羅川 皮鳳娟 張慶蓮 許曾 張盛敏

基金項(xiàng)目：四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2021MS242）。

作者簡(jiǎn)介：

羅川（1997—），男，漢族，本科，藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院新制劑的研發(fā)。E-mail：251690372@qq.com

通信作者：

張盛敏（1977—），女，漢族，本科，主任藥師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)及醫(yī)院新制劑研發(fā)。E-mail：353500649@qq.com

【摘? 要】

目的：優(yōu)化消乳增生軟膏的提取工藝。方法：采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)消乳增生軟膏的提取工藝進(jìn)行研究。單因素試驗(yàn)以揮發(fā)油體積為指標(biāo)，考察浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、加水量對(duì)消乳增生軟膏提取工藝的影響，正交試驗(yàn)以芥子硫氰酸鹽含量、橙皮苷含量、干浸膏得率為指標(biāo)，考察提取時(shí)間、提取次數(shù)、加水量對(duì)消乳增生軟膏提取工藝的影響。結(jié)果：消乳增生軟膏的最佳提取工藝為6倍加水量，提取2次，每次1 h。結(jié)論：該優(yōu)化工藝可行，易操作，所得有效成分含量高，為以后開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑打下基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】

消乳增生軟膏；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；提取工藝

【中圖分類號(hào)】R284.2??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0030-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322008

Orthogonal Test to Optimize the Extraction Process of? Xiao Ru Hyperplasia Ointment

LUO Chuan? PI Fengjuan? ZHANG Qinglian? XU Zeng? ZHANG Shengmin*

Pharmacy Department of Luzhou Traditional Chinese Medicine Hospital，Luzhou 510500，China

Abstract：

Objective To optimize the extraction process of xiao ru hyperplasia ointment. Methods The extraction method of xiao ru hyperplasia ointment was studied by single factor and orthogonal test.univariate test with volatile oil volume as the index，the investigation， soaking time， extraction time， liquid ratio on the influence of xiao ru hyperplasia ointment，orthogonal test with mustard thiocyanate content， tangerine peel content， dry extract rate as the index， the extraction time， extraction times， liquid ratio to the influence of xiao ru hyperplasia ointment. Results The best extraction process of xiao ru hyperplasia ointment is 1∶6 liquid ratio， extracted 2 times， 1 h each. Conclusion The optimization process is feasible， Easy to operate， the high content of active ingredients， laying the foundation for the development of hospital preparation in the future.

Keywords：

Xiao Ru Hyperplasia Ointment; Single Factor Test; Orthogonal Test; Extraction Process

乳腺增生為常見(jiàn)乳腺疾病， 又稱“乳腺結(jié)構(gòu)不良”“纖維囊性乳腺病”，屬病理性增生，主要表現(xiàn)為正常乳腺小葉的生理性增生與復(fù)舊不全及乳腺正常結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂［1］。其主要臨床表現(xiàn)為乳房腫塊和脹痛，是一種既非炎癥又非腫瘤的增生性病變［2］，其發(fā)病率占乳腺疾病的首位［3］。消乳增生軟膏為我院協(xié)定處方，原方為散劑，用水調(diào)勻后直接外敷于痛處，起到軟堅(jiān)散結(jié)，活血止痛的效果。本方用藥精煉，但各中藥成分藥效有所差異，因此在對(duì)本復(fù)方的提取工藝研究中不能只以單味藥材的提取工藝作為參照，而應(yīng)考慮本復(fù)方的整體性。本文根據(jù)中藥復(fù)方的整體性，在保留傳統(tǒng)中藥散劑特點(diǎn)的基礎(chǔ)上［4］，分別以有效成分陳皮和芥子中的橙皮苷［5］、芥子硫氰酸鹽含量及干浸膏得率為指標(biāo)， 采用單因素實(shí)驗(yàn)法和正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)其制備工藝進(jìn)行研究，為以后開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑奠定基礎(chǔ)。

1? 儀器與材料

1.1儀器? FA2004萬(wàn)分之一電子天平（上海安亭電子儀器廠），GZX-GF101-3BS-Ⅱ/H電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），CQ-250A-DST超聲清洗儀（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠），ZDHW調(diào)溫電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2? 材料? 芥子硫氰酸鹽對(duì)照品（批號(hào)111702-202107，含量以100%計(jì)）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)110721-202019，含量以95.3%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；陳皮（批號(hào)210700791）、芥子（批號(hào)190700581）、肉桂（批號(hào)210701091）等均由成都市康美藥業(yè)生產(chǎn)有限公司提供，山奈（批號(hào)200924-1）和穿破石（批號(hào)190910-1）由瀘州百草堂中藥飲片有限公司提供，胡椒（批號(hào)20070103）由四川國(guó)強(qiáng)中藥飲片有限公司提供。上述試藥經(jīng)檢驗(yàn)均為真品，所使用的試劑等級(jí)：乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 單因素考察

