盧宇佳 張 珊 趙 謙 王安娜 李 麗 趙靜潔

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院,北京 100050)

抑郁癥又稱抑郁障礙,以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征,是心境障礙的主要類型。世界衛(wèi)生組織預(yù)測,2030年抑郁癥將成為最大的健康挑戰(zhàn)[1]。研究者嘗試建立穩(wěn)定的抑郁相關(guān)動物模型,用于其機制研究及開發(fā)治療藥物。嚙齒類動物價格低廉、繁殖迅速、取材簡便。造模后出現(xiàn)的一般活動狀態(tài)的改變、對新鮮環(huán)境的好奇程度及探索能力下降、快感喪失等特征,與抑郁癥精神運動性變化相似。因此為抑郁相關(guān)模型的常用動物選擇。

在過去的50年中,抑郁相關(guān)動物模型的構(gòu)建推動了抑郁癥病理生理學(xué)研究,促進了抗抑郁藥物的開發(fā)。抑郁相關(guān)動物模型構(gòu)建最初基于手術(shù)方法(例如嗅球切除術(shù))或急性應(yīng)激誘導(dǎo)。近年來研究表明,與短期急性應(yīng)激相比,慢性長期應(yīng)激,如慢性束縛應(yīng)激、慢性社會挫敗應(yīng)激和慢性不可預(yù)知的溫和刺激似乎可以模擬人類在日常生活中接受的不良應(yīng)激事件,更加有效構(gòu)建了抑郁癥動物模型[2]。判斷這些模型是否造模成功,抗抑郁藥物是否有效的評價方法主要基于行為學(xué)實驗。常用的行為學(xué)實驗主要分為:檢測絕望情緒的實驗,如強迫游泳實驗、懸尾實驗[3]?；讵勝p的實驗,如糖水偏好實驗、新奇抑制攝食實驗[4]。基于探索行為的實驗,如曠場實驗、高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗[5]。然而目前關(guān)于行為學(xué)評價操作方法不統(tǒng)一,為使其對抑郁癥模型評價的準(zhǔn)確度更高,本文基于絕望、獎賞、探索三個方面對嚙齒類動物抑郁相關(guān)行為學(xué)評價方法進行全面疏理,總結(jié)如下:

1 資料來源和檢索策略

作者于2021年10月在中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、National Center for Biotechnology Information(PubMed)數(shù)據(jù)庫進行檢索;其中檢索式為“主題+自由詞”,抑郁(depression or depressive-like)AND行為學(xué)(behavior)AND嚙齒類動物(rodent or rat or mouse),共檢索出438篇相關(guān)文獻。

2 文獻納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)涵蓋抑郁癥動物行為學(xué)評價的相關(guān)文獻;(2)2010年12月至2021年10月公開發(fā)表的期刊文獻;(3)研究設(shè)計完整的文獻。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)綜述等二次評價類文獻;(2)抑郁癥合并其他疾病的文獻;(3)用于評價其他精神類疾病的文獻;(4)行為學(xué)評價流程或結(jié)果描述不清;(5)所涉及行為學(xué)方法使用頻率較低。

3 質(zhì)量評估與數(shù)據(jù)提取

本次綜述最后納入文獻196篇,約2/3文獻是近5年內(nèi)的,如同一研究團隊發(fā)表,中英文觀點一致,選擇文獻質(zhì)量較高的納入。納入的文獻著重闡述抑郁相關(guān)動物模型的行為學(xué)評價相關(guān)研究。因行為學(xué)評價方法較多,操作流程不一,僅作定性描述(圖1)。

圖1 文獻篩選流程圖Fig.1 Flow chat of literature screening

4 文獻研究結(jié)果

4.1 行為學(xué)檢測方法

嚙齒類動物行為學(xué)檢測,在精神類疾病研究中具有重要意義。通過觀察嚙齒類動物行為學(xué)變化,結(jié)合現(xiàn)代臨床中精神疾病的癥狀,加深人類對精神類疾病的探索和藥物的研發(fā)。由于行為學(xué)檢測目的不同,各實驗室選擇的組合方式不盡相同,本文基于絕望、獎賞、探索三個方面,對所納入文獻中涉及的行為學(xué)檢測方法出現(xiàn)頻率進行了統(tǒng)計(表1)。

