李進(jìn)超，張智韋，張嘉航，韓翔勁，杜 洋，許立新

（1.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院, 北京 100083；2.中煤科工生態(tài)環(huán)境科技有限公司, 北京 300450）

乙烯利是一種應(yīng)用廣、效果好、安全且殘留少的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)控植物種子休眠、果實(shí)成熟、花芽分化等生長(zhǎng)過程，能夠減少植物受到的逆境傷害，如機(jī)械損傷、冷害及干旱脅迫等[1-3]。有研究顯示乙烯利有助于提高葡萄(Vitis vinifera)的抗寒性[4]。乙烯利還可增加玉米(Zea mays)、甘蔗(Saccharum officinarum)、草地早熟禾(Poa pratensis)等植物的抗旱性[4-8]。而乙烯利對(duì)結(jié)縷草耐寒性的影響研究較少。日本結(jié)縷草(Zoysia japonica)，也稱結(jié)縷草，原產(chǎn)于中國、韓國、日本等地區(qū)，具有耐踐踏、耐粗放管理、養(yǎng)護(hù)成本較低、病蟲害少等優(yōu)良性狀，被廣泛應(yīng)用于綠化草坪、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪及生態(tài)修復(fù)草坪的建植中[9-10]。結(jié)縷草在我國北方生長(zhǎng)綠期較短[11]，低溫是影響其草坪質(zhì)量的重要因素之一[12]。因此，研究提升結(jié)縷草耐寒性的方法，對(duì)其進(jìn)一步推廣和應(yīng)用具有重要意義。有報(bào)道顯示結(jié)縷草和假儉草(Eremochloa ophiuroides)、海濱雀稗(Paspalum vaginatum)、 以 及‘ 天 堂 草419’(Cynodon dactylon‘Tifgreen 419’)等在低溫脅迫下葉片中游離脯氨酸、可溶性糖含量和相對(duì)電解質(zhì)滲透率上升，這種變化和其耐寒性有一定相關(guān)性[13-14]。

本研究以日本結(jié)縷草為研究對(duì)象，分析外施乙烯利對(duì)日本結(jié)縷草低溫脅迫下生理指標(biāo)的影響，確定乙烯利對(duì)結(jié)縷草耐寒性的作用，并從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的角度初步分析和研究其影響日本結(jié)縷草耐寒性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

日本結(jié)縷草草皮，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬科研基地提供。

1.2 植株培養(yǎng)

將日本結(jié)縷草草皮移栽于直徑20 cm 的盆內(nèi)，種植基質(zhì)為草炭 ∶ 蛭石 = 3 ∶ 1。置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，環(huán)境設(shè)定為32 ℃、17 600 lx 光照14 h、70%相對(duì)濕度(relative humidity，RH)，以及28 ℃、無光照10 h、70% RH，養(yǎng)護(hù)期間每日澆水，修剪高度為13 cm。

1.3 試驗(yàn)處理

日本結(jié)縷草盆栽材料分為乙烯利噴施組和蒸餾水對(duì)照組，每組設(shè)置低溫及常溫兩個(gè)處理，每個(gè)處理5 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。乙烯利噴施組過量噴施濃度為150 mg·L-1的乙烯利溶液，蒸餾水對(duì)照組過量噴施蒸餾水。噴施后對(duì)兩種植物材料進(jìn)行低溫和常溫處理。常溫處理?xiàng)l件32 ℃、17 600 lx 14 h、70% RH；28℃、無光照 10 h、70% RH。低溫處理?xiàng)l件6 ℃、17 600 lx 14 h、70% RH；4 ℃、無光照 14 h、70% RH。處理前(0 d)和處理后(52 d)，進(jìn)行葉綠素、電解質(zhì)滲透率、相對(duì)含水量、可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的采樣測(cè)定。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

葉綠素和脯氨酸含量測(cè)定參照李合生方法[15]，相對(duì)含水量的測(cè)定采用烘干法[16]，電解質(zhì)滲透率測(cè)定參照Blum 和Ebercon[17]的方法，可溶性糖的測(cè)定參照Hendrix[18]的方法，可溶性蛋白測(cè)定采用考馬斯藍(lán)G-250 染色法[19]，脯氨酸代謝途徑相關(guān)基因采樣根據(jù)Zhang 等[20]所示依據(jù)脯氨酸含量檢測(cè)而定，當(dāng)?shù)蜏叵赂彼嵘仙?，噴施乙烯利脯氨酸顯著(P ＜0.05)上升時(shí)采樣。Ilumina 測(cè)序數(shù)據(jù)與文庫構(gòu)建采用Zhang 等[20]RT-PCR 驗(yàn)證過的轉(zhuǎn)錄組庫。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)處理和作圖。利用SPSS 20 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以 Duncan (鄧肯) 法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

