趙繼秀，馬 祥，琚澤亮，劉凱強，何紀桐，馬小龍，賈志鋒

（青海大學畜牧獸醫(yī)科學院, 青海 西寧 810016）

氮素是植物生長過程中必需的營養(yǎng)元素之一[1]，加大氮肥投入普遍成為人們發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要方法[2-3]。隨著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴大，國內(nèi)化肥施用量也在逐年增加，而作物真正能夠利用的氮肥只有少部分，絕大部分氮肥依舊存留在土壤中，并隨著水土流失進入江河湖海[4]，進而引發(fā)土壤酸化、溫室效應和水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題[5-6]。這一環(huán)境代價已經(jīng)被廣泛關注，學者們相繼嘗試在不影響作物產(chǎn)量的情況下，適當減少氮肥用量，這一措施在小麥(Triticum aestivum)[7]、玉米(Zea mays)[8]、水稻(Oryza sativa)[9]等作物上取得了一定的成效，但上述研究為僅1 年田間試驗結果。宮亮等[10]長期定位減施氮肥對水稻(Oryza sativa)產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)長期減氮，水稻產(chǎn)量存在下降的風險。對此，研究者考慮從作物自身的基因型出發(fā)，篩選耐低氮種質(zhì)，在最大程度上節(jié)約資源，實現(xiàn)氮高效利用。

篩選耐低氮種質(zhì)是作物耐低氮育種工作的前提，而耐低氮種質(zhì)的確定離不開適宜的篩選指標[11]。目前，已在玉米、棉花(Gossypium hirsutum)、谷子(Setaria italica)、小麥等作物上開展有關耐低氮性的研究。李強等[12]以葉面積、地上部干重和根體積等7 個性狀作為評價玉米苗期耐低氮能力的指標，并篩選出了2 個耐低氮品種。王準等[13]以總干物質(zhì)質(zhì)量、地上部干物質(zhì)質(zhì)量和根干物質(zhì)質(zhì)量等6 個性狀作為棉花苗期氮效率評價指標，篩選出了2 個耐低氮品種。連盈等[11]以植株苗高、生物量、氮累積量和SPAD 值(soil and plant analyzer develotrnent)等為篩選指標，選出3 個耐低氮谷子品種。李俊杰等[14]以小麥幼苗生長發(fā)育性狀以及根系形態(tài)篩選出了5 份耐低氮型小麥。以上研究表明不同作物低氮耐受性的評價指標不同。

目前有關燕麥(Avena sativa)耐低氮性的研究較少。苗玉紅等[15]采用土壤盆栽法探索了24 個燕麥品種在常規(guī)氮和低氮條件下的生長特性，并通過成熟期的生物量和氮積累量指標篩選出了4 份耐低氮品種。然而采用土培法篩選耐低氮種質(zhì)存在一定的局限性，如土壤環(huán)境復雜，存在肥力不均、難以準確控制氮素、試驗重復性差等問題[16-17]。水培試驗能夠避免以上問題[18]，不足之處在于水培法只能觀測作物苗期的生長狀況，不利于進行整個生育期的探索。但有研究表明，作物苗期的耐低氮性在一定程度上能夠代表其成熟期的耐低氮性[18-19]。因此，本研究采用苗期水培方法，設置低氮脅迫和常規(guī)氮兩個處理，分析燕麥幼苗農(nóng)藝性狀以及根系形態(tài)指標對氮素的響應，篩選不同耐低氮性燕麥種質(zhì)材料，明確評價燕麥耐低氮能力的指標，旨在為燕麥耐低氮育種工作提供材料，為燕麥耐低氮脅迫分子生理機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2020 年種植來自中國農(nóng)業(yè)科學院的139 份燕麥種質(zhì)資源，通過對考種指標的篩選和聚類分析，初步得出了19 份表現(xiàn)較好的材料，包括7 份裸燕麥：ZY000090、ZY000150、ZY000304、ZY004071、ZY004080、ZY004085、ZY004093 ，12 份 皮 燕 麥：ZY003178、ZY004058、ZY004066、ZY004067、ZY004068、ZY004070、ZY004101、ZY004104、ZY004105、ZY004106、ZY004108和ZY004109。為探究上述田間表現(xiàn)良好的19 份燕麥材料是否同時具備耐低氮能力，試驗將對其開展耐低氮性研究。