4.2 基于絕望的行為學(xué)檢測方法

4.2.1強迫游泳實驗(forced swimming test,FST):早在1977年法國學(xué)者Porsolt發(fā)明了該實驗并將其用于行為絕望的抑郁模型造模[6]。嚙齒類動物因無法脫離困境,放棄掙扎的行為表現(xiàn),屬于“行為絕望”。此種行為不僅是身體能量或運動減少的反應(yīng),而且表明動物的精神活動水平。FST可以較好的模擬抑郁障礙患者的絕望感,在抑郁癥研究中應(yīng)用廣泛[7]。

根據(jù)對各團隊發(fā)表文獻查閱,現(xiàn)總結(jié)基本流程如下:實驗前應(yīng)排除游泳能力不佳的動物。小鼠/大鼠適應(yīng)性游泳時間為10～15 min,適應(yīng)后將小鼠/大鼠置于濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環(huán)境中,間隔24 h進行正式實驗。如圖2所示,選擇往圓柱體(大鼠和小鼠所需高度分別約為50、30 cm,直徑分別約為30、20 cm)水缸中注水,液面高度以鼠尾不能碰觸為宜。適應(yīng)后,將動物放入水中并記錄,小鼠/大鼠記錄時間為5～10 min(部分實驗團隊將動物放入水中10 min,記錄后4～5 min游泳不動時間)。記錄后撈出吹干,恢復(fù)體溫,每只動物交換時換水[8]。實驗動物維持漂浮狀態(tài):身體微蜷,只露出鼻孔維持呼吸,前爪停止刨水,后爪偶有劃水,定義為“靜止時間”,靜止時間長的動物為絕望行為明顯[9],抑郁表型鮮明。

注:A.強迫游泳實驗中小鼠掙扎狀態(tài);B.強迫游泳實驗中小鼠靜止?fàn)顟B(tài)。Note: A.Struggling state of mice in the FST;B.Stationary state of the mice in the FST.

實驗環(huán)境、水溫是影響該實驗結(jié)果的重要因素,因此該實驗需注意的是:(1)由于實驗光線較強,會縮短嚙齒類動物不動時間,不利于準(zhǔn)確反映其抑郁狀態(tài)[9],因此FST實驗應(yīng)在不超過0.96 W/m2環(huán)境下進行[10]。(2)水溫是FST重要影響因素之一,研究表明,水溫與靜止?fàn)顟B(tài)呈U型關(guān)系,水溫過低或過高則會縮短不動時間,故宜控制在20～25 ℃[12]。

4.2.2懸尾實驗(tail suspension test,TST):1985年Steru等[13]提出懸尾實驗,用于建立行為絕望模型。現(xiàn)代研究認(rèn)為,TST可用于廣泛測定廣譜抗抑郁藥的作用效果,價格低廉且方法簡單,易于自動化。嚙齒類動物由于尾端倒懸,產(chǎn)生劇烈掙扎,一段時間后因不能擺脫,出現(xiàn)不動狀態(tài),此狀態(tài)類似抑郁癥患者的絕望行為[14]。

通過總結(jié)文獻了解,各實驗團隊實驗時將小鼠置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環(huán)境中,用膠帶將小鼠的尾端懸掛在與地板距離為 20～25 cm的懸掛桿上。實驗動物較多時,為防止動物彼此觀察或互相影響,中間用隔板隔開;動物懸掛在隔間中間,寬度和深度足夠大,不能與墻壁接觸。如圖3所示,當(dāng)小鼠在懸掛時表現(xiàn)出的無掙扎狀態(tài)視為不動時間,記錄時常為5～10 min(部分實驗團隊實驗進行10 min,記錄后4～5 min的不動時間)。不動時間長的小鼠絕望行為明顯。

注:A.懸尾實驗中小鼠掙扎狀態(tài);B.懸尾實驗中小鼠靜止?fàn)顟B(tài)。Note: A.Struggling state of mice in the TST;B.Stationary state of the mice in the TST.

TST原理與FST原理相近,在眾多實驗團隊發(fā)表的文章中,其實驗結(jié)果也具有一致性[15]。然而,TST實驗結(jié)果依賴于嚙齒類動物的運動行為,不同品系的嚙齒類動物對實驗有較大影響。如大鼠體型較大,懸尾時可上翻,不適用于TST。也有實驗團隊認(rèn)為C57BL/6小鼠存在沿著尾巴上爬的趨勢,對TST測試結(jié)果影響較大[16]。因此為避免因品系不同對實驗結(jié)果造成影響,應(yīng)在實驗前,測量實驗動物尾巴占總體長度的百分比,以確定其爬上尾巴的程度,將上爬趨勢明顯的實驗動物在數(shù)據(jù)中排除,以免對數(shù)據(jù)造成干擾。

