張 利,郭 明

張利,郭明,安吉縣人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省湖州市 313300

0 引言

我國(guó)肝癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì),其主要病理類(lèi)型為肝細(xì)胞癌、混合型癌、膽管癌細(xì)胞癌,乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)占肝癌病因的90%左右,隨著醫(yī)療水平進(jìn)步,肝癌診療方法不斷改善,但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率較高,預(yù)后較差[1].大部分肝癌早期發(fā)病較為隱匿,臨床癥狀不明顯,確診時(shí)已處于晚期,目前肝癌治療以手術(shù)為主,合并HBV感染者治療效果不佳,病死率較高,因而探究HBV感染相關(guān)肝癌發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)具有重要意義[2].轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)與受體結(jié)合調(diào)控下游Smad蛋白表達(dá),可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,研究表明炎癥因子釋放量增加可激活TGF-β1,促進(jìn)Smad蛋白表達(dá),Smads根據(jù)其結(jié)構(gòu)、功能不同分為受體調(diào)節(jié)性Smads(Smad1、Smad2等)、共介導(dǎo)Smads、抑制Smads,該信號(hào)通路可參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程[3,4].TGF-β1/Smads信號(hào)通路是否與HBV感染性肝細(xì)胞癌有關(guān)尚未明確,本研究比較HBV感染、非感染肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量,分析其與患者臨床病理特征相關(guān)性,為臨床診斷、治療HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2016-02/2019-03本院經(jīng)手術(shù)切除后病理診斷明確的肝細(xì)胞癌患者65例為研究對(duì)象,其中男43例、女22例,年齡40-60(50.26±3.17)歲,腫瘤直徑4-7(5.10±0.35) cm.依據(jù)是否發(fā)生HBV感染分為感染者37例、非感染者28例.隨訪3年后失訪8例,依據(jù)生存情況肝細(xì)胞癌患者分為2個(gè)亞組: 生存者36例、死亡者21例.收集肝細(xì)胞癌患者臨床資料,包括分化程度、衛(wèi)星病灶、肝硬化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào): GJ7678.感染者、非感染者臨床資料見(jiàn)表1,具有可比性.

表1 兩組臨床資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn): 符合肝細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5],經(jīng)影像學(xué)、病理學(xué)診斷確診;HBV感染符合《慢性乙肝型肝炎防治指南》中診斷標(biāo)準(zhǔn)[6];術(shù)前未進(jìn)行放化療者;接受根治術(shù)、放化療等治療者;簽署知情同意書(shū).排除標(biāo)準(zhǔn): 其他肝炎病毒所致肝細(xì)胞癌者;繼發(fā)性肝細(xì)胞癌者;合并其他惡性腫瘤者;自身免疫系統(tǒng)疾病者;酒精性肝病者;藥物性肝損傷者.HBV感染程度.

1.2 方法

1.2.1 Western blot法檢測(cè)癌組織中TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)量: 采集肝細(xì)胞癌患者空腹外周靜脈血3 mL,常規(guī)離心后分離血清,采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)HBV-DNA水平,上海新波生物公司提供檢測(cè)試劑盒.分別在肝癌組織12點(diǎn)、3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)位置上,于肝癌、癌旁組織交界處取材,在腫瘤組織內(nèi)部取材1 塊,并切取距腫瘤組織邊緣＞1 cm處肝組織作為癌旁組織,肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中分別加入500 μL RIPA裂解液(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)提取總蛋白.采用Western blot法檢測(cè)組織中TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)量,操作方法如下: 二喹啉甲酸(BCA)法(武漢博士德生物工程有限公司)檢測(cè)蛋白濃度,取上清液轉(zhuǎn)移至新離心管,加入上樣緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司),100 ℃高溫下變性10 min.取40 μg蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE(碧云天生物技術(shù)有限公司)反應(yīng),結(jié)束后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜(邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司),使用5%脫脂牛奶封閉2 h,分別加入TGF-β1(1:1000)、Smad2(1:1000)、內(nèi)參GAPDH(1:3000)一抗(美國(guó)CST公司,目錄號(hào): 3711、5678、8884)稀釋液,4 ℃孵育24 h后棄一抗,加入二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,目錄號(hào): 2306)稀釋液(1:5000)后室溫孵育2 h,Tis-HCI緩沖液(TBST)洗滌(上?？评噭┯邢薰?,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光液(南京森貝伽生物科技有限公司)作用后顯影,使用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量.