2.1.1? 吸水率考察? 按照處方量稱取藥材共96g，加入1000mL水浸泡，分別在10min、20min、30min、60min、120min、180min測(cè)定濾液體積。吸水率=（1000-濾液體積）/1000。測(cè)定該處方吸水率為11%。

2.1.2? 加水量考察? 按照處方量的兩倍準(zhǔn)確稱量藥材（丁香、陳皮、肉桂等）3份，固定浸泡時(shí)間為30min，提取次數(shù)為1次，加水量依次為6倍、8倍、10倍，提取7 h，并記錄每小時(shí)揮發(fā)油的體積，揮發(fā)油總體積分別為3.4mL、2.9mL、2.5mL。結(jié)果表明：在加水量為6倍時(shí)所提取到的揮發(fā)油較多。故選擇加水量為6倍。結(jié)果如圖1所示。

2.1.3? 浸泡時(shí)間考察? 準(zhǔn)確稱量?jī)杀短幏搅康乃幉模ㄈ夤?、陳皮、丁香等?份，固定提取次數(shù)為一次，加水量為6倍［6］，浸泡時(shí)間分別為1 h［7］、1.5 h，提取7 h，并記錄每小時(shí)揮發(fā)油的體積，揮發(fā)油總體積分別為3mL、2.8mL。綜合2.1.1浸泡30min的結(jié)果，表明：在浸泡時(shí)間為30min時(shí)所得揮發(fā)油較多，故選擇浸泡時(shí)間為30min。結(jié)果如圖2所示。

2.1.4? 提取時(shí)間考察? 結(jié)合2.1.1和2.1.2兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，在提取時(shí)間超過(guò)5 h后，揮發(fā)油體積增長(zhǎng)緩慢，考慮到生產(chǎn)成本等因素，故選擇最佳提取時(shí)間為5 h。結(jié)果如圖3所示。

2.2? 含量測(cè)定

2.2.1? 色譜條件? 色譜柱： ZORBAX-SB-C18 （250mm×4.6 mm， 5μm） 。流動(dòng)相：1mL/L乙腈∶含0.1%磷酸的0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液（20∶80）。柱溫：30℃。檢測(cè)波長(zhǎng)0～7min∶326 nm。7～15min∶283 nm;流速：1mL/min［8-10］。進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2? 對(duì)照品溶液的制備? 芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液的制備：取芥子硫氰酸鹽對(duì)照品適量，精密稱定，加不含0.1%磷酸的流動(dòng)相制成每1mL含0.22 mg的對(duì)照品貯備液［11］，精密量取對(duì)照品貯備液2mL，置10mL容量瓶中，用不含0.1%磷酸的流動(dòng)相稀釋并定容，即得；橙皮苷對(duì)照品溶液的制備：取適量橙皮苷對(duì)照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.52 mg的對(duì)照品貯備液，精密量取對(duì)照品貯備液1mL，置10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，即得。

芥子陰性對(duì)照品溶液的制備：除去芥子以外的其他藥材，按優(yōu)選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。陳皮陰性對(duì)照品溶液的制備：取除去陳皮以外的其他藥材，按優(yōu)選提取工藝制備陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3? 供試品溶液的制備? 精密量取正交實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下制備的溶液5mL， 共9份，置于具塞錐形瓶中，水浴蒸干后加入甲醇10mL， 精密稱定， 超聲45min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得［11］。

2.2.4? 方法學(xué)考察

2.2.4.1? 專屬性實(shí)驗(yàn)? 分別精密量取2.2.2項(xiàng)下的芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液、橙皮苷對(duì)照品溶液、缺芥子陰性對(duì)照品溶液、缺陳皮陰性對(duì)照品溶液和2.2.3項(xiàng)下的供試品溶液，各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件檢測(cè)。結(jié)果對(duì)照品溶液和供試品溶液在相同的保留時(shí)間均有出峰，陰性對(duì)照無(wú)干擾，如圖4。說(shuō)明該測(cè)定方法專屬性強(qiáng)，無(wú)干擾。

2.2.4.2? 線性范圍考察? 精密量取2.2.2項(xiàng)下的芥子硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液和橙皮苷對(duì)照品貯備液各1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL，分別置于10mL容量瓶中，芥子硫氰酸鹽對(duì)照品貯備液用不含0.1%磷酸的流動(dòng)相，橙皮苷照品貯備液用甲醇稀釋并定容，按2.4.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，得回歸方程分別為：y1=614.14x-49.4，r=0.9999（n=8），y2=974.1x-28.711，r=0.9999（n=8）。結(jié)果表明：芥子硫氰酸鹽在0.22～1.76 μg內(nèi)，橙皮苷在0.52～4.16 μg范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4.3? 精密度實(shí)驗(yàn)? 精密量取2.2.2項(xiàng)下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液，分別重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果芥子硫氰酸鹽、橙皮苷峰面積的RSD值分別為0.69%，0.72%，表明該方法精密度良好。