4.3 基于獎賞的行為學(xué)檢測方法

4.3.1糖水偏好實驗(sucrose preference test,SPT):1981年,Katz等[17]首次在抑郁癥動物造模過程中發(fā)現(xiàn),應(yīng)激后的模型鼠在SPT實驗中,消耗量減少了50%。Willner P等[18]發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性抑郁癥的核心特征是獎勵機制缺陷和快感缺乏。SPT因其有效的模擬了抑郁癥患者快感缺乏的臨床表現(xiàn),被廣泛應(yīng)用于抑郁動物模型造模成功與否的評價[19]。

根據(jù)現(xiàn)有文獻總結(jié)實施步驟如下:將嚙齒類動物置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃的實驗環(huán)境中單籠飼養(yǎng)(小鼠多采用長×寬×高約為10 cm×24 cm×13 cm,大鼠采用38 cm×32 cm×18 cm),可自由接觸糖水瓶與白水瓶。在籠具上方放置瓶A、瓶B(瓶A為1%～2%蔗糖,瓶B為無糖飲用水)進行12～24 h實驗裝置適應(yīng),實驗動物可自由進食。適應(yīng)結(jié)束,禁食禁水12～24 h后,進行測試,實驗動物給予瓶A與瓶B測量12～24 h。瓶A與瓶B測試前后都需稱重。飲糖水比率根據(jù)公式A/(A+B)×100%計算[20]。

部分實驗團隊認(rèn)為,實驗動物糖水消耗量占總飲水量的比率<60%,則該動物有快感缺失。也有部分實驗團隊進行SPT實驗時,糖水消耗量占總飲水量的比率>60%。這可能與實驗適應(yīng)時間、實驗環(huán)境、糖水濃度等關(guān)系密切。因此實驗時應(yīng)注意:(1)實驗前應(yīng)進行“兩瓶水裝置”適應(yīng)性喂養(yǎng),以降低突然增加裝置動物不能識別造成的實驗偏差。(2)正式實驗前應(yīng)基線測量,排除個體差異(例如,個體天生不喜愛糖水而影響整體糖水偏愛率的評估)[21]。(3)如是禁水24 h后進行該實驗,應(yīng)測試24 h的糖水消耗量,因為1 h測試方法會使禁水動物因口渴而選擇就近原則,不一定表現(xiàn)出偏愛糖水行為。(4)根據(jù)動物喜好,蔗糖濃度可在1%～2%變化,但實驗研究表明2%濃度實驗結(jié)果明顯優(yōu)于1%[3]。

4.3.2新奇攝食抑制實驗(novelty suppressed feeding test,NSF):NSF實驗依據(jù)禁食后嚙齒類動物在新奇環(huán)境攝食潛伏期延長的原理,測量其在新環(huán)境的進食潛伏期,評估動物的抑郁狀態(tài)。NSF表現(xiàn)了嚙齒類動物攝食的消沉程度及焦慮水平。嚙齒類動物攝食的渴望和對新奇空間的懼怕兩者之間的矛盾競爭,使得該實驗?zāi)軌蛴行Х磻?yīng)臨床中抑郁癥患者的快感缺失[22]。

實驗前,模型動物置于12 h/12 h晝夜間斷照明,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃,可自由活動的實驗環(huán)境中,禁食不禁水12～24 h。準(zhǔn)備一定尺寸(小鼠多采用長×寬×高約為50 cm×40 cm×30 cm,大鼠采用70 cm×70 cm×50 cm)曠場箱,曠場中央放置7～8 g的鼠糧,將動物沿箱子一角放入,記錄5 min內(nèi)成功覓食所花費的時間及啃食食物的總重量。動物的攝食潛伏期越長,則表示焦慮程度越高。

通過總結(jié)文獻,環(huán)境因素對該實驗具有較大影響。(1)實驗過程中,應(yīng)盡量實驗環(huán)境安靜,最大程度減少噪音對嚙齒類動物的影響。(2)為了順應(yīng)嚙齒類動物的攝食習(xí)慣,應(yīng)選擇較暗的實驗環(huán)境,光照應(yīng)在0.12 W/m2左右。(3)該實驗需排除因為食欲差異而導(dǎo)致影響進食時間,故在模型動物放回籠中后需要記錄5～10 min的食物消耗量。(4)為保證實驗準(zhǔn)確,在每次實驗前應(yīng)校準(zhǔn)天平,清除天平上食物碎屑并擦拭干凈。此實驗可多次重復(fù),為避免動物熟悉環(huán)境,而違背此實驗原理,兩次實驗間隔時間應(yīng)大于5 d。