表2 肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量(mean±SD)

1.2.2 原代培養(yǎng)肝癌細(xì)胞: 取HBV感染的肝癌組織標(biāo)本3 g,在含有少量PBS中使用眼科剪剪碎組織樣本,加入11 mL消化酶后放入37 ℃水浴鍋內(nèi)處理30 min,使用孔徑為70 μm篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞,然后加入10%滅活胎牛血清5 mL,促使胰蛋白酶失活,以10000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后細(xì)胞懸浮,將細(xì)胞接種于含有聚-L-賴(lài)氨酸的6孔板上,加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)48 h后收集腫瘤細(xì)胞.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將小分子干擾RNA(siRNA)TGF-β1(簡(jiǎn)稱(chēng)si-TGF-β1)、TGF-β1過(guò)表達(dá)(pcDNA-TGF-β1)加入肝癌細(xì)胞中,采用RT-qPCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TGF-β1表達(dá)水平,si-TGF-β1、pcDNA-TGF-β1購(gòu)自上海吉瑪制藥公司,RTqPCR法檢測(cè)所需試劑均購(gòu)自北京天根生化公司.

1.3 觀察指標(biāo) (1)比較HBV感染者、非感染者中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與不同臨床病理特征的相關(guān)性;(2)以門(mén)診復(fù)查、電話、微信等方式隨訪3年,平均隨訪時(shí)間(24.32±3.16) mo,統(tǒng)計(jì)隨訪期間生存情況;(3)分析生存者、死亡者中TGF-β1、Smad2表達(dá)量,及其與生存率相關(guān)性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù),計(jì)量資料以(mean±SD)表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析;計(jì)數(shù)資料以n(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier生存曲線、Log-Rank檢驗(yàn)分析3年生存情況,P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織、癌旁組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量 HBV感染的肝細(xì)胞癌患者血清HBV-DNA水平為(2.39±0.41) IgU/mL.與癌旁組織比較,肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量升高(P＜0.05),見(jiàn)圖1,表2.HBV感染者中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與HBV-DNA水平呈正相關(guān)(r=0.524、0.553,P=0.041、0.038).肝癌細(xì)胞中TGF-β1過(guò)表達(dá)處理前后,TGF-β1 mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.02、3.26±0.57,肝癌細(xì)胞中干擾TGF-β1表達(dá)處理前后,TGF-β1 mRNA表達(dá)水平分別為1.01±0.01、0.24±0.02,表明TGF-β1表達(dá)水平變化來(lái)源于肝癌細(xì)胞自分泌.

圖1 Western blot檢測(cè)TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá). A: 男性患者;B: 女性患者;C: 男性患者.1: 肝細(xì)胞癌組織;2: 癌旁組織.TGF-β1: 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;Smad2: 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2;β-Actin: β-肌動(dòng)蛋白.

2.2 感染者、非感染者肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量 感染者、非感染者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于癌旁組織(P＜0.05),且感染者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于非感染者(P＜0.05),見(jiàn)圖2、表3.

圖2 Western blot檢測(cè)TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá).A: 男性患者;B: 女性患者.1: 癌旁組織;2: 肝細(xì)胞癌組織.TGF-β1: 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;Smad2: 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2;β-Actin: β-肌動(dòng)蛋白.

表3 HBV感染者、非感染者肝細(xì)胞癌組織及癌旁組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量(mean±SD)

表4 TGF-β1、Smad2表達(dá)量與不同臨床病理特征相關(guān)性(mean±SD)

表5 不同預(yù)后肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量(mean±SD)

表6 Cox回歸分析預(yù)后影響因素

2.3 TGF-β1、Smad2表達(dá)量與不同臨床病理特征相關(guān)性 感染者、非感染者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與分化程度、衛(wèi)星病灶、肝硬化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05),見(jiàn)表4.

2.4 不同預(yù)后肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量 隨訪3年,失訪8例.死亡者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于生存者(P＜0.05),見(jiàn)表5.

