信息，為克隆毛果楊RAV同源蛋白提供信息，并為RAV 同源蛋白功能的解析、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及為植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆中的作用研究提供一定的參考。對(duì)于亞細(xì)胞定位等相關(guān)預(yù)測(cè)結(jié)果仍需要試驗(yàn)驗(yàn)證，涉及的代謝通路等將是后續(xù)研究的主要內(nèi)容。