1.2 試驗設計

1.2.1 初篩試驗

燕麥種子用2% NaClO 溶液消毒10 min，用蒸餾水沖洗干凈，放至濕潤濾紙待其發(fā)芽。6 d 后，挑選長勢一致的燕麥幼苗，用海綿條包裹采用漂浮育苗方式，移入打孔的泡沫板中，每塊泡沫板平均分布24 個孔(4 × 6)，每孔種植1 株燕麥苗。試驗溫度控制在20～25 ℃，晝夜16 h/8 h 給予光照，每間隔1 h使用充氣泵通氣培養(yǎng)，每5 d 更換一次營養(yǎng)液。每份種質(zhì)在各處理下設3 組重復。幼苗在裝有蒸餾水的水培箱中培養(yǎng)2 d 后進行營養(yǎng)液處理，12 d 后取樣并測定生物量。營養(yǎng)液配方參考Khan 等[20]的方法，設常 規(guī) 氮(2 mmol·L-1NH4NO3) 和 低 氮(0.2 mmol·L-1NH4NO3) 2 個處理。正常營養(yǎng)液配方如表1 所列。

表1 常規(guī)營養(yǎng)液配方Table 1 Formula of normal nutrient solution

1.2.2 復篩試驗

將常規(guī)和低氮處理時間延長為18 d，其余試驗方法與步驟同初篩試驗。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 株高與葉綠素含量

復篩時，每個重復選取3 株燕麥幼苗，使用便攜式葉綠素儀(SPAD-502)測定燕麥幼苗頂端第二片完全展開葉的SPAD 值；使用直尺測量幼苗株高。

1.3.2 生物量

初篩時，每個重復選取3 株燕麥幼苗，并將其從水培箱完整取出，將莖葉和根分開裝在信封袋中，在105 ℃烘箱中殺青30 min，調(diào)至60 ℃烘干至恒重，并稱重，獲得莖葉干重和根干重，計算植株干重。復篩時，按照初篩時的方法稱量每份種質(zhì)的莖葉干重和根干重，并計算植株干重與根冠比。

植株干重 = 莖葉干重 + 根干重；

根冠比 = 莖葉干重/根干重。

1.3.3 根系形態(tài)參數(shù)

復篩時，每個重復選取3 株燕麥幼苗，將根系從幼苗分離，用蒸餾水沖洗干凈，放入透明根盤中，將側(cè)根逐一分開，用WinRHIZO 根系分析系統(tǒng)獲取根體積、根表面積和根直徑和根尖數(shù)，并用直尺測量最大根長。

1.4 綜合評價值的計算

式中：Rx表示各性狀的耐低氮系數(shù)；aij為各性狀耐低氮系數(shù)的特征值對應的特征向量，Xij為各性狀耐低氮系數(shù)的標準化值[21]；Xj表示第j個綜合指標，Xjmax和Xjmin分別表示j個綜合指標的最大值和最小值；U(Xj) 表示某材料第j 個綜合指標隸屬函數(shù)值；Wj表示第j個綜合指標的權重，Pj為第j個綜合指標的方差貢獻率[22]；D為綜合評價值。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Excel 2020 對所測數(shù)據(jù)進行整理及相關數(shù)據(jù)的初步計算；使用SPSS 21.0 進行方差分析和主成分分析；通過SPSS 系統(tǒng)聚類分析法繪制樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 不同氮處理下燕麥種質(zhì)生物量差異

燕麥幼苗莖葉干重、根干重和植株干重在兩種氮處理下存在顯著差異(P＜ 0.05) (表2)，莖葉干重和植株干重在常規(guī)氮處理下顯著高于低氮處理，根干重在低氮處理下顯著高于常規(guī)氮處理。不同燕麥種質(zhì)莖葉干重、根干重和植株干重變異系數(shù)在低氮處理條件下分別達到23.102%、21.352%和21.063%，在常規(guī)氮處理條件下分別為20.037%、24.686%和18.162%，表明不同燕麥種質(zhì)的生物量在兩種氮處理下均存在較大差異。

表2 19 份燕麥種質(zhì)在兩種氮水平下苗期生物量差異Table 2 Differences in seedling biomass of 19 oat germplasms under two nitrogen conditions

比較各種質(zhì)耐低氮系數(shù)(表3)，以綜合耐低氮系數(shù)大于1.00 為標準，初步篩選出5 份耐低氮材料ZY003178、ZY004085 、ZY004067 、ZY004068 和ZY004071，以綜合耐低氮系數(shù)小于0.70 為標準，篩選 出5 份 低 氮 敏 感 材 料ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058 和ZY004106。

表3 19 份燕麥種質(zhì)干重耐低氮系數(shù)Table 3 Low nitrogen tolerance coefficient of dry weight of 19 oat germplasms