2.2.4.4? 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)? 精密量取2.2.2項(xiàng)下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h和8 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD分別為0.56%，0.78%，結(jié)果表明芥子硫氰酸鹽和橙皮苷對(duì)照品均在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.5? 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)? 取同一批樣品6份，照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果芥子硫氰酸鹽對(duì)照品溶液和橙皮苷對(duì)照品溶液的RSD值分別1.2%和1.1%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.4.6? 加樣回收率實(shí)驗(yàn)? 精密量取已知芥子硫氰酸鹽和橙皮苷含量的樣品2.5mL，分別取6份，置于具塞錐形瓶中，每份均精密加入濃度為0.5180 mg/mL橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL， 濃度為0.2208 mg/mL芥子硫氰酸鹽對(duì)照品儲(chǔ)備液5mL， 照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依照上述色譜條件平行操作測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果RSD＜3.0%，說(shuō)明加樣回收率好。

2.2.5? 品的含量測(cè)定? 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液和2.2.3項(xiàng)下制備的供試品溶液各10 μL， 按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算樣品中橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量。

2.3? 干浸膏得率的測(cè)定? 精密量取正交項(xiàng)下制備的提取液每個(gè)25mL， 置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中， 水浴蒸干， 再置于105℃烘箱中恒重， 計(jì)算干浸膏得率［12］。

2.4? 正交實(shí)驗(yàn)? 考慮本次試驗(yàn)是采用水做溶劑，因此選擇加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)作為正交實(shí)驗(yàn)的考察因素，將干浸膏得率和藥液中的芥子硫氰酸鹽含量、橙皮苷含量作為考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)定，應(yīng)用L9 （34） 正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素與水平表見(jiàn)下表1。按照L9 （34） 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求， 準(zhǔn)確稱取處方量藥材 （陳皮、丁香、肉桂等）， 共9份， 編為1～9號(hào)。 先按照單因素試驗(yàn)的最佳提取條件，進(jìn)行揮發(fā)油提取，將提取好揮發(fā)油的藥材棄去藥液，留下藥渣待用，向上述藥渣中加入處方中余下藥材，按照表1因素加水進(jìn)行提取，將提取液過(guò)濾、冷卻和定容。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5? 多指標(biāo)評(píng)分方法建立? 實(shí)驗(yàn)以芥子硫氰酸鹽和橙皮苷的含量及干浸膏得率作為權(quán)重系數(shù)依據(jù)，將芥子硫氰酸鹽和橙皮苷的含量權(quán)重系數(shù)分別設(shè)置為0.3，將干浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4。綜合評(píng)分=（各組芥子硫氰酸鹽含量/芥子硫氰酸鹽最高含量×0.3×100）+（各組橙皮苷含量/橙皮苷最高含量×0.3×100）+（各組干浸膏得率/干浸膏最高得率×0.4×100）。

2.6? 方差分析結(jié)果? 由方差結(jié)果分析可知，各因素影響芥子中芥子硫氰酸鹽及陳皮中橙皮苷提取量的排序B>C>A。結(jié)果表明，加水量A對(duì)橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量和干浸膏得率影響不顯著 （P>0.05）， 但提取次數(shù)B和提取時(shí)間C對(duì)橙皮苷和芥子硫氰酸鹽的含量和干浸膏得率影響均具有顯著性 （P<0.01）。因此確定最佳提取工藝條件為A1B2C1， 即加6倍量水， 煎煮2次， 每次15min。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7? 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)? 由于正交實(shí)驗(yàn)中篩選的最佳條件為6倍加水量，提取兩次，每次15min，做1組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到本次試驗(yàn)提取時(shí)間短， 且提取次數(shù)無(wú)顯著性影響， 因此在考察提取時(shí)間1 h和1.5 h，從驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看， 提取時(shí)間為1.5 h時(shí)含量較高， 1 h次之，15min含量最少，但提取1.5 h的比提取1 h的時(shí)間成本高，且多出的有效成分有限， 為減少資源浪費(fèi)， 最終選擇的最佳提取工藝條件為：加水量6倍， 提取2次， 每次1 h。結(jié)果見(jiàn)表4。