在本研究中，常溫處理52 d 后，乙烯利噴施組葉綠素含量較蒸餾水和同組0 d 無顯著差異(圖1)。低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草葉綠素含量較0 d 顯著下降(P＜ 0.05)，下降幅度為30.14%；低溫處理52 d 后，乙烯利噴施組日本結(jié)縷草葉綠素含量略微下降，和低溫處理前相比無顯著差異。

圖1 噴施乙烯利對(duì)低溫脅迫下日本結(jié)縷草葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of spraying ethephon on Zoysia japonica chlorophyll content under low temperature stress

2.2 相對(duì)含水量及電解質(zhì)滲透率

常溫處理52 d 后，乙烯利噴施組日本結(jié)縷草相對(duì)含水量較蒸餾水和同組0 d 無顯著變化(圖2)。低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草相對(duì)含水量較0 d 顯著下降(P＜ 0.05)，下降幅度為62.18%；乙烯利噴施組比蒸餾水組相對(duì)含水量高。

圖2 噴施乙烯利對(duì)低溫脅迫下日本結(jié)縷草相對(duì)含水量和電解質(zhì)滲透率的影響Figure 2 Effects of spraying ethephon on Zoysia japonica relative water content and electrical leakage under low temperature stress

在低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草電解質(zhì)滲透率顯著上升(P＜ 0.05) (圖2)，上升幅度較同組0 d 為376.40%；乙烯利噴施組日本結(jié)縷草受低溫脅迫影響電解質(zhì)滲透率也顯著上升(P＜ 0.05)，但上升幅度較蒸餾水組低。

2.3 可溶性糖含量

在低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草可溶性糖含量較同組0 d 顯著下降(P＜ 0.05) (圖3)，下降幅度為39.01%；乙烯利噴施組日本結(jié)縷草可溶性糖含量未下降，顯著高于低溫前52 d 處理。

圖3 噴施乙烯利對(duì)低溫脅迫下日本結(jié)縷草可溶性糖含量的影響Figure 3 Effects of spraying ethephon on Zoysia japonica soluble sugar content under low temperature stress

2.4 可溶性蛋白含量

常溫處理52 d 后，乙烯利噴施組日本結(jié)縷草可溶性蛋白含量較同組0 d 顯著上升(P＜ 0.05) (圖4)，上升幅度為49.75%。在低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草可溶性蛋白含量顯著下降，下降了31.29%；乙烯利噴施組日本結(jié)縷草可溶性蛋白含量略微下降，與蒸餾水組無顯著差異。

圖4 噴施乙烯利對(duì)低溫脅迫下日本結(jié)縷草可溶性蛋白含量的影響Figure 4 Effects of spraying ethephon on Zoysia japonica soluble protein content under low temperature stress

2.5 游離脯氨酸含量

在低溫處理52 d 后，蒸餾水組日本結(jié)縷草脯氨酸含量較同組0 d 顯著上升(P＜ 0.05) (圖5)，上升幅度為592.97%；乙烯利噴施組日本結(jié)縷草52 d 后脯氨酸含量也顯著上升(P＜ 0.05)，是蒸餾水組脯氨酸含量的3 倍多。

圖5 噴施乙烯利對(duì)低溫脅迫下日本結(jié)縷草游離脯氨酸含量的影響Figure 5 Effects of spraying ethephon on Zoysia japonica proline content under low temperature stress