2.2 不同氮處理下燕麥種質(zhì)各性狀基因型差異

不同氮處理下，燕麥種質(zhì)各性狀的變異系數(shù)都比較大，表明不同種質(zhì)間耐低氮性差異大(表4)。常規(guī)組的變異系數(shù)范圍為10.700%～95.673%，其中以根體積、根表面積、根尖數(shù)、平均直徑和最大根長較大；低氮組的變異系數(shù)范圍為7.314%～60.991%，其中以根體積、根表面積、最大根長、平均直徑和莖葉干重較大。比較耐低氮系數(shù)，各指標變異范圍為8.162%～91.821%，其中以根體積、根表面積、平均直徑、根尖數(shù)和根干重較大。低氮處理后，除植株干重、最大根長和平均直徑，其余各指標均發(fā)生了顯著變化，具體表現(xiàn)為莖葉干重、株高、葉片SPAD值顯著降低，分別較常規(guī)氮處理下降16.296%、11.925%和17.348%；根干重、根冠比、根體積、根表面積和根尖數(shù)顯著增加，分別較常規(guī)氮處理高51.724%、87.383%、57.143%、37.639%和102.507%。

2.3 燕麥耐低氮性綜合評價

2.3.1 燕麥耐低氮性狀的綜合評價

對燕麥各性狀的耐低氮系數(shù)進行主成分分析(表5)，在所選11 個性狀中，前3 個主成分的方差貢獻率分別為42.238%、31.604% 和11.415%，累計達85.257%。第1 主成分主要由植株干重、莖葉干重、根干重和株高決定，系數(shù)分別達0.958、0.925、0.797和0.788，說明此主成分主要反映低氮脅迫下燕麥的生物量變化。第2 主成分中，根體積、根表面積、平均直徑和根尖數(shù)的載荷系數(shù)較大，分別為0.730、0.889、0.746 和0.794，說明此主成分主要反映低氮脅迫下燕麥根系形態(tài)的變化。第3 主成分中根冠比的載荷系數(shù)最大，為0.787，說明該主成分主要反映低氮脅迫下燕麥地上干物質(zhì)和地下干物質(zhì)的分配情況?；谏鲜鲋鞒煞?，分析燕麥各性狀耐低氮系數(shù)與綜合評價值(D) 的相關性(表6) 可知，株高、莖葉干重、根干重、植株干重、根表面積和根尖數(shù)與D 值呈顯著或極顯著正相關；而根體積、根直徑和根冠比與D 值相關性未達顯著水平，所以剔除根體積、根直徑和根冠比3 個性狀。通過方差分析(表4) 可知，植株干重在低氮和常規(guī)氮下差異不顯著，故剔除植株干重。綜上得出，評價燕麥低氮耐受性的最佳性狀為株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)。

表6 燕麥各性狀耐低氮系數(shù)與D 值的相關性Table 6 Correlation of the D-value with low nitrogen tolerance coefficient of oat traits

2.3.2 燕麥耐低氮種質(zhì)的綜合評價

在燕麥各性狀耐低氮系數(shù)的基礎上，通過公式(2) 計算各種質(zhì)3 個主成分的綜合指標值，并對其進行隸屬函數(shù)分析，通過3 個主成分的貢獻率確定權重大小，最后結合隸屬函數(shù)和權重計算各種質(zhì)的D 值。D 值越高，表明其耐低氮能力越強，10 份材料D 值由高到低為ZY004067 ＞ ZY004068 ＞ZY004071 ＞ ZY004106 ＞ ZY004058 ＞ ZY000304 ＞ZY003178 ＞ ZY004093 ＞ ZY004101 ＞ ZY004085 (表7)，其 中ZY004067 和ZY004068 的D 值 高 達0.965 6 和0.913 8，表明二者耐低氮能力極強，ZY004085 的D 值最小，僅為0.272 2，其耐低氮能力差。進一步采用平方歐氏距離法對D 值進行系統(tǒng)聚類，將10 份燕麥材料聚為3 類，分別為耐低氮型、中間型和低氮敏感型(圖1)。耐低氮型材料有2 份，分別為ZY004067和ZY004068；低氮敏感型材料有3 份，ZY004085、ZY004101 和ZY004093；其余為中間型材料。

圖1 10 份燕麥種質(zhì)耐低氮能力的系統(tǒng)聚類圖Figure 1 Dendrogram of 10 oat germplasms based on low nitrogen tolerance