2.5 TGF-β1、Smad2表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者生存率關(guān)系 隨訪結(jié)束后根據(jù)TGF-β1表達(dá)量平均值(0.80)、Smad2表達(dá)量平均值(0.55)將肝細(xì)胞癌患者分為T(mén)GF-β1高表達(dá)29例、低表達(dá)28例;Smad2高表達(dá)30例、低表達(dá)27例.TGF-β1高表達(dá)者3年生存率48.28%(14/29)低于低表達(dá)者78.57%(22/28)(P=0.003),見(jiàn)圖3;Smad2高表達(dá)者3年生存率50.00%(15/30)低于低表達(dá)者77.78%(21/27)(P=0.012),見(jiàn)圖4.

圖3 TGF-β1不同表達(dá)者生存曲線. TGF-β1: 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1.

圖4 Smad2不同表達(dá)者生存曲線.Smad2: 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子2.

2.6 Cox回歸分析預(yù)后影響因素 以預(yù)后情況為因變量(生存=0、死亡=1),以性別(男=1、女=2)、年齡(原值代入)、腫瘤直徑(原值代入)、分化程度(低分化=1、中分化=2、高分化=3)、衛(wèi)星病灶(無(wú)=0、有=1)、肝硬化(無(wú)=0、有=1)、TNM分期(Ⅰ期=1、Ⅱ期=2、Ⅲ期=3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)=0、有=1)、TGF-β1表達(dá)量(原值代入)、Smad2表達(dá)量(原值代入)為自變量,Cox回歸分析顯示TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TGF-β1表達(dá)量、Smad2表達(dá)量為預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.05),見(jiàn)表6.

3 討論

肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制與HBV感染、酒精/非酒精脂肪性肝病、肝硬化、化學(xué)致癌物質(zhì)病變、多種基因、蛋白表達(dá)異常有關(guān)[7,8].HBV感染后宿主肝細(xì)胞內(nèi)HBV DNA整合、腫瘤抑制基因表達(dá)失調(diào),且與腫瘤反應(yīng)、肝功能、免疫學(xué)指標(biāo)間相互作用,深入探究肝細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制可為抗HBV感染尋找潛在靶點(diǎn)[9,10].

TGF-β1/Smad2激活可促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移,抑制細(xì)胞凋亡,可能作為腫瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)[11,12].TGF-β1與細(xì)胞膜表面受體結(jié)合后Smad2磷酸化,其與Smad4結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移,抑制該信號(hào)通路可減弱腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[13].本研究顯示肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量升高,有無(wú)HBV感染與TGF-β1、Smad2表達(dá)量有關(guān).TGF-β1在血細(xì)胞生成、細(xì)胞趨化、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,其表達(dá)量升高可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生,促進(jìn)腫瘤惡化[14].TGF-β1、Smad2表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT),促使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸、血管生成,研究表明上游基因特異性蛋白1、絲氨酸/蘇氨酸激酶39可調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad2通路,進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[15,16].由此推測(cè)TGF-β1、Smad2可能通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生物學(xué)行為,影響肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程.本研究通過(guò)臨床試驗(yàn)證實(shí)HBV感染者、非感染者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與分化程度、衛(wèi)星病灶、肝硬化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),表明TGF-β1、Smad2表達(dá)水平升高與HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).