4.4 基于探索的行為學(xué)檢測方法

4.4.1曠場實驗(open field test,OFT):Hall等在1934年首次將OFT測試應(yīng)用于動物情緒研究中[23]。其原理基于嚙齒類動物畏懼空曠場地的天性,即其活動具有趨避性,對新事物易產(chǎn)生好奇性。OFT作為嚙齒類動物抑郁焦慮狀態(tài)的行為學(xué)評價方法,已推廣到神經(jīng)學(xué)及精神藥理學(xué)的研究中。

主要操作流程為:大小鼠曠場裝置不同(小鼠曠場一般為30～50 cm長的正方形,深30 cm;大鼠曠場一般為小鼠兩倍,60～100 cm,深30 cm)。如圖4所示,曠場周圍由黑色不透明擋板圍成,并配有攝像頭,曠場中心邊界到外周的距離為總距離的20%或25%,即紅色方格區(qū)域為中心區(qū),黑色方格區(qū)域為外周區(qū)域。測試時應(yīng)提前30 min,把模型動物放置在測試房間適應(yīng),周圍環(huán)境參數(shù)為12 h/12 h晝夜間斷照明,實驗光照強度不超過0.12 W/m2,濕度45%～65%,溫度21～23 ℃。適應(yīng)結(jié)束,把動物放入曠場中心,同時開始視頻記錄,測試過程5～10 min。測試結(jié)束,軟件追蹤并記錄嚙齒類動物在曠場中心區(qū)及外周區(qū)停留時間。

注:圖中所示長寬為小鼠裝置所用,中心邊界至外周距離比總距離,A為20%,B為25%。Note: The length and width shown in the figure are for the mice device, and the distance from the center boundary to the periphery is 20% for A and 25% for B.

通過對不同文獻的查閱總結(jié),在具體操作中應(yīng)注意如下幾點:(1)實驗中需保持安靜環(huán)境,以免噪音干擾,使模型動物產(chǎn)生緊張的情緒。(2)曠場需清潔除味,防止模型動物因嗅到同類的氣味而產(chǎn)生警覺性。(3)基于嚙齒類動物嗜暗的特性,應(yīng)注意曠場亮度,使模型動物更接近其自然天性,增加實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4.4.2高架十字迷宮實驗(elevated plus maze,EPM):EPM基于嚙齒類動物對新異環(huán)境產(chǎn)生的探究性和對高懸敞開臂產(chǎn)生的恐懼心理的特點,利用二者所形成的矛盾沖突行為考察其焦慮狀態(tài)。EMP能有效反映臨床中患者的焦慮狀態(tài),被廣泛用于精神類藥物藥理研究,可有效評估抗焦慮藥物的藥理效應(yīng)[24]。

測試前1周,應(yīng)把模型動物放置在測試房間中進行適應(yīng),周圍環(huán)境參數(shù)為12 h/12 h晝夜間斷照明,溫度21～23 ℃,濕度45%～65%,自由飲用食水。如圖5所示,實驗者通常將小鼠置于長寬約為50 cm×10 cm的兩對相對開放臂(大鼠的開放臂長度多>45 cm、寬度為10或15 cm)和長寬高分別約為50 cm×10 cm×40 cm的兩對相對閉合臂(大鼠閉合臂的長寬與開放臂相同)及10 cm×10 cm連接成的中央?yún)^(qū)(大鼠多為15 cm×15 cm或10 cm×10 cm)[25]。記錄實驗動物放置于中心區(qū)后5～10 min內(nèi)行為變化,目前多采用進入開放臂次數(shù)/時間百分比作為判定結(jié)果。

注:圖中所示裝置長度均為小鼠所用,A為高架十字迷宮結(jié)構(gòu)圖,B為小鼠運動模式圖。Note: The length of the device shown is used by mice, A is the structure of the elevated plus maze, B is the movement pattern of the mouse.