表7 燕麥種質(zhì)的D 值Table 7 The D value of oat germplasms

3 討論

3.1 低氮對燕麥苗期農(nóng)藝性狀的影響

氮素是植物體正常代謝和生長的關鍵因素[23]，氮素的缺乏會導致植物體發(fā)生一系列的變化。植株地上部分的表觀可以直接反映其生長狀況，試驗結果表明，供試燕麥種質(zhì)苗期各性狀在兩種氮水平下差異顯著，在低氮脅迫下，燕麥種質(zhì)的莖葉干重、株高、葉片SPAD 值顯著降低。這與前人研究結果一致[24-25]，說明低氮脅迫對植物幼苗地上部分的生長及葉綠素的合成具有抑制作用。根系在植物適應各種環(huán)境、獲取有效養(yǎng)分和水分過程中具有十分重要的作用[26-27]，氮素通過根系吸收才能進入燕麥體內(nèi)，所以在低氮脅迫下，燕麥根系會首先做出反應。本研究中，低氮脅迫下，大多數(shù)燕麥種質(zhì)的根干重、根冠比、根體積、根表面積和根尖數(shù)顯著增加，這與遠月麗等[28]和汪曉麗等[29]研究結果一致，說明低氮脅迫可以促進植物根部發(fā)育，低氮條件下植物幼苗通過擴增根系來獲取更多的氮素，用于植物的生長發(fā)育[30]，這也是燕麥應對低氮脅迫的一種措施。

3.2 燕麥苗期耐低氮種質(zhì)篩選

耐低氮種質(zhì)的篩選離不開適宜的評價指標。目前，針對作物耐低氮性的評價指標尚未統(tǒng)一，不同作物的評價指標不同。植物對氮素比較敏感，缺氮會導致植物體一系列表型性狀發(fā)生直接或間接的變化[28]。本研究首先將莖葉干重和植株干重這兩個容易測定的表型性狀作為評價燕麥耐低氮能力的初級篩選指標，并篩選出了5 個耐低氮種質(zhì)ZY004085、ZY004067、ZY004068、ZY004071、ZY003178和5 個低氮敏感種質(zhì)ZY004093、ZY000304、ZY004101、ZY004058、ZY004106。眾多研究者通過單一指標(主要是生物量)評價作物的耐低氮能力[31]，然而單項指標并不能準確地反映不同作物品種的耐低氮能力，因此僅用莖葉干重和植株干重來評價燕麥種質(zhì)間耐低氮能力較為片面[11]。為了更加合理地篩選出評價燕麥耐低氮能力的指標，本研究復篩時采用多個相關指標進行綜合評價，通過主成分分析初步得到與氮素含量密切相關的性狀：莖葉干重、植株干重、根干重、株高、根體積、根表面積、平均直徑、根尖數(shù)和根冠比，再通過相關性分析和方差分析去掉相關性較低和差異不顯著的性狀：根體積、根直徑、根冠比和植株干重，最終得出評價燕麥低氮耐受性的適宜指標為株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)。祝令曉等[21]認為，作為低氮耐受性的評價性狀應當具備易獲得性、可靠性、普適性，本研究獲得的評價指標基本滿足以上3 個要素。

不同燕麥基因型對氮素的敏感性存在明顯差異[32]，篩選耐低氮種質(zhì)是挖掘燕麥自身的氮利用潛力，最大限度地發(fā)揮其優(yōu)勢的重要途徑。目前，主成分分析、隸屬函數(shù)和聚類分析是篩選耐低氮種質(zhì)常用的方法[12,22]。為獲得更準確且具有說服力的結果，研究者已將主成分分析和隸屬函數(shù)兩種方法結合[33]，用于篩選耐低氮種質(zhì)。本研究首先基于燕麥種質(zhì)不同性狀的耐低氮系數(shù)，進行主成分分析并在主成分分析結果上運用隸屬函數(shù)法，綜合評價不同燕麥種質(zhì)的耐低氮性。基于隸屬函數(shù)法計算的耐低氮性綜合評價值(D) 將不同基因型燕麥分類。結果表明，ZY004067 和ZY004068 為耐低氮型種質(zhì)，ZY004085、ZY004101 和ZY004093 為氮敏感型種質(zhì)。本研究篩選出了2 份耐低氮種質(zhì)，但此結果僅能說明其在苗期對低氮的耐受力較強，并不能代表成熟期的耐低氮能力。因而，為更確切地評價燕麥種質(zhì)耐低氮能力，還需進行田間試驗來驗證。

4 結論

低氮脅迫對燕麥幼苗地上部分的生長及葉綠素的合成具有抑制作用，但會促進燕麥根系生長。株高、莖葉干重、根干重、根表面積和根尖數(shù)是評價燕麥耐低氮性的重要指標。供試材料中，ZY004067和ZY004068 為耐低氮型種質(zhì)，ZY004085、ZY004101和ZY004093 為氮敏感型種質(zhì)。