2.6 脯氨酸代謝途徑的相關(guān)基因變化

在高等植物中，脯氨酸的生物合成存在兩條途徑(圖6 a)。P5CS和P5CR基因參與脯氨酸合成谷氨酸(glutamic acid，Glu) 途徑，Glu 首先由Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(Δ1-Proline-5-carboxylate s-ynthase，P5CS)作用直接生成γ- 谷氨酸半醛(Glutamic semialdehyde，GSA)，GSA 自發(fā)轉(zhuǎn)化Δ1-吡咯琳-5-羧酸(Pyrroline-5-carboxylate，P5C)，P5C 中間體在Δ1-吡咯琳-5-羧酸還原酶(Δ1-Proline-5-carboxylate reductase，P5CR)催化下產(chǎn)生脯氨酸(Proline，Pro)。OAT和P5CR基因參與脯氨酸合成鳥氨酸(Ornithine，Orn) 途徑，鳥氨酸被鳥氨酸-δ-轉(zhuǎn)氨酶(Ornithine-oxo-acid transaminase, OAT)轉(zhuǎn)按氨生成GSA，GSA 自發(fā)環(huán)化成P5C，然后通過 P5CR 轉(zhuǎn)化為脯氨酸。ProDH和P5CDH基因參與脯氨酸分解途徑，Pro 先被脯氨酸脫氫酶(Proline d-ehydrogenase，ProDH)生成 P5C，然后在Δ1 -吡咯琳-5-羧酸脫氫酶(Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，P5CDH)的催化下轉(zhuǎn)化為 Glu。

圖6 脯氨酸代謝途徑基因間的相互關(guān)系模式圖及表達(dá)量的變化Figure 6 Intergene relationship patterns and changes in proline metabolic pathway expression

蒸餾水組低溫條件與常溫條件相比日本結(jié)縷草P5CR和P5CDH基因無表達(dá)(圖6 b)，OAT和P5CS基因表達(dá)上升，ProDH基因表達(dá)下降；乙烯利噴施組低溫條件與常溫條件相比P5CS基因表達(dá)上升，OAT基因表達(dá)無變化，ProDH基因表達(dá)下降。

3 討論

3.1 乙烯利對(duì)葉綠素含量的影響

葉綠素是高等植物吸收、傳遞光能必不可少的色素分子，葉綠素含量在一定程度上與光合速率顯著相關(guān)，因此影響植物生長(zhǎng)狀況，進(jìn)而間接影響植物的抗逆性[21]。已有研究表明，低溫脅迫抑制裸燕麥(Avena nuda)和水稻(Oryza sativa)葉綠素生物合成，導(dǎo)致葉綠體功能紊亂，葉綠素積累減少[22-23]。與此一致，本研究中低溫脅迫造成蒸餾水組日本結(jié)縷草葉綠素含量大幅減少，噴施乙烯利可緩解低溫脅迫下葉綠素的下降幅度，表明乙烯利可能減緩低溫誘導(dǎo)的葉綠素降解過程，增加葉綠素積累，Zhang 等[20]對(duì)葉綠素合成與降解的基因分析，也印證了這一觀點(diǎn)。馮仁軍等[24]研究香蕉(Musa paradisiaca)低溫脅迫下的表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，乙烯利對(duì)葉綠素同樣的作用，可能原因是乙烯利通過保護(hù)植物光合器官增強(qiáng)了有機(jī)物積累。而丁久玲等[21]發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下噴施乙烯利對(duì)鐵皮石斛(Dendrobium officinale)葉綠素含量無顯著變化。說明乙烯利對(duì)低溫脅迫下植物葉綠素的影響不一致，乙烯利濃度以及植物發(fā)育階段和種類等都可能是重要因素。

3.2 乙烯利對(duì)相對(duì)含水量及電解質(zhì)滲透率的影響

植物葉片相對(duì)含水量是體現(xiàn)植物生長(zhǎng)發(fā)育狀況和抗逆性的重要指標(biāo)，它能夠評(píng)估植物吸水能力和體內(nèi)水分變化，同時(shí)反映細(xì)胞代謝活性。植物在受到脅迫時(shí)細(xì)胞膜功能受損，細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，電解質(zhì)滲透率上升。因此電解質(zhì)滲透率是植物受到脅迫程度的重要指標(biāo)[19]。本研究表明，低溫脅迫下，蒸餾水組日本結(jié)縷草相對(duì)含水量下降，電解質(zhì)滲透率上升，這與陽妮[25]等在柑橘(Citrus reticulata)低溫脅迫下的研究結(jié)果一致。低溫下，乙烯利噴施組日本結(jié)縷草相對(duì)含水量的下降幅度減小，說明噴施乙烯利能夠提高日本結(jié)縷草在低溫脅迫下的保水能力，抗寒性得到提升。噴施乙烯利后抑制了低溫脅迫下日本結(jié)縷草電解質(zhì)滲透率的上升，可能是乙烯利能夠促進(jìn)逆境脅迫下抗氧化酶的活性，為細(xì)胞膜提供了更好的抗氧化保護(hù)[26]，從而減輕了膜系統(tǒng)受損程度，提升了細(xì)胞膜的完整性，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究確定。