HBV病毒不斷被復(fù)制可激活TGF-β1/Smad2通路,誘發(fā)肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生EMT,具有極性的上皮細(xì)胞失去極性轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng),TGF-β1、Smad2可能為HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵基因.阻斷TGF-β1/Smad2通路可抑制EMT,減弱肝細(xì)胞癌[17]、伯基特淋巴瘤[18]細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力.因而探究TGF-β1/Smad2通路與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性具有重要意義.本研究顯示HBV感染者低分化、伴有衛(wèi)星病灶、伴有肝硬化、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于非感染者,表明TGF-β1、Smad2表達(dá)水平升高可促進(jìn)HBV感染者惡性進(jìn)展,可能作為HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌靶向治療的潛在靶點(diǎn).既往研究表明趨化因子受體(chemokine receptor7,CXCR7)可增加TGF-β1分泌量,調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為,促使腫瘤惡性進(jìn)展,臨床表現(xiàn)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期增高等[19].LIM和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白1(LIM and SH3 domain protein 1,LASP1)表達(dá)增加可激活TGF-β1,沉默其表達(dá)可減弱TGF-β1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力[20].由此推測(cè)其原因可能為HBV感染后CXCR7、LASP1表達(dá)水平升高可激活TGF-β1/Smad2通路,增強(qiáng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)一步參與HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌病情進(jìn)展,同時(shí)TGF-β1/Smad2通路異常還可能與HBV感染后發(fā)生的免疫耐受、病毒清除率有關(guān).本研究嘗試性分析TGF-β1、Smad2表達(dá)量與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)死亡者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于生存者,且TGF-β1、Smad2高表達(dá)者生存率低于低表達(dá)者.既往研究表明TGF-β1激活后Smad2磷酸化,可增強(qiáng)KLüppel樣因子8啟動(dòng)子活性,其高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)[21].TGF-β1、Smad2表達(dá)量升高還與較低生存率有關(guān)[22].結(jié)合本研究結(jié)果分析其原因可能為T(mén)GF-β1/Smad2通路活化后可促進(jìn)下游分子核心2β-1,6-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)展,促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展,導(dǎo)致患者預(yù)后不良[23].同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TGF-β1表達(dá)量、Smad2表達(dá)量為預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示TGF-β1、Smad2表達(dá)量可能作為評(píng)估肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo).

4 結(jié)論

綜上所述,肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)水平升高,其表達(dá)量與HBV感染、分化程度、衛(wèi)星病灶、肝硬化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),且HBV感染者中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與臨床病理特征相關(guān)性更為密切,可能作為判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo),還可為肝細(xì)胞癌個(gè)體化治療提供新方向.但本研究?jī)H觀察TGF-β1、Smad2,下一步需探究Smad2與其他信號(hào)分子的磷酸化水平及其磷酸化機(jī)制,同時(shí)仍需增加HBV(+)肝癌細(xì)胞、HBV(-)肝癌細(xì)胞的體外表型驗(yàn)證,并分析其內(nèi)在機(jī)制.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

攜帶乙肝病毒的肝癌患者病情惡化的速度更快,且手術(shù)后的預(yù)后效果、5年期生存率等不理想.停留在血液學(xué)生化指標(biāo)的檢測(cè)手段并不能充分了解患者治療不理想的機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad2信號(hào)通路能夠肝癌細(xì)胞的增殖和分化.但是在同時(shí)感染乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的情況下是否會(huì)對(duì)表達(dá)有影響報(bào)道較少.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

TGF-β1/Smad2信號(hào)通路在調(diào)控癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮了重要作用,本研究旨在探討在乙肝病毒感染的肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2的表達(dá)情況及其與HBV的相關(guān)性.

實(shí)驗(yàn)方法

在臨床病理學(xué)、影像學(xué)、血液學(xué)等檢測(cè)手段的基礎(chǔ)上確定研究對(duì)象,通過(guò)分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)的方法對(duì)TGF-β1、Smad2的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)術(shù)后患者進(jìn)行定期隨訪,了解預(yù)后情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與癌旁組織比較,肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量升高.感染者肝細(xì)胞癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量高于非感染者,且TGF-β1、Smad2表達(dá)量與HBV-DNA水平呈正相關(guān).肝癌組織中TGF-β1、Smad2表達(dá)量與分化程度、衛(wèi)星病灶、肝硬化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存期有關(guān).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

感染HBV的肝癌患者TGF-β1、Smad2表達(dá)量更高,預(yù)后效果更差.TGF-β1、Smad2的表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌預(yù)后情況的判斷,以及肝細(xì)胞癌個(gè)體化治療具有一定的臨床意義.

展望前景

TGF-β1、Smad2在調(diào)控肝癌病情發(fā)展中起到一定的作用,尤其與感染HBV的肝癌患者的病情發(fā)展和預(yù)后生存有較大的相關(guān)性.但是機(jī)制研究還需要探討信號(hào)通路相關(guān)分子的磷酸化水平等.