參考各研究團隊實驗結(jié)果,在操作過程中應(yīng)考慮以下幾點:(1)模型動物初始擺放位置較為關(guān)鍵,目前多認(rèn)為應(yīng)將其放在中央連接區(qū),頭朝向開放臂,使其陷入探究與回避的矛盾中,更有利于通過記錄開放臂的時間及次數(shù)客觀評價其焦慮程度。若頭朝向封閉臂,則使模型動物更傾向于躲避,在實驗全程不進入開放臂。(2)光照強度應(yīng)保持統(tǒng)一,以便行為分析軟件能更好的追蹤動物[26]。筆者建議選擇燈光為25 W燈泡,置于中央?yún)^(qū)40 cm處照明。(3)實驗時間以5～10 min為宜,時間過短,動物尚未適應(yīng)環(huán)境,時間過長則可能造成動物對開放環(huán)境新奇度降低。(4)兩次實驗之間應(yīng)使用乙醇噴灑并擦拭迷宮箱,避免實驗動物氣味對實驗結(jié)果造成一定影響。(5)為精確實驗結(jié)果,可將此實驗重復(fù)2次,每次間隔1周。

4.4.3明暗箱實驗(light/dark box,LDB):LDB利用動物對強光線的厭惡感以及對新奇環(huán)境探究習(xí)性之間的矛盾沖突,廣泛用于評價嚙齒類動物的焦慮樣行為。實驗研究表明,嚙齒類動物明箱活動時間與穿梭次數(shù)差異,模擬了抑郁癥患者在臨床當(dāng)中的抑郁焦慮樣行為。

測試前1周,應(yīng)把模型動物放置于12 h/12 h晝夜間斷照明,溫度21～23 ℃,濕度45%～65%,自由飲用食水的實驗環(huán)境中。如圖6所示,明暗箱(小鼠多采用長×寬×高約為45 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用62 cm×48 cm×51 cm),包括較寬闊的明箱區(qū)(小鼠采用30 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用42 cm×48 cm×51 cm),較狹窄的暗箱區(qū)(小鼠采用15 cm×45 cm×30 cm,大鼠采用20 cm×48 cm×51 cm),兩箱體隔板中間存在通道,可允許實驗動物自由穿梭。實驗者將小鼠放置明箱區(qū)正中央,通過攝像系統(tǒng)記錄5～10 min內(nèi)動物的行為變化,包括暗箱停留時間、垂直運動及穿梭次數(shù)[27]。

圖6 明暗箱實驗示意圖Fig.6 Diagram of light/dark box

在總結(jié)文獻后,我們應(yīng)注意(1)LDB是基于嚙齒類動物天生對明亮區(qū)域的厭惡,以及嚙齒類動物對新環(huán)境的自發(fā)探索行為,應(yīng)選擇30 W燈泡距離箱底45 cm處照明,使明暗箱區(qū)域?qū)Ρ让黠@,避免假陽性實驗結(jié)果。(2)嚙齒類動物的焦慮情緒易受到外界環(huán)境改變的影響;應(yīng)保證實驗過程中光照強度、光照位置、光照顏色保持一致。(3)明暗箱在實驗中需清潔除味,防止模型動物因嗅到特殊氣味而產(chǎn)生焦慮情緒。

5 討論

行為學(xué)檢測方法有助于衡量疾病的表型狀態(tài),尤其適用于神經(jīng)、精神類動物模型輔助探究疾病機制及藥物療效等。在研究過程中,選擇的行為學(xué)評價方法是否恰當(dāng)、行為學(xué)實驗操作是否合理關(guān)系到研究成果的科學(xué)性、有效性和外推性。尤其是對于尚無客觀病理特征和診斷標(biāo)志物的神經(jīng)、精神疾病,必須由行為學(xué)評價作為其疾病表型的評估方法。

因此,行為學(xué)評價的規(guī)范化操作是保障其客觀有效的關(guān)鍵所在。由于嚙齒類動物行為學(xué)檢測受環(huán)境影響較大,如光照強度、聲音、溫度、氣味等,導(dǎo)致不同實驗團隊實驗結(jié)果存在差異。為使行為學(xué)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠,未來行為學(xué)實驗的發(fā)展應(yīng)盡可能尋求標(biāo)準(zhǔn)化和統(tǒng)一化,以減少各變量對實驗結(jié)果造成的影響。其次,行為學(xué)評價過程應(yīng)進一步客觀化,為提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,應(yīng)更加廣泛發(fā)展計算機圖像識別技術(shù)的應(yīng)用,避免實驗人員的主觀因素對實驗動物的運動表現(xiàn)造成錯記和漏記。此外,多種行為學(xué)評價方法聯(lián)合使用、多種行為學(xué)結(jié)果綜合分析,可一定程度上避免單一指標(biāo)的局限性,更能提高不同疾病模型的行為學(xué)評價的可信性。