3.3 乙烯利對(duì)可溶性糖的影響

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞液濃度，提高細(xì)胞的吸水和與脂質(zhì)相互作用能力，增強(qiáng)糖分的積累，從而減少呼吸作用對(duì)植物的傷害。大量研究表明，適宜的低溫脅迫導(dǎo)致植物可溶性糖含量上升，而過度低溫會(huì)使植株受到迫害，可溶性糖含量下降。低溫脅迫下植物可溶性糖的含量可以反映其抗寒性的強(qiáng)弱，抗寒性強(qiáng)的植株在低溫下能迅速提高可溶糖含量，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢(shì)，降低細(xì)胞冰點(diǎn)溫度，避免細(xì)胞因溫度過低而凝固[27]。本研究中，低溫下日本結(jié)縷草可溶性糖含量降低，表明植株受到脅迫的時(shí)間過長(zhǎng)或程度較大，糖分無法積累。外施乙烯利可以通過促進(jìn)日本結(jié)縷草糖分的積累，提高細(xì)胞吸水能力，減緩植株受到的脅迫損傷。

3.4 乙烯利對(duì)可溶性蛋白的影響

可溶性蛋白通過提高植物的保水能力，保護(hù)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜，是衡量植物抗寒性的重要指標(biāo)?？扇苄缘鞍椎姆e累與植物低溫耐受性有關(guān)，在一定的低溫脅迫下，可溶性蛋白含量會(huì)增加，而溫度過低或低溫持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，使其保水能力下降，可溶性蛋白積累減少[27-28]。本研究中，在常溫下噴施乙烯利日本結(jié)縷草可溶性蛋白升高，在低溫下可溶性蛋白下降，噴施乙烯利使可溶性蛋白維持基本不變，說明乙烯利可能影響了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、變性及降解等過程，從而促進(jìn)了可溶性蛋白的積累。

3.5 乙烯利對(duì)游離脯氨酸含量的影響

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要在調(diào)節(jié)細(xì)胞溶液濃度中發(fā)揮作用，脯氨酸被認(rèn)為是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，可作為穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子伴侶，細(xì)胞氧化還原電位的調(diào)節(jié)劑以及控制自由基水平的抗氧化劑。脯氨酸主要通過促進(jìn)滲透壓調(diào)節(jié)，降低植物細(xì)胞的水勢(shì)，使植物一定程度免受脅迫引起的脫水，提高植物對(duì)脅迫的耐受能力[29-30]。大量研究表明，在低溫脅迫下，植物體內(nèi)脯氨酸含量上升，植物體內(nèi)積累的脯氨酸可以提高植物的耐受性。在本研究中，低溫脅迫下蒸餾水對(duì)照組日本結(jié)縷草脯氨酸的升高，在裸燕麥[22]低溫脅迫處理中也有同樣的研究結(jié)果。在低溫條件下噴施乙烯利日本結(jié)縷草脯氨酸含量升高，且上升幅度高于未噴施乙烯利對(duì)照組，說明噴施乙烯利可以促進(jìn)日本結(jié)縷草低溫脅迫下脯氨酸的積累，乙烯利可能通過積累脯氨酸增強(qiáng)滲透勢(shì)調(diào)節(jié)能力，減少自身受到的脅迫損傷[21]。

3.6 乙烯利對(duì)脯氨酸代謝途徑相關(guān)基因的影響

細(xì)胞中的脯氨酸水平取決于脯氨酸合成代謝和分解代謝之間的平衡。谷氨酸和鳥氨酸途徑是植物中脯氨酸合成的主要兩種途徑，P5CS 是脯氨酸合成途徑的限速酶，OAT 是鳥氨酸合成脯氨酸途徑的主要催化合成酶[31]。脯氨酸分解代謝過程是合成過程的逆過程，ProDH 是脯氨酸脫氫酶，負(fù)調(diào)控脯氨酸積累，催化脯氨酸脫氫生成延丙酮酸，是脯氨酸降解過程中的限速酶[32]。