3? 討論

在此次提取工藝研究實(shí)驗(yàn)中，因需考察兩個(gè)有效成分的含量，故選用合適的高效液相色譜條件比較重要，最初采用的流動(dòng)相條件為乙腈：0.08mol/L磷酸二氫鉀溶液（10∶90），在此條件下芥子硫氰酸鹽對(duì)照品的保留時(shí)間長(zhǎng)，且存在拖尾現(xiàn)象。后將流動(dòng)相比例調(diào)整為20∶80，保留時(shí)間合適，但也存在拖尾現(xiàn)象，因此向流動(dòng)相中加入0.3%的三乙胺溶液，拖尾現(xiàn)象也未解決。查閱資料后，因芥子硫氰酸鹽顯酸性，故向流動(dòng)相中加入0.1%的磷酸調(diào)整PH，拖尾現(xiàn)象得以解決。也曾考察不同的色譜柱［ZORBAX-SB-C18柱，Speax Bio-C18柱，Eclipse XDB-C18柱，Speax MS-C18柱］，對(duì)峰型和分離度的影響，結(jié)果顯示ZORBAX-SB-C18柱的峰型和分離度最好。研究所確定的色譜條件，可為后續(xù)含芥子和陳皮的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

從單因素結(jié)果來(lái)看，當(dāng)加水量在6倍時(shí)，所得的揮發(fā)油含量較高，表明在相同時(shí)間內(nèi)，6倍加水量的揮發(fā)油提取效率最高。此外，在浸泡時(shí)間考察中，浸泡30min即達(dá)到揮發(fā)油提取的最大值。提取時(shí)間在4～6 h之間呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢(shì)，在6h時(shí)達(dá)到峰值，但在提取時(shí)間超過(guò)5 h后，揮發(fā)油體積增長(zhǎng)緩慢，考慮到生產(chǎn)成本等因素，故選擇最佳提取時(shí)間為5 h。由上述結(jié)果可以看出，該處方中所含的揮發(fā)油易于提取，適合大生產(chǎn)。

消乳增生軟膏為我院協(xié)定處方，具有軟堅(jiān)散結(jié)，活血止痛的效果，原方為散劑，存在劑量不準(zhǔn)確，難保存且患者依從性低的缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用單因素和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式對(duì)消乳增生軟膏的提取工藝進(jìn)行研究，確定了消乳增生軟膏的最佳提取工藝，提高了有效成分含量，從驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看， 提取時(shí)間為1.5 h時(shí)含量較高， 1 h次之，15min含量最少， 但提取1.5 h的比提取1 h的時(shí)間成本高，且多出的有效成分有限， 為減少資源浪費(fèi)， 最終選擇的最佳提取工藝條件為：加水量6倍， 提取2次， 每次1 h。但本次試驗(yàn)提取方法單一，下一步打算驗(yàn)證其不同提取方法下有效成分的含量變化。

參考文獻(xiàn)

［1］

劉勝，王怡，吳春宇，等.中西醫(yī)結(jié)合臨床診療乳腺增生專家共識(shí)［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2023，38（3）：1159-1164.

［2］安徽省乳腺增生病分級(jí)診療指南（2016版）［J］.安徽醫(yī)學(xué)，2017，38（10）：1227-1232.

［3］《中成藥治療優(yōu)勢(shì)病種臨床應(yīng)用指南》標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目組.中成藥治療乳腺增生癥臨床應(yīng)用指南（2021年）［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2022，42（5）：517-524.

［4］皮鳳娟，黃娟，張慶蓮，等.硝礬洗劑的制備工藝研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2018，33（5）：638-641.

［5］井山林，郭立瑋，彭國(guó)平，等陳皮揮發(fā)油與橙皮苷提取工藝的實(shí)驗(yàn)研究［J］.基層中藥雜志，2001（1）：6-7.

［6］陳占立，孫愛(ài)平，李知遙，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選陳皮揮發(fā)油的最佳提取工藝條件［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19（2）：42-43.

［7］陳琳，梁詠倩，宋粉云，等.藥對(duì)廣藿香-陳皮的揮發(fā)油提取工藝及其化學(xué)成分的GC-MS研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，31（2）：190-197.

［8］李蕓，苗小樓，魏舒暢，等.芥子堿的提取純化及HPLC法含量測(cè)定［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2015，34（1）：48-50.

［9］唐冰雯，郭俐麟.基于HPLC法的止咳寶片中橙皮苷的含量測(cè)定［J］.山東化工，2020，49（10）：102-104.

［10］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2020年版（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：167，199.

［11］楊映霞，孟多佳，孫玉濱，等.萊菔子中芥子堿硫氰酸鹽提取工藝的優(yōu)化［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2012，7（19）：32-33.

［12］董莉，黃國(guó)付，易艷東，等.腰痛顆粒劑水提工藝的正交優(yōu)選［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28（3）：392-393.

（收稿日期：2023-02-14? 編輯：劉? 斌）