日本結(jié)縷草低溫脅迫下，P5CS基因的表達(dá)增強(qiáng), 而ProDH基因的表達(dá)受到抑制，OAT同時(shí)高表達(dá)(圖6b)，說明在基因調(diào)控水平上，結(jié)縷草響應(yīng)低溫脅迫，促進(jìn)脯氨酸合成的同時(shí)抑制其降解。這與其他植物在脅迫條件下，P5CS基因的表達(dá)增強(qiáng)，而ProDH基因的表達(dá)受到抑制的研究結(jié)果一致[32-33]。例如，楊婷等[34]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可導(dǎo)致小桐(Jatropha curcas)幼苗脯氨酸含量的大幅上升，上調(diào)小桐子P5CS和小桐子OAT基因的表達(dá)水平增強(qiáng)，同時(shí)鹽脅迫下小桐子ProDH基因的表達(dá)水平下降。張丹等[35]發(fā)現(xiàn)中國沙棘(Hippophae rhamnoidessubsp.sinensis)受到干旱脅迫時(shí)，P5CS基因表達(dá)量上調(diào)、ProDH基因表達(dá)量下調(diào)共同影響中國沙棘葉片中脯氨酸含量的積累。高表達(dá)P5CS基因?qū)Ω彼岬姆e累以及抗逆性的形成有重要的意義，過表達(dá)P5CS轉(zhuǎn)基因植物的脯氨酸含量得到大幅提升。例如Zhao 等[36]發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中異源表達(dá)互花米草(Spartina alterniflora)SaP5CS2基因，提升了轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸的合成，從而提高了抗鹽脅迫的能力。朱虹等[29]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，擬南芥P5CS1基因響應(yīng)各類脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，與植物體內(nèi)脯氨酸的含量有著顯著的關(guān)系。汪忠杰[37]發(fā)現(xiàn)，茶樹(Camellia sinensis)在3 種脅迫處理下，CsP5CS基因表達(dá)顯著提高，游離脯氨酸含量增加。

乙烯利處理日本結(jié)縷草植株在低溫脅迫下和對(duì)照植株呈現(xiàn)同樣的表達(dá)模式，P5CS基因上調(diào)表達(dá)，ProDH基因下調(diào)表達(dá)，但與對(duì)照相比，P5CS基因表達(dá)量的上升幅度減小，ProDH基因抑制表達(dá)的幅度也減少。這說明，在低溫脅迫下，乙烯利的負(fù)調(diào)控脯氨酸合成。已有研究證明P5CS 酶受脯氨酸反饋抑制調(diào)控[31]，乙烯利抑制了P5CS基因上調(diào)表達(dá)幅度，可能正是受到過高含量脯氨酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，側(cè)面證明此時(shí)結(jié)縷草植株中大量累積了脯氨酸，這個(gè)結(jié)果也得到印證(圖5)。ProDH可能也受到植物體內(nèi)脯氨酸積累增加而帶來的負(fù)反饋調(diào)控作用。李欣[38]發(fā)現(xiàn)，PEG-6000 模擬干旱逆境下，馬鈴薯(Solanum tuberosum)試管苗的ProDH基因表達(dá)量隨著脯氨酸含量的增加而下降；且試管苗的脯氨酸含量與ProDH基因表達(dá)量極顯著負(fù)相關(guān)。說明乙烯利處理提升了結(jié)縷草低溫脅迫下的脯氨酸含量，脯氨酸一定程度通過負(fù)反饋抑制脯氨酸合成相關(guān)基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

噴施乙烯利可以提升結(jié)縷草低溫脅迫的耐受性，具體表現(xiàn)為可以緩解低溫脅迫下結(jié)縷草葉綠素含量損失，抑制葉片相對(duì)含水量的下降，提高日本結(jié)縷草葉片持水能力；減輕細(xì)胞膜受損、保持細(xì)胞膜的完整性，抑制電解質(zhì)滲透率的上升。乙烯利處理可能通過調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸，降低細(xì)胞液滲透勢(shì)，提高結(jié)縷草的低溫脅迫適應(yīng)性。低溫脅迫下，日本結(jié)縷草通過基因表達(dá)層面“促進(jìn)合成、抑制降解”的策略，促進(jìn)葉片脯氨酸的積累。乙烯利處理大幅提升低溫脅迫下脯氨酸含量，從而負(fù)反饋抑制其合成相關(guān)基因表達